MÉTODOS LUMINISCENTES

ESPECTROSCOPÍA DE
FLUORESCENCIA,
FOSFORESCENCIA Y
QUIMIOLUMINISCENCIA
MOLECULAR
 - FLUORESCENCIA
A) FOTOLUMINISCENTES.-
- FOSFORESCENCIA

 Excitación tiene lugar por absorción de

fotones, dando una especie cuyo espectro
de emisión suministra información para el
análisis cualitativo y cuantitativo
 B) QUIMIOLUMINISCENCIA.-

 El espectro de emisión es producido por la especie

excitada que se ha formado en el cuerpo de una
Reacción Química.
A + B C P
C : Especie excitada

A + B P
P : Especie excitada

B : Oxidante fuerte : O3 , H2O2

P : Producto de oxidación del analito y no da un

espectro de emisión del analito oxidado
 En otros casos el analito no interviene directamente
en la Reacción de quimioluminiscencia y es el
efecto inhibidor del analito sobre la
quimioluminiscencia lo que sirve como parámetro
analítico.

Intensidad de Luminiscencia α [ Inorg. u Org. ]

N° de Métodos Métodos de
Fosforescencia y
de Fluorescencia Quimioluminiscencia
Ventajas de los Métodos Luminiscentes.-

A) Sensibilidad inherente a los límites de detección, que

son de 3 órdenes de magnitud menores que los
encontrados en Espectroscopía de Absorción. Los
límites de detección son del orden de ppb.
B) La Selectividad es mejor que en los métodos de
absorción.
C) Los métodos fotoluminiscentes tienen un gran intervalo
lineal de concentraciones significativamente mayor que
los encontrados en los métodos de absorción.

Desventajas de los Métodos Luminiscentes.-

 Esta limitado a compuestos inorgánicos u orgánicos

que pueden producir luminiscencia.
TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA.-
Fluorescencia Fosforescencia
 Transiciones electrónicas,  Transiciones electrónicas
no implican cambios en el implican cambios en el
spin del electrón. spin del electrón.
 La emisión de radiación  La emisión de radiación
tiene una vida media más tarda un tiempo fácilmente
corta, cesa en forma detectable después de
inmediata: < 10-5s acabada la irradiación.

“ En la mayoría de los casos, la fotoluminiscencia

(fluorescencia y fosforescencia) tiene una longitud de
onda más larga que la radiación utilizada para la
excitación”
 ESTADOS EXCITADOS QUE PRODUCEN
FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA
Fluorescencia Fosforescencia
Estado Singulete Estado Triplete

___ ___

___ ___ ___ ___

Estado Estado Estado Estado
singulete Singulete Singulete Triplete
Fundamental Excitado Fundamental Excitado

“Conserva su apareamiento “No conserva su

apareamiento en el
en el estado excitado”
estado excitado”
 La Nomenclatura de singulete, doblete y triplete deriva de
consideraciones de multiplicidad espectrales.
 El estado excitado triplete es menos energético que el
estado excitado singulete.
 Las propiedades de una molécula en el estado excitado
triplete difieren en forma significativa de las moléculas en
estado excitado singulete.
 La molécula es Paramagnética en el estado excitado
triplete; y la molécula es Diamagnética en el estado
excitado singulete.
 El tiempo de vida media del estado excitado triplete es:
10-4s. Y el tiempo de vida media del estado excitado
singulete es: 10-5-10-8s.
 La Transición singulete  triplete es poco probable, los
picos de absorción debido a este proceso son de menor
intensidad que la transición singulete  singulete.
 DIAGRAMAS DE NIVELES DE ENERGÍA PARA
LAS MOLÉCULAS FOTOLUMINISCENTES

 Fig. 9-1.- Diagramas de niveles de energía parcial para una

molécula fotoluminiscente típica.

So : Representa el estado singulete en el estado

fundamental.
S1, S2 : Representa los estados singulete excitado 1 y 2.
T1 : Representa la energía del primer estado electrónico
triplete.

Numerosos niveles de energía vibracionales están

asociados a los 4 estados electrónicos.
 Fig. 9.1.- La excitación de la molécula puede tener
lugar por absorción de dos bandas de radiación:

λ1 (S0  S1) , λ2 (S0  S2)

“La excitación de la molécula la lleva a cualquiera

de los diversos estados excitados vibracionales”
 PROCESOS DE DESACTIVACIÓN

 Una molécula excitada puede volver a su estado

fundamental por varias etapas mecanísticas:
Fluorescencia Emisión de un fotón de
Fosforescencia radiación

Relajación vibracional
Sin radiación
Conversión interna
(calor)
Conversión externa
Cruzamiento entre sistemas
Procesos de emisión de un fotón de radiación es más
rápida que los procesos sin radiación.
 RELAJACIÓN VIBRACIONAL

