ESPECTROMETRÍA DE

EMISIÓN MOLECULAR:
ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA

Prof. Doris Nobrega

 PRINCIPIOS
 Fenómeno de Luminiscencia Molecular:
◦ Fluorescencia Fotoluminiscencia
◦ Fosforescencia
◦ Quimioluminiscencia  Reacción Química

 Emisión de energía radiante:

 Fluorescencia
 La fluorescencia es un proceso de emisión en
el cual las moléculas son excitadas por la
absorción de radiación electromagnética y al
relajarse al estado basal liberan el exceso de
energía en forma de fotones.
 Las dos principales ventajas de los métodos de
fluorescencia sobre los de absorción son:
 Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud
mayor  Los límites de detección son del orden
de partes por billón
 Mayor intervalo de respuesta lineal.

No obstante, los métodos de fluorescencia se

aplican menos que los de absorción ya que no todos
los sistemas químicos son capaces de fluorescer y
además el equipamiento necesario es mucho más
costoso que el de la espectroscopia de absorción.
 Fluorescencia
 La luz emitida tiene
menor energía y es de
mayor longitud de onda
que la radiación
absorbida o de
excitación.

 Tipos de fluorescencia:
◦ Fluorescencia de
Resonancia
emisión absorción Espectro de Absorción (A) y de Emisión
=
(B) de saxitoxina
◦ Fluorescencia por cambio
de Stokes.
emisión > absorción
 TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA
 Hay que recordar la teoría del
orbital molecular.
◦ Orbital enlazante fundamental
◦ Orbital antienlazante

 Tipos de transiciones:
◦ Estado singulete fundamental

◦ Estado singulete excitado

◦ Estado triplete excitado

 PARA
RECORDAR

El camino
más propicio
hacia el
estado
fundamental
es aquel que
minimiza el
tiempo de
vida del
estado
excitado
 MECANISMOS DE DESACTIVACIÓN DE
LA FLUORESCENCIA
 Procesos Radiantes  HAY EMISIÓN DE
RADIACIÓN Los sistemas
◦ Velocidad de emisión de la fluorescencia: fotoluminiscentes
Transición desde el nivel vibracional más bajo del incorporan
primer estado electrónico excitado a uno de los niveles
vibracionales del estado electrónico fundamental características
estructurales y
 Procesos No Radiantes  NO HAY ambientales que
EMISIÓN DE RADIACIÓN hacen que la velocidad
◦ Relajación vibracional de los procesos de
◦ Cruzamiento entre sistemas: Inversión del spin de relajación o
un electrón excitado desactivación no
 Fosforescencia radiantes se ralenticen
hasta el punto en el
◦ Conversión Interna: Procesos intermoleculares que la reacción de
 Predisociación emisión puede
 Disociación competir
cinéticamente con
◦ Conversión Externa: Interacción y transferencia de ellos
energía entre la molécula excitada y el disolvente u
otros solutos
 EFICIENCIA CUANTICA
O Rendimiento Cuántico, es la relación entre el número de moléculas
que emiten luminiscencia (fluorescencia) respecto al número total de
moléculas excitadas. Las especies altamente fluorescentes tienen una 
cercana o igual a la unidad ( = 1)
Estas relaciones se pueden expresar por la siguiente ecuación:

