Espectroscopia de Luminiscencia Molecular

Procedimientos luminiscentes moleculares: basados emisión de radiación en forma de luz producida

por moléculas que han sido previamente excitadas.

Con esta definición, las especies que absorben en

principio podrían ser luminiscentes. Porque las
moléculas que absorben tienen que tener un modo
de volver a un estado fundamental (desactivarse)
pero no es tan sencillo. no todos los procesos de
desactivación se producen emitiendo radiación de
forma de luz (solo algunos). Y en todos procesos
hay competencia.

Una molécula, átomo o una entidad química en un proceso de espectrofotometría de absorción

lleva a un estado excitado y no va a estar mucho tiempo en ese estado, tiene que relajarse. Se
puede relajar en forma de calor o emitiendo radiación lo que se denomina fotoluminiscencia

El proceso de emisión de radiación como consecuencia de la desactivación de una única molécula

se denomina genéricamente luminiscencia.

Fuentes de Excitación
Los iones, átomos o moléculas pueden excitarse a niveles superiores mediante:

- Bombardeo de electrones (energía eléctrica)

- Chispa p calor de una llama (energía termina)
- Haz de radiación electromagnética (energía radiante)

Absorción de fotones: La forma de relajarse emitiendo luz seria por el proceso de fosforescencia o
fluorescencia (estos 2 procesos son los únicos en el proceso de relajación en la emitir radiación).

Reacción química: Quimioluminiscencia | se general fotones de radiación

La fluorescencia es una técnica que es:

- Muy sensible
- Va a ser capaz de determinar compuestos a límites de detección muy baja de ppb incluso los
ppt
- Pocas aplicaciones: aunque esta característica parece mal, es una ventaja. Porque, aunque
pocas moléculas son fluorescentes la técnica cuando una molécula es fluorescente va a ser
muy selectiva.

*Hay muchas menos moléculas fosforescentes que fluorescentes

Transiciones Electrónicas Entre

Niveles de Energía Moleculares
Para los procesos luminiscentes en general, casi todos
los procesos se darían entre electrones Pi y Pi-anti
enlazantes pero que también hay transiciones de n →
Pi- anti enlazantes.
Principio de Exclusión de PAULI
Que puede existir un electrón por los 4 número
cuánticos iguales. Si tenemos 2 electrones en el
mismo nivel que están desapareado

Si tenemos en el estado fundamental: singlete

Y sube a un estado elevado (excitado):

- Puede subir en una manera desapareada y generaría

el singlete excitado

- O que se desapareé en el estado excitado: triplete

El triplete siempre va a tener una energía menor que

su singlete excitado

Diagrama de Jablonski
Es un diagrama de distribución de niveles de
energía para una molécula foto luminiscente.

- La línea horizontal que se encuentra

más abajo del todo es el estado
fundamental de la molécula que es un
singlete (S0).
- S1 y S2: representan estado de energía
singlete.
- T1: el primer nivel de energía de un
estado triplete

La energía del primer nivel de energía de un

estado triplete es menor que la energía de un
singlete correspondiente

La transición de absorción puede ocurrir del

estado fundamental a varios niveles
vibracionales del estado singlete (S1 y S2)

Las moléculas excitadas en el S1 o S2 se

pierden cualquiera energía vibracional en
exceso y se van al estado fundamental lo que
Procesos de Desactivación se conoce como relajación vibracional.

- Procesos No Radiantes: La absorción de protones ocurre mucho más

rápido de la emisión de fluorescencia
• Relajación vibracional: muy eficiente |
ocurre en 10-12 segundos o menos.
• Conversión interna: un proceso intermolecular que deja la molécula en un estado
electrónica baja sin emisión de radiación | muy eficiente | el cruce de 2 estados de la
misma multiplicidad (singlete-singlete o triplete-triplete)
• Conversión externa: consiste en interacción y transferencia de energía entre la molécula
excitada y el disolvente o otros solutos.
• Cruce entre sistemas: un cruce entre los estados electrónicos de distintos multiplicidad
(singlete-triplete) | es muy común en moléculas que contienen átomos grandes y pesados
como el yodo o bromo
- Emisión de un Fotón:
• Fluorescencia
 • Fosforescencia

Los procesos de emisión de un fotón compiten con los de más fenómenos de desactivación no
radiantes. La ruta mas favorecida al estado fundamental es la que disminuye la vida del estado
excitado. Y normalmente los procesos no radiantes son mas favorables.

La fluorescencia se suele dar a baja temperatura con disolvente que tienen una elevada viscosidad
con átomos grandes.

