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TECNICAS DE BM.
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ALO27
Biología Molecular
2º Grado en Farmacia
Facultad de Farmacia
Universidad Complutense de Madrid
Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
TEMA 24 - EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS. ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCIÓN.
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos tienen características comunes que permiten el desarrollo de un método de separación
específico. Estos métodos deben ser completamente biocompatibles y suficientemente potentes para permitir el
aislamiento de la molécula deseada de una mezcla compleja con contaminantes.
1) FASE DE LISIS
La fase de lisis se lleva a cabo en una disolución tamponada, que contiene una serie de elementos esenciales:
- Inhibidores de nucleasas (EDTA): agente complejante de iones divalentes (especialmente Mg2+) necesarios
para que las nucleasas desarrollen su actividad:
o Endonucleasas: actúan en posiciones internas del ácido nucleico.
o Exonucleasas: actúan en los extremos de la molécula.
- Detergentes iónicos (SDS, dodecil sulfato sódico): responsable de la ruptura de la membrana.
- Proteasas (Proteinasa K): si se trata de DNA genómico hay que tener en cuenta que está unido a proteínas
que se deben separar.
Si se trata de extracciones de RNA, como este es menos estable que el DNA, hay que tomar precauciones
especiales para evitar los procesos degradativos. Se añaden inhibidores específicos de las RNAasas como
- Clorhidrato de Guanidina: agente desnaturalizante que contribuye a la inactivación de RNasas

- ß-Mercapto etanol: agente reductor que promueve la desnaturalización del enzima
-
2) FASE DE ELIMINACIÓN DE PROTEASAS
El método clásico para eliminar las proteínas interferentes consiste en realizar extracciones sucesivas mediante
centrifugación con disolventes orgánicos, siendo los más utilizados las mezclas fenol y cloroformo. El cloroformo se
mezcla con alcohol isoamílico. Si se utiliza aislado tiene efecto disolvente sobre el mRNA con largas colas de PoliA.
Otro método menos utilizado consiste en utilizar una columna con una resina que separa las proteínas.
3) FASE DE CONCENTRACIÓN O PRECIPITACIÓN
Precipitación de ácidos nucleicos en una solución acuosa y en frio, en presencia de cationes monovalentes y
alcoholes: etanol e isopropano normalmente.
En el caso de que se extraiga un RNAm hay que añadir una cuarta etapa. La caracterización de un gen se puede
llevar a cabo en RBA o DNA. El DNa presenta la ventaja de que es más estable, pero el RNA presenta la ventaja de
que carece de intrones, solo contienen las secuencias del DNA codificantes (en eucariotas los intrones pueden llegar
a tener grandes tamaños). Además el RNA se puede convertir a DNA mediante la trasncripción inversa. La enzima
que cataliza este proceso de la transcriptasa inversa, presente en virus. El DNA obtenido está libre de intrones y es
más fácil de caracterizar.
De todo el ARN el ARNm es solo un 5%. Para aislarlo se emplea una cromatografía de afinidad. Se emplea una
columna rellena de una resina que tenga un ligando que se una específicamente con el RNAm. Como el ARNm
presenta colas de poliA, el ligando específico van a ser poliuridilatos. Al pasar la mezcla por la columna solo queda
unido el mRNA a estos ligandos en el interior de la columna. Cambiando la fuerza iónica del tampón, se eliminan las
uniones por puentes de hidrógeno, obteniendo el mRNA aislado.
VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y PUREZA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La cuantificación y valoración se lleva a cabo mediante técnicas espectrométricas. Se mide la absorbancia a 260nm
(longitud de onda de máxima absorción de ácidos nucleicos) y a 280nm (para proteínas). Conocida la absorbancia se
determina la concentración, comparando los resultados obtenidos con las relaciones obtenidas experimentalmente.
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- Doble cadena: 1DO = 50μg/ml Para determinar la pureza se calcular la
- Cadena sencilla: 1DO = 40μg/ml relación 𝐷𝑂260/𝐷𝑂280; si toma un valor entre
- Oligonucleótidos: 1DO = 30-20μg/ml (en función del tamaño el valor será 1,8 y 2 se considera una pureza buena.
distinto).
FRACCIONAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
~ CROMATOGRAFÍA
- Cromatografía de intercambio iónico: para preparar DNA de alta pureza. Columnas con resinas de
intercambio aniónico (cargas positivas) retienen el DNA (cargado negativamente) dejando pasar otras
moléculas (proteínas).
- Cromatografía de afinidad: para fraccionar o separar RNA’s de distinto tamaño, estructura y función. Ej.:
purificar mRNA a partir de RNA celular total.
~ ELECTROFORESIS
La electroforesis es un método de análisis que se emplea en casi todas las técnicas de biología molecular. El soporte
sobre el que se lleva puede ser un gel de agarosa o de poliacrilamida:
- Agarosa: polímero fácil de preparar, no tóxico y poco costoso.

- Poliacrilamida: mucho más caro, tóxico cuando está en polvo, pero presenta la ventaja de que el poder de
resolución es mayor. Si el tamaño de las moléculas es muy diferente se puede utilizar la agarosa, pero si el
tamaño es similar se utiliza la poliacrilamida.
Algunos de los factores que influyen en la electroforesis son: la concentración del soporte, el tamaño de las
moléculas a separar, la densidad de cargas, la conformación de las moléculas. En función de la concentración del
polímero los huecos tendrán diferente tamaño. Las moléculas de tamaño pequeño atravesaran fácilmente el gel y
quedan más lejos del origen; las de mayor tamaño quedarán más retenidas.
Para visualizar el resultado de la electroforesis se utiliza un agente intercalante que se dispone entre los pares de
bases del DNA, de estructura planar, el bromuro de etidio. Es una sustancia fluorescente cuando se expone a la luz
ultravioleta.
~ ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Son enzimas que forman parte del sistema de defensa de las bacterias y con actividad endonucleasa que cortan los
enlaces fosfodiéster del DNA, a nivel de la doble cadena y reconociendo en la misma secuencia específica. Pueden
dar lugar a extremos planos o lineales (al mismo nivel en la doble hélice) o no lineales (región en forma de
monohebra). Se emplean en mapas de restricción, DNA recombinante, técnicas de clonaje, polimorfismo en la
longitud de fragmentos de restricción para determinar mutaciones humanas…
TEMA 25 – TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE

ÁCIDOS NUCLEICOS
TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN
Las técnicas de secuenciación sirven para conocer la secuencia de nucleótidos del DNA e indirectamente de mRNA:
se pasa a DNA complementario (cDNA) con un cebador de PoliT por medio de transcripción reversa
 MÉTODO DE SANGER
Es un método que se utiliza para la secuenciación del DNA, es decir, conocer la secuencia de nucleótidos. Se basa
en el empleo de desoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo (-OH) en el carbono 3’, de manera que cuando
uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de DNA en crecimiento, está cadena no puede continuar
elongándose.
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Biología Molecular
Banco de apuntes de la
En el proceso se utiliza una DNA polimerasa que utiliza copias del DNA problema. Para ello se necesita que el DNA
esté en forma de monohebra, totalmente desnaturalizado para que pueda ser utilizado como molde. Además, la DNA
polimerasa necesita un cebador de RNA, que ha sido diseñado previamente con una secuencia previa
conocida. En la reacción de utilizan como sustratos: el sustrato normal (los desoxinuclótidos trifosfato)
y además un sutrato modificado (didesoxinucleótidos trifosfato – de ahí deriva el nombre del método).
La DNA-polimerasa tiene la misma afinidad para los dos tipos de nucléotidos, por lo que, para
asegurarse, es importante que la cantidad de nucleótidos modificados sea mayor.
Se disponen 4 tubos con los mismos reactivos, pero con un didesoxinucleótido distinto, que
conocemos cual es (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP). De este modo se consigue que en el tubo 1 se
pare la síntesis en Adenina, en el tubo 2 en Guanina, en el tubo 3 en Citosina y en el tubo 4 en
Timina.
A continuación, se prepara un gel de agarosa donde se realiza una electroforesis. Se disponen 4

pocillos, en cada uno de los cuales vertimos la muestra de cada uno de los tubos. Cuando se
comiencen a separar los fragmentos de cada tubo quedan los más largos arriba, ya que migran menos, y los más
cortos abajo por ser los que más migran. Finalmente, para secuenciar no hay más que comenzar a nombrar desde
abajo hacia arriba siendo el fragmento más pequeño el primer nucleótido de la hebra de DNA, el extremo 5´.
La secuenciación también puede realizarse de forma automática. Para ello se marcan los didesoxi cada uno de un
color de forma radiactiva o con fluorocromos. Se obtiene con este método una gráfica con distintos colores donde
cada color indica cual es el último nucleótido 3´ de ese fragmento que es el didesoxi marcado.
 SECUENCIACIÓN DEL RNA
Es más difícil que la del DNA ya que e RNA tiene una menor estabilidad. Se puede deducir la secuencia de un RNA
sintetizando su cDNA (mediante la transcriptasa inversa) y secuenciando éste por el Método de Sanger.
MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN
Las técnicas basadas en procesos de hibridación no dan la secuencia de DNA, sino que detectan la presencia de una
determinada molécula y permiten hacer una cuantificación relativa de esa secuencia de DNA.
La hibridación consiste en la formación de dúplex de ácidos nucleicos de distinto origen cada hebra que se
encuentran formando dobles cadenas: DNA/RNA,
DNA/DNA, RNA/RNA que tienen secuencias complementarias y se unen formando híbridos.
La hibridación está basada en el proceso de la renaturalización: se parte de ácidos nucleicos desnaturalizados que
no presenten ningún tipo de lazo y en forma de cadena sencilla. La renaturalización implica el apareamiento total o
parcial, ya que cuanto mayor sea la longitud de las secuencias complementarias mayor será la estabilidad el hibrido.
Para saber las secuencias que se encuentran hibridadas se utilizan sondas marcadas de RNA o DNA.
El rigor en la hibridación es que cuando hay interacción entre cadenas complementarias debe ser fuerte, específica y
altamente complementaria. De esta manera se asegura que la sonda permanezca unida a la secuencia de la cual es
complementaria. El rigor puede variarse:
- Longitud y concentración de las cadenas: si se busca un fragmento grande de DNA o RNA es preferible
utilizar una sonda lo más grande posible para que haya menos probabilidades de que sea complementaria a
más de una secuencia en la cadena.
- Composición de bases: es preferible que haya mayor cantidad de C y G para que las uniones sean más
fuertes.
- Temperatura: se puede comprobar mediante un aumento de temperatura cuán complementarias son las
cadenas, es decir, si se aumenta un poco la temperatura y las cadenas se separan quiere decir que no son
altamente complementarias mientras que si permanecen unidas es que hay una gran afinidad entre ellas ya
que presentan más resistencia a separarse.
- Presencia de cationes.
- Tiempo de hibridación.
- Presencia de agentes desnaturalizantes que ejercen un efecto similar al de la temperatura.
Las sondas son fragmentos de DNA o RNA, generado por técnicas de Biología Molecular o por Síntesis Química.
Pueden ser de dos tipos:
- Sondas largas de cadena simple (DNA o RNA): tienen alte sensibilidad en la detección de cadenas
sencillas.
- Oligonucleótidos: son muy sensibles y la señal puede ser incrementada por el uso de un cocktail de sondas
que flanquearán en regiones distintas.
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Hay dos tipos de marcaje de sonda: Indicadores + proteína: Biotina
+ avidina
- Directos: se realiza uniendo una sonda a un marcador a
través de un enlace covalente y permite que la señal se
detecte de manera rápida y directa.
- Indirectos: se realiza con un marcador no detectable que
hace las funciones de un indicador y es el que está en
contacto directo con la sonda. Luego, el indicador se une
al complejo formado por una proteína unida a un
marcador.
Tipos de marcadores:
- Radiactivos (sondas isotópicas): los nucleótidos se marcan con 35p y se detecta la union de la sonda con
el DNA por una autorradiografía.
- No radiactivos (sondas no isotópicas): fluorocromos, enzimas… se detecta por fluorimetría o
quimioluminiscencia entre otros.
 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
- En filtro: el híbrido se forma sobre un soporte sólido, como una membrana de nitrocelulosa.
- En solución: el híbrido se forma en una solución acuosa.
~ EN FILTRO
 Southern-blot (DNA)
Es un método muy importante en la caracterización del DNA genómico, aunque también se puede utilizar con cDNA,
pero no es lo más frecuente. Además, permite llevar a cabo una cuantificación relativa. Es decir, permite la detección
de secuencias de una molécula de DNA (detección de un gen en el genoma).
1. Habitualmente se aplica a DNA genómico. Estas moléculas poseen un tamaño elevado, por lo que se deben
fragmentar llevando a cabo una digestión con endonucleasas de restricción (que reconocen secuencias
específicas).
2. Una vez que se dispone de los fragmentos, se separan en geles de agarosa por electroforesis.
3. Para llevar a cabo las técnicas de hibridación el ADN tiene que estar en forma de monohebra. Por ello se
lleva a cabo la desnaturalización de los fragmentos separados en el propio gel, sometiéndolos a la presencia
de un desnaturalizante, como una solución alcalina.
4. Se realiza entonces la transferencia de los fragmentos desnaturalizados a un soporte sólido, membranas de
nylon o nitrocelulosa. Esto permite manipular la muestra con mayor facilidad, porque el gel se rompe
fácilmente. Se realiza por capilaridad o para acelerar el proceso se puede emplear un equipo de vacío.
5. Fijación de los fragmentos de DNA a la membrana, empleando calor o luz UV. No se sabe porque se produce
esta fijación, pero se forman enlaces covalentes.
6. Posteriormente se realiza la hibridación utilizando una sonda previamente marcada (con digoxigenina o con
un marcador radiactivo). Si hay una secuencia complementaria con la sonda se formará el híbrido y podrá ser
detectado. La complementariedad no tiene que ser absolutamente perfecta, pero intentamos que sea los más
específico posible. Para ello utilizados agentes desnaturalizantes como la temperatura o la fuerza iónica. Lo
más útil es modificar la temperatura, si la especificidad es muy alta se puede aumentar la temperatura y
evitar la formación de hibridaciones inespecíficas.
7. La detección se puede llevar a cabo de distintas formas según cual sea el marcaje. Si se marca con una
sustancia radiactiva se utiliza una autoradiografía; si se marca con digoxigenina se añade el anticuerpo
complementario, marcado con un enzima. Se añade el sustrato de ese enzima y se produce la reacción.
 RFLP: polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción
Técnica dirigida a la detección de mutaciones responsables de enfermedades humanas. El fundamento se basa en la

creación o eliminación de sitios de restricción para determinadas endonucleasas específicas, por efecto de
mutaciones en el DNA.
A partir del DNA de un individuo no afectado, se realiza una digestión del mismo con enzimas de restricción
consiguiendo fragmentos que se separan por electroforesis, obteniendo así un patrón. Se lleva a cabo el mismo
procedimiento con el DNA del individuo que se cree que padece la mutación. La limitación de esta técnica es que el
sitio de la mutación tiene con coincidir con el punto donde actúa el enzima de restricción. Se obtiene un patrón
diferente, la mutación puede lugar a que el número de fragmentos sea menor porque se ha perdido un sitio de
restricción o que el número de fragmentos aumente porque se cree un sitio de restricción por la mutación.
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Para solventar este problema se acopla a una PCR. Por ejemplo, se utiliza para detectar la anemia falciforme.
Además permite conocer si un individuo es homocigótico o heterocigótico para esa mutación.
 Northern-blot
Se trata de una técnica equivalente al Southern-blot pero referida a RNA. Permite determinar la concentración de un
RNAm específico en un momento, que puede estar relacionado con el nivel de expresión génica aunque no tienen
porque coincidir exactamente. Las principales diferencias son con el southern-blot son:
- No se utilizan endonucleasas de restricción (ya que estas son específicas del DNA y el tamaño de las
moléculas es menor).
- Es necesario tener en cuenta la facilidad de degradación de los RNAs, por ello, antes de hacer la
transferencia se comprueba la integridad de las moléculas de RNA. Esto se hace mediante bromuro de etidio,
que permite la visualización de los RNA más abundantes (rRNA, los de mayor tamaño 28S se ven con el
doble de intensidad que los 18S). Si estuvieran en degradación no habría bandas nítidas. Dicho agente no
posee tal especificidad para detectar los mRNA. Asumimos que si el rRNA no se ha degradado el mRNA
tampoco. Por tanto,
- También hay que tener en cuenta su a tendencia a formar estructuras secundarias. Por ello se añaden
agentes desnaturalizantes a los geles de agarosa como formamida, no se pueden aplicar álcalis ya que se
degradaría el RNA.
 Dot -blot
Se emplea fundamentalmente para realizar un “screening” de un número elevado de muestras al mismo tiempo, sin
llevar a cabo una electroforesis. La muestra se fija directamente sin separar sobre un papel de nitrocelulosa. La
ventaja de este método es que requiere un menor tratamiento de la muestra, pero la desventaja es que son
frecuentes las hibridaciones inespecíficas.
 Chips de DNA
El fin con el que se utiliza normalmente es para conocer el nivel de expresión génica, auqneu también se podría
utilizar para determinar el grado de metilación o incluso para secuenciación del DNA. Nos permite investigar de
manera simultánea un nº elevado de genes (más de 10.000 o 20.000 secuencias distintas) que se analizan sobre
micromatrices.
En las micromatrices se fijan secuencias oligonucleotídicas que representan un número muy elevado de genes que
se pueden estudiar de manera simultánea, hay más de una secuencia por cada gen. En este caso la sonda no va
marcada, sino que marcamos la molécula de DNA que vamos a caracterizar. A partir del mRNA maduro se realiza
una reacción de transcripción reversa donde se incorporan nucleótidos marcados con fluorocromos para sintetizar
una molécula de cDNA (podemos incluso marcar cada cDNA con un fluorocromo distinto). Finalmente se lleva a cabo
la reacción de hibridación, los híbridos se podrán visualizar por fluorescencia.
Uno de los usos es estudiar la expresión diferencial de los genes en los distintos tejidos o comparar la expresión de
genes en células tumorales y células normales. Se podrá observar que genes se expresan en ambos tipos de células
y cuales en solo una de ellas.
 Hibridación “in situ”
Persiguen identificar un ácido nucleico en el interior celular. Se necesitará algún mecanismo que permita introducir la
sonda en el tejido. Se utilizan cortes de tejidos sometidos a tratamientos de desproteinizacion y permeabilización de
membrana, de modo que la sonda pueda acceder a las células, formándose el híbrido en el interior de las mismas.
~ EN SOLUCIÓN
 PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
También se conoce como clonaje acelular. Consiste en la síntesis

enzimática in vitro de un elevado número de copias de una
determinada secuencia de DNA. En un principio, se trata de un
método preparativo, así se incrementa la cantidad de material
necesario para la experimentación.
Esta técnica consta de 3 etapas, cada una de las cuales se lleva a
cabo a una temperatura distinta. Por ello, la reacción se lleva a
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cabo en un termociclador que facilita que estos cambios de temperatura se lleven a cabo de forma rápida (evitando la
aparición de hibridaciones inespecíficas de los cebadores).
1. Desnaturalización: Se realiza a temperaturas muy altas, de unos 90-95 ºC.

2. Hibridación: etapa en la que los cebadores deben unirse a los extremos de la secuencia de interés,
delimitándola. Siempre se unen enfrentados por el extremo3’. La temperatura empleada en esta fase
depende de la secuencia exacta de los cebadores empleados, aunque se aproxima a los 55ºC.
3. Síntesis o elongación: la DNA polimerasa sintetiza copias de la cadena de interés a partir de los cebadores.
La temperatura adecuada es de 72ºC.
Estas etapas se repiten en ciclos, normalmente 35-40 ciclos. Con ello se consigue una amplificación exponencial de
la secuencia problema. trabajando en condiciones de saturación.
Los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción son:
- DNA problema (molde).

- Desoxinucleótidos, sustratos de la DNA pol.
- Iones divalentes (normalmente MgCl2).
- Un tampón que proporcione el pH adecuado
- DNApol que sintetiza las copias de la molécula problema a partir de los cebadores. Tiene que ser resistente
a las altas temperaturas a las que se lleva a cabo la etapa de la desnaturalización, es decir,
termorresistentes. Al principio del desarrollo de la PCR se utilizaba una enzima en cada ciclo de reacción.
Posteriormente se pasó a utilizar enzimas termorresistentes, pero que representan un problema porque
carecen de actividad correctora de pruebas. Por ejemplo, si se quiere estudiar una determinada muestra de
DNA en busca de una mutación, pueden aparecer en los resultados mutaciones que se deban a fallos de la
DNA pol, sobre todo cuando el error se cometa en los primeros ciclos y se arrastre en todos los ciclos
posteriores. Por ello, cualquier análisis con PCR debe repetirse por triplicado al menos. Una de las más
utilizadas es Taq DNApol (procedente de Termofillus aquaticus), pero también Vent DNApol (Termococus
litoralis), con menor tasa de error.
- 2 cebadores de unos 20 nucleótidos que hibridan los extremos de la secuencia de interés que se pretende
amplificar. Los oligonucleótidos flanquean la región objeto de amplificación.
La etapa inicial es más larga para garantizar que todo el DNA genómico esté desnaturalizado. La etapa final se
prolonga para que la enzima pueda terminar la elongación completa. La finalización de la PCR se realiza a 4ºC, de tal
manera que los tubos quedan como si estuvieran en la nevera.
- Empleo en criminalística o análisis de paternidad: permite obtener un número elevado de copias de una
determinada secuencia de DNA. En este tipo de análisis se suelen utilizar las secuencias de los
microsatélites que varían de unos individuos a otros, son marcadores de individualidad.
- RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa acoplada a la transcripción reversa): Se utiliza para

llevar a cabo estudios de expresión. Permite amplificar por PCR secuencias de cDNA que han sido obtenidas
a partir de mRNA mediante una transcriptasa reversa. Muchas enfermedades pueden identificarse de esta
forma, como la leucemia mieloide crónica, donde ocurre una translocacion cromosómica que da lugar a un
gen de fusión de mayor tamaño que los genes aislados
- PCR cuantitativa a tiempo real: La cantidad de material amplificado

viene determinada por la cantidad de material inicial. Pero el único
momento en el que se puede cuantificar la cantidad de DNA
amplificado es en la fase de amplificación exponencial. Al llegar a los
40 ciclos aproxiamadamente ya no se puede cuantificar, pues el
agotamiento de alguno de los reactivos hace que no varíe el número
de copias. Si el objetivo es cuantificar el DNA hay que trabajar a un
ciclo que corresponda a la fase exponencial. Permite llevar a cabo
estudios de comparación de niveles de expresión génica en diferentes
células o tejidos. Para detectar el DNA utilizamos sondas o agentes intercalantes que van marcados con un
fluorocromo. Normalmente se comparan los genes que se están estudiando con un gen que codifique para
productos centrales del metabolismo y que tenga el mismo nivel de expresión en ambos tejidos. Se utiliza un
termociclador más complejo.
- PCR-RFLP: En la RFLP la mutación buscada debía coincidir con el sitio de restricción, pero acoplado a PCR
se pueden crear o eliminar sitios de restricción de endonucleasas específicas, diseñando cebadores
adecuados que introduzcan una pequeña variación.
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TEMA 26 – TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE
CLONACIÓN DEL DNA
El término clonar se refiere a la obtención de múltiples copias de DNA “in vivo”, es decir, en una célula aprovechando
su maquinaria enzimática que facilita la replicación. La utilidad primaria sería la obtención de múltiples copias de un
fragmento de DNA en un sistema celular. Las técnicas de clonaje nos permiten:
- Estudiar la estructura de genes.
- Estudiar la funcionalidad de los productos codificados por estos genes.
- Análisis y estudios de expresión génica.
- Obtener productos concretos útiles en terapéutica.
- Generar modelos animales que nos permiten estudiar mecanismos generales de enfermedades.
- Empleo
- del DNA como molécula medicamentosa: terapia génica.
Dependiendo cual sea nuestro objetico el sistema de clonaje variará, pudiendo emplear tanto células procariotas (las
cuales presentan ciertas limitaciones) o células eucariotas. Una de las limitaciones de células procariotas es que
carecen de la maquinaria cotranscripcional y postranscripcional. Son útiles para clonar u gen con el objetivo de
estudiar su estructura a partir del cDNA, pero no para estudiar el genoma o para obtener un determinado producto.
Dentro de las células eucariotas se pueden utilizar células somáticas o germinales, siendo estas segundas las más
eficaces.
Las principales etapas son:
1. Preparación del DNA problema que se quiere clonar
Podemos partir de cDNA o DNA genómico. El problema que presenta el DNA genómico es que presenta intrones; si
queremos estudiar la función de una proteína codificada por un determinado gen y partimos de DNA genómico no
podemos utilizar un célula procariota, porque esta carece de la maquinaria necesaria para llevar a cabo las
modificaciones postranscripcionales y no podrán eliminar los intrones. En estos casos debemos partir de cDNA y
además la proteína para la que codifique ese gen debe de sufrir pocas modificaciones postraduccionales, porque las
células procariotas también carecen de los mecanismos necesarios para llevarlas a cabo. Un ejemplo de una
proteína que se pueda sintetizar en procariotas es la insulina.
2. Elección del vector
El vector debe de ser una molécula que sea capaz de replicarse en el sistema celular elegido. El DNA que se
pretende clonar se unirá con el vector, obteniendo una cadena de DNA recombinante. En función del tamaño de la
molécula problema elegimos el vector, que variará en su complejidad:
- Los plásmidos son moléculas sencillas muy fáciles de manipular, con capacidad de autoreplicarse, pero sólo
admiten insertos de tamaño pequeño. Bacteriófagos: son virus que infectan la célula bacteriana.
- Virus.
- Cósmidos (quimeras): vector con características de plásmido y bacteriófagos, obtenidos de manera artificial
y que admiten DNA de mayor tamaño.
- Cromosomas atificiales de bacterias o de levaduras.
Existen dos tipos de vectores según la finalidad:
- Vectores de clonación: se emplean cuando el objetivo es la obtención de copias de DNA in vivo.

- Vectores de expresión: se emplean cuando el objetivo es conseguir que se exprese la molécula problema.
Se diferencian en que siempre contienen un promotor potente, que debe ser una secuencia manipulable,
para controlar la expresión del gen.
3. Unión del DNA al vector
Para poder unir el DNA al vector hay que generar extremos compatibles entre las 2 moléculas. Muchos de estos
vectores poseen estructura circular, por lo que hay que linealizarlo mediante enconucleasas de restricción con un
solo punto de corte. Para ellos debemos conocer el mapa de restricción del vector y los extremos generados tras la
digestión. Se pueden generar extremos protuberantes, en cuyo caso el DNA problema tendrá que tener los mismos
extremos, o planos, entonces solo será necesaria la unión mediante una ligasa.
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Si el vector tiene los sitios de restricción adecuados para unirse al inserto, se usa directamente. Si no tiene los sitios
de restricción adecuados complementarios, se introduce en la secuencia de los vectores un policonector, que es una
secuencia de DNA que contiene dianas para diferentes enzimas de restricción. También se puede utilizar linkers o
adaptadores, que son secuencias de oligonucleotídos que ayudan a obtener extremos compatibles.
La reacción de unión la lleva a cabo una DNA ligasa y permite obtener el DNA recombinante. Pero el éxito de esta
etapa no es del 100% porque la DNA ligasa puede dar lugar a que se formen productos que no son los que
buscábamos.
4. Introducción del DNA recombinante en el sistema celular
Este proceso en función del tipo de célula que se utilice se denomina:
- Transfromación: transferencia del DNA recombinante a células procariotas.

- Transfección: transferencia del DNA recombinante a células eucariotas.
De menor a mayor eficiencia, los métodos para introducir DNA recombinante son:
- Tratamiento con soluciones de fosfato cálcico u otros compuestos que hacen que el DNA precipite y
forme agregados. Es barato pero de baja eficacia.
- Lipofección: hacer llegar el DNA recombinante mediante liposomas, vesículas de naturaleza lipídica en cuyo
interior incorporamos el DNA recombinante. Se fusionan con la membrana de las células anfitrionas haciendo
llegar el DNA recombinante a la células.
- Electroporación: consiste en aplicar pulsos eléctricos de alto voltaje que forman poros en las membranas
celulares por los que se introduce el DNA recombinante.
- Uso de virus que infectan a células eucariotas.
- Microinyección: es el único método eficaz al 100%, y se basa en la inyección directa del DNA recombinante
en el núcleo de cada una de las células anfitrionas.
5. Propagación
Consiste en colocar a las células en un medio adecuado para que se repliquen o para que expresen el producto
problema.
6. Selección de clones positivos o recombinantes
Consiste en seleccionar las células que han sido transformadas o transfectadas correctamente, mediante diversas
técnicas:
- Genes marcadores que suelen encontrarse en el vector. Por ejemplo, en el caso de los plásmidos, suelen
contener un gen que les confiere resistencia a los antibióticos. Tratando a las células con antibióticos se
puede comprobar cuales contienen el vector.
- Procedimientos de hibridación: Sonda marcada que reconoce nuestro DNA recombinante.
- Procedimientos inmunoquímicos: métodos ag-ac que nos permiten detectar el producto formado.
- En el vector se incorpora un policonector cerca de la secuencia del operon lactosa, de modo que cuando
se introduce el DNA recombinante entre los genes del operón lactosa y estos quedan interrumpidos, lo que
nos sirve para llevar a cabo la selección.
ANIMALES MODIFICADOS GENETICAMENTE
La transgénesis se basa en aplicar los procesos de clonaje a células germinales, obteniendo animales manipulados
genética mente.
Se pueden distinguir 3 tipos:
- Animales transgénicos: organismos a los que se ha aportado una dotación genética extra. Es un gen que no
formaba parte inicialmente de la célula.
- Animales knock-out: aquellos a los que se les ha eliminado una dotación genética de su propio genoma, en
todas las células de ese animal.
- Animales knock-in: se sustituye un gen de la célula por otro homólogo en el que se ha introducido alguna
mutación.
 TRANSGÉNESIS CLÁSICA
Se trata de hacer llegar a una célula germinal una molécula de DNA que queremos que forme parte del genoma de
un organismo, de modo que conferirá a la descendencia un nuevo carácter hereditario. Esto se realiza introduciendo
el gen en el núcleo de un óvulo fecundado que continuará su desarrollo posteriormente. Las aplicaciones de este
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procedimiento en patologías humanas son el diagnóstico de enfermedades y la obtención de productos útiles en
terapéutica. Las etapas del procedimiento son:
1. Preparación del fragmento de DNA que se desea introducir en forma de cDNA.

2. Obtención de óvulos fecundados de madres donadoras.
3. Introducir por microinyección el ADN en uno de los núcleos del huevo fecundado.
4. Reimplantación de los huevos transformados en madres receptoras.
5. Análisis de la descendencia para identificar los individuos que portan el transgen.
6. Cruce de individuos para establecer líneas transgénicas.
Para identificar los animales que poseen el transgen, proceso también llamado genotipaje, con posterior intención de
cruzarles, se utilizan dos métodos:
- PCR: conociendo una parte de la secuencia del transgen se crean dos cebadores específicos de la región
concreta de dicho transgen que se desea amplificar. Tras llevar a cabo el proceso, mediante un marcador s
identifica si el organismo presenta el transgen.
- Southern blot: la utilización de una sonda que podemos marcar y que sea complementaria a la zona de
nuestro gen insertado. Para ello el DNA genómico se aísla y se digiere, separándose en un gel de agarosa
para la posterior transferencia a la membrana donde se llevará a cabo la hibridación con la sonda que
reconoce específicamente el transgen y se hibrida con ella.
Esta técnica se puede utilizar, por ejemplo, para:
- Conseguir que una proteína se exprese de forma ubicua. Para ello el cDNA que codifica para esa proteína
tiene que tener un promotor muy pontente que permita que la proteína se exprese de forma ubicua.
- Obtención de granjas genéticas. En este caso se trata de obtener una molécula útil en terapéutica, pero no
interesa que se exprese de forma ubicua sino en un tejido del que luego sea fácil extraer la proteína. Por
ejemplo, si queremos que la proteína se exprese en