kf
 =
kf + ki + kci + kce + kpd + kd

donde las k son las respectivas constantes de velocidad de los diversos

procesos de desactivación.
Así:
kf = Constante de velocidad de fluorescencia
ki = Constante de velocidad de cruzamiento entre sistemas
kci = Constante de velocidad de conversión interna
kce = Constante de velocidad de conversión externa
kpd = Constante de velocidad de predisociación
kd = Constante de velocidad de disociación
 VARIABLES QUE AFECTAN LA
FLUORESCENCIA
Bifenilo
Tanto la estructura molecular como el entorno químico van (Hay rotación:
a influir en que una sustancia sea o no luminiscente Posibilidad de
rotación del
(fluorescente). enlace)
 = 0,2
La variables que influyen en que esto ocurra son:
 Estructura Química
◦ Transiciones:
◦ Se produce a  superiores a los 250 nm
◦ *  de E (mayor ) y también * n
◦ Rigidez molecular:
 Disolvente
◦ Viscosidad   viscosidad  
Fluoreno
 pH: Ionización del compuesto con sustituyentes ácidos (No hay
o básicos en sus anillos  se requiere control minucioso rotación:=Rigidez
Molecular)
 Temperatura:  temperaturas   =1,0
 La fluorescencia es uno de los mecanismos mediante las
cuales una molécula regresa a su estado basal después de
haber sido excitada por absorción de radiación. Por lo
tanto, a priori cualquier molécula capaz de absorber
radiación electromagnética sería capaz de fluorescer. No
obstante, la mayoría de las moléculas no fluorescen
porque disponen de vías no radiantes.
 La mayoría de los compuestos que contienen anillos
aromáticos proporcionan emisión fluorescente. Ciertos
compuestos carbonílicos alifáticos y alicíclicos y
estructuras de dobles enlaces conjugados también lo
hacen. Sin embargo, su número es pequeño en
comparación con el número de compuestos
fluorescentes que contienen anillos aromáticos.
 La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no
sustituidos fluorescen con una emisión fluorescente
creciente con el número de anillos y con su grado de
condensación. Los anillos heterocíclicos más sencillos
(piridina, furano, pirrol,...) no fluorescen pero las
estructuras de anillos fusionados con más de dos anillos
(quinolina, isoquinolina, indol) lo hacen con frecuencia.
 FLUORESCENCIA Y LEY DE BEER
La relación entre la concentración y la intensidad de emisión fluorescente se puede deducir a partir
de la Ley de Beer:
I/Io = 10-.b.c
Donde: I = Intensidad transmitida
Io = Intensidad de la luz incidente
 = Coeficiente de extinción molar o Absortividad Molar
b = paso de luz
c = concentración
Rendimiento cuántico de la fluorescencia:
= I/Io
La intensidad de la radiación fluorescente, F, es proporcional a la intensidad del haz de excitación
que es absorbido por el sistema, y al rendimiento cuántico.
F =  (Io – I)

Relacionando la Ley de Beer con esta última expresión:

F =  . Io (1 – 10-.b.c)
Si trabajamos con soluciones diluidas, podemos decir que la expresión anterior se convierte en:

F=K.c donde F = % de Fluorescencia

 INSTRUMENTACIÓN
a) Fuente de Radiación externa o fuente de luz de excitación: Lámpara de arco de
mercurio (fuente de líneas), lámpara de arco de xenón (fuente continua), láseres.
b) Rendijas de entrada (de excitación).
c) Monocromador primario (de excitación):
Fluorómetros  Filtros de interferencia
Espectrofluirímetros  Redes de difracción
a) Cubetas: de vidrio o sílice
b) Monocromador secundario (de emisión).
c) Rendija de salida (de emisión).
d) Detectores: Tubos fotomultiplicadores, CCD
e) Sistema de Registro.
Fuente

Monocromador
Primario

Compartimiento
Monocromador
de muestra
Secundario
Detector Amplificador y
medidor
 APLICACIONES
 Sustratos (catecolaminas, protoporfirinas,
estrógenos urinarios,…).
 Enzimas (oxidorreductasas, glucosidasa,
peroxidasa,…).
 Fármacos (fenitoína, fenobarbital,…).
 FLUOROINMUNOANÁLISIS O
INMUNOFLUORESCENCIA.
 Química forense (trazas).
 Detector de otros instrumentos como el HPLC.
 Quimioluminiscencia
 Se basa en el espectro de emisión de
una especie excitada que se forma en
el curso de una reacción química.
A + B  C* + D
C*  C + hv Fotón de
radiación
emitido

 En varios sistemas biológicos se

producen reacciones
quimioluminiscentes, en estos casos
el proceso se denomina
bioluminiscencia. Entre los
ejemplos de especies
bioluminiscentes se incluyen las
luciernagas, ciertas algas y medusas,
bacterias, protozoos y crustáceos.