 Pérdida de energía sin radiación cuando se pasa de un

estado vibracional excitado superior a un estado
vibracional excitado inferior.
 El exceso de energía vibracional se pierde
inmediatamente como consecuencia de colisiones
entre las moléculas excitadas y la del disolvente en
forma de calor.
 Por la eficacia del relajamiento vibracional, la banda
fluorescente se desplaza a longitudes mayores
respecto a la banda de absorción.
 CONVERSIÓN INTERNA
 Describe procesos intermoleculares por lo que la
molécula pasa a un estado de más baja energía sin
emisión de radiación.
 Parece ser eficaz cuando 2 niveles de energía
electrónicas están suficientemente próximos para
que haya un solapamiento de los niveles de energía
vibracional.
 Esta situación se representa por los 2 estados
singuletes excitados de la Fig. 9.1
 Los mecanismos de conversión interna no están bien
definidos y no se entienden bien.
 CONVERSIÓN INTERNA
Conversión Predisociación
Interna

Predisociación Electrón se mueve desde un estado

vibracional más alto hacia un nivel
vibracional superior de un estado
electrónico más bajo, en que la energía
vibracional es lo suficiente grande como
para provocar la ruptura del enlace.

Disociación La radiación absorbida excita al electrón

de un cromoforo directamente a un nivel
vibracional suficientemente alto para
provocar la ruptura del enlace, no
incluye la conversión interna
CONVERSIÓN EXTERNA
 La desactivación de un estado electrónico excitado
puede incluir la transferencia de energía entre la
molécula excitada y el disolvente.

CRUCE ENTRE SISTEMAS

 Proceso en el cual se invierte el spin de un electrón
excitado y da como resultado un cambio en la
multiplicidad de la señal.
La probabilidad de esta transición aumenta si
niveles vibracionales se solapan.
 VARIABLES QUE AFECTAN LA
FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

a) Estructura molecular

Disolvente: átomos , O2
b) Entorno químico Temperativo
pH
Concentración
Disolvente: Presencia de átomos pesados
Presencia de O2: Paramagnética: ST
Cruce entre sistemas
…

Temperatura:  colisiones entre átomos pérdida

de energía por conversión externa.
 viscosidad del disolvente aumenta la probabilidad de
la conversión externa.

pH: Fluorescencia de compuestos aromáticos con

sustituyente dado y básicos en el anillo depende del pH.
  y I emisión son diferentes para las formas ionizadas
y no ionizadas.

“Cuando mayor es el número de formas resonantes

mayor es la estabilidad del primer estado excitado; la
consecuencia es una fluorescencia en la región UV.”
“La influencia del pH en la fluorescencia se ha
utilizado para detectar puntos finales en valoraciones
ácido-base.”
 EFECTO DEL OXÍGENO DISUELTO

 Presencia de O2 disuelto reduce la intensidad de

fluorescencia de una disolución, esto puede ser el
resultado de una oxidación inducida
fotoquímicamente de las especies fluorescentes.
El O2 como cualquier especie paramagnética
atenúa la fluorescencia el cual provoca
cruzamiento entre sistemas y conversiones de las
moléculas excitadas al estado triplete.
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN EN
LA INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA

(A) F = K’ (Po – P)

F : potencia de la radiación fluorescente

Po : potencia del haz incidente sobre la solución
P : potencia del haz incidente después de atravesar

la muestra.
K’ : constante que depende de la eficacia cuantica
del proceso de fluorescencia.
 …
 Relacionando F con la concentración C de la
partícula fluorescente, escribimos la ley de Beer de
la forma:

P  = absortividad molar
(B)  10 -bc
po b = trayecto óptico
 b c = Absorbancia (A)

(C) F = K’Po (1 – 10 bc)

El término exponencial de la ecuación (C) puede
desarrollarse como una serie de Maclaurin.
 …

F  K' Po 2.303 ε b c -
2.303 ε b c 
2

2.303 εbc 
(D) 
 2 ! 3 ! 

 Siempre que 2.303  b c <0.05, los términos

siguientes se hacen despreciables frente al
primero, en estas condiciones, el error relativo
máximo en la ecuación (D) como consecuencia de
la simplificación es 2.5%. Así:
F = K’Po 2.303  b c
o a Pp constante
(E) F = KC
 FACTORES RESPONSABLES DE LA
PÉRDIDA DE LINEALIDAD (F v/s C)

A) Altas concentraciones

B) Autoatenuación: transferencia de energía sin

radiación producto de colisiones moleculares.

C) Autoabsorción:
cuando la  de la emisión se
superpone a la  de onda de
absorción .