Desplazamiento del Stokes

Una consecuencia de la eficiencia de la relajación
vibracional es que la banda de fluorescencia para
una transición electrónica dada, se desplaza
hacia frecuencia mas bajas o longitudes de ondas
mayores (menor energía) desde la banda de
absorción

Factores que influyen

Fluorescencia
I. Tipo de Transición mas Favorable

- La fluorescencia surge de una transición entre el nivel vibracional mas bajo del primer estado
electrónico excitado a uno de los niveles vibraciones de estado electrónico fundamental
- La fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorción de radiación ultravioleta de longitud
de onda menor de 250 nm. Por tanto, rara vez se observan transiciones σ* → σ
- Para la mayoría de los compuestos fluorescentes la radiación se produce por una transición π*
→ n o π* → π
- La eficacia cuántica es mayor para transiciones π* → π (anillos aromáticos)
- Tiempo de vida inherente:
• π* → π 10-9 – 10-7 s (transición mas favorable)
• π* → n 10-7 – 10-5 s
- Variables:
• Factores estructurales
• Factores Externos

II. Según Estructura Química

- Hidrocarburos aromáticos no sustituidos:

• Son fluorescentes en disolución. La
eficacia cuántica aumenta con el
numero de anillos y con su grado de
condensación

- Heterociclos:
• Sencillos: no fluorescentes
• Condensados: fluorescentes
 - Sustitución en el anillo aromático:
• Provoca desplazamientos en la
longitud de onda de los máximos
absorción
• Afecta a la eficacia de la
fluorescencia | Donadores de
electrones → aumentan la
fluorescencia | Aceptores de
electrones → Disminuyen la
fluorescencia

- Rigidez estructural:
• La fluorescencia se ve favorecida en
moléculas que poseen estructuras
rígidas. Cuanto más rígido, menos puede moverse → más fluorescencia | Los procesos de
desactivación sean menos favorables cuanto más rígida es la estructura

III. Factores Externos

- Temperatura:
• La eficacia cuántica disminuye cuando aumenta la temperatura, ya que aumenta la
probabilidad de desactivación por conversión externa. Mas temperatura significa mas
movimiento y menos fluorescencia (hay que trabajar en condiciones con baja
temperatura)
- Disolvente:
• Viscosidad: alta viscosidad → va a aumentar la intensidad de fluorescencia y disminuir
los otros procesos de desactivación
• Polaridad: la polaridad del disolvente va a crear una capa externa alrededor de la
molécula y va a protegerla contra choques → más fluorescencia
• Puentes de hidrogeno: si hay mas puentes de hidrogeno → mas fluorescencia. Van a
estabilizar la molécula
- pH: efecto en moléculas que tienen sustituyentes ácidos o básicos. Si hay más formas
resonantes → más fluorescencia
- Presencia de oxigeno disuelto: oxidación de la molécula → nunca favorece la fluorescencia.
Tiene un segundo efecto (tampoco va a favorecer) por las características de oxigeno, va a
tener que los niveles singletes y tripletes excitados estén más cerca y por tanto estimulan el
cruce entre sistemas. Puede favorecer un proceso de fosforescencia. Duele trabar en
atmosferas inertes

Eficacia Cuántica de la Fluorescencia

- Kf: fluorescencia
Kf - Kces: cruce de sistemas
φ= - Kci: conversión interna
K f + K ces + K ci + K ce + K pd + K d - Kce: conversión externa
- Kpd: predisociación
- Kd-: disociación
La cantidad máxima de la eficacia cuántica: 1

La eficacia cuántica es mayor para transiciones π* → π

Aspectos Cuantitativos
Las moléculas fluorescentes no se comportan
igual en las concentraciones muy altas como
en las concentraciones bajas

El término “Quenching” se refiere a una transferencia de energía no radiante de una especia

excitada a otras moléculas. Requiere el contacto entre las especies excitadas y el agente que
provoca el quenching. La velocidad de quenching depende de la temperatura y la viscosidad

Instrumentación
Fluorímetro o Espectrofluorímetro
- Fuente de radiación se divide en 2 haces.
- El haz de muestra se pasa a través del
filtro o monocromador de excitación
- La fluorescencia emitida se aísla por el
monocromador de emisión antes de llegar
al fotomultiplicador de la muestra
- El haz de referencia se atenúa (por el
atenuador del haz) antes de llegar al
fotomultiplicador de referencia
- la electrónica y el sistema informático
calculan la relación entre la intensidad de
la fluorescencia y la intensidad del haz de
referencia, lo que cancela el efecto de las
fluctuaciones de la intensidad de la fuente

Características de la Técnica:

- Alta sensibilidad
- Alta selectividad
- Límites de detección de 1 – 3 ordenes de magnitud mejores que absorción molecular UV-
visible
- Gran campo de aplicación

Aplicaciones en el Ámbito Farmacéutico:

- Determinaciones fluorimétricas de especies inorgánicas

• Directas: implican la formación de un quelato fluorescente y la medición de su emisión
• Indirectas (ambos son procesos de desactivación): basado en la disminución en la emisión
de fluorescencia según el proceso de quenching de la sustancia de interés.
- Determinaciones
fluorimétricas de especies
orgánicas
• Compuestos orgánicos
• Enzimas
• Coenzimas
• Drogas (morfina, cocaína)
• Penicilina
• Esteroides
• Vitaminas