A A* + A A + A*
 RENDIMIENTO CUANTICO
(EFICACIA CUANTICA)

# de moléculas que emiten luminiscencia

φ 
# de moléculas excitadas
Kf
φ 
K f  K i  K CE  K Cl  K pd  K d

 K : constante de velocidad relativa

 Kf : constante de veloc. relat. de fluorescencia
 Ki : const.de veloc.relat. de cruzamiento entre
 Kc : const.de veloc.relat. de Co
 KCI : const.de veloc.relat.de conversión interna
: const.de veloc.relat.de predisociación
Kf , Kpd, Kd dependen de la estructura química.
 TIPOS DE TRANSICIÓN EN
FLUORESCENCIA
 La fluorescencia es el resultado de la absorción de
radiación ultravioleta de  menores a 250 nms., ya que tal
radiación es suficiente como para producir desactivación
de los estados excitados por predisociación o disociación.
Transiciones responsables: * 
* n
Rara vez se observa fluorescencia en transiciones
x 
EFICACIA CUANTICA Y TIPO DE TRANSICIÓN
Eficacia cuantica es mayor para transiciones x 
que x n
 EFICACIA CUANTICA: x 
 Se puede explicar por lo siguiente:
 de *  es 100 a 1,000 veces > x n
Tiempo de vida media *  es más corto 10-7 a 10-9 S
comparado con * n que es 10-5 a 10-7S.
Kf de *  > Kf de * n
Ki de *  < Ki * n

Poca probabilidad que ocurra S T

 FLUORESCENCIA Y
ESTRUCTURA
 La fluorescencia más intensa y la más útil es la que
presentan los compuestos que contienen grupos
funcionales aromáticos con transiciones  x
de baja energía.
 Estructuras alifáticas y alicíclicas de carbonilo o
estructuras con dobles enlaces muy conjugados,
pueden también presentar fluorescencia, pero el
número es pequeño comparado con el número en
sistemas aromáticos.
 La mayoría de hidrocarburos aromáticos no
sustituidos son fluorescentes en solución, la eficacia
cuantica normalmente aumenta con el número de
anillos y con su grado de condensación.
 Compuestos heterocíclicos sencillos, como la
peridina, el furano, el tiofeno y el fenol, no presentan
fluorescencia:

 Por otro lado estructuras fusionadas las presentan

normalmente.
 Compuestos heterocíclicos con nitrógeno, la
transición electrónica de más baja energía se cree
que implica un sistema n * que rápidamente se
transforma en un estado triplete e impide la
fluorescencia.
 La fusión de anillos bencénicos con anillos
heterocíclicos origina un aumento de la absortividad
molar del pico de absorción. El tiempo de vida de un
estado excitado es más corto en estas estructuras,
así se observa fluorescencia en compuestos como la
quinoleina, la isoquinoleina y el indol.
 La sustitución en el anillo bencénico provoca
desplazamientos en la longitud de onda de los
máximos de absorción y los correspondientes
cambios en los picos fluorescentes.

 La sustitución afecta frecuentemente a la

eficacia de la fluorescencia, algunos de estos
efectos se ilustran con los datos de derivados
del bencénico de la Tabla N° 1.
EFECTO DE LA SUSTITUCIÓN EN LA FLUORESCENCIA
DEL BENCENO*
Longitud de onda de la Intensidad relativa de
Compuesto Fórmula
fluorescencia, nm la fluorescencia
Benceno C6H6 270 – 310 10
Tolueno C6H5CH3 270 – 320 17
Propilbenceno C6H5C3H7 270 – 320 17
Fluorobenceno C6H5F 270 – 320 10
Clorobenceno C6H5Cl 275 – 345 7
Bromobenceno C6H5Br 290 – 380 5
Iodobenceno C6H5I - 0
Fenol C6H5OH 285 – 365 18
Ion fenolato C6H5O- 310 – 400 10
Anisol C6H5OCH3 285 – 345 20
Anilina C6H5NH2 310 – 405 20
Ion anilinio C6H5 NH3+ - 0
Acido C6H5COOH 310 – 390 3
benzoico
Benzonitrilo C6H5CN 280 – 360 20
Nitrobenceno C6H5NO2 - 0
 La influencia de la sustitución de halógenos es
sorprendente, la disminución de la fluorescencia
con el aumento del número atómico del
halógeno se piensa que es debida en parte al
efecto del átomo pesado, el cual aumenta la
probabilidad para el cruzamiento entre sistemas
hacia el estado triplete.
 La sustitución de un ácido carboxílico o de un
grupo carbonilo en un anillo aromático
generalmente inhibe la fluorescencia, en estos
compuestos la energía de transición n * es
menor que la transición  *,

Por consiguiente el rendimiento de la

fluorescencia es normalmente menor para la
transición n *-
 EFECTO DE LA RIGIDEZ
ESTRUCTURAL
 Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está
particularmente favorecida en moléculas que poseen
estructuras rígidas. Ejemplo:

 La diferencia en el comportamiento parece deberse al

aumento de rigidez proporcionada por el grupo
metileno puente del fluoreno.
 El aumento de la fluorescencia de ciertos quelantes
orgánicos cuando están formando un complejo con un
ión metálico. Ejemplo, la intensa fluorescencia de la 8-
hidroxiquinoleina es mucho menor que la de su
complejo de zinc:

 La parte no rígida de la molécula puede experimentar

vibraciones de baja frecuencia respecto a sus otras
partes y tales movimientos producen indudablemente
ciertas pérdidas de energía en forma de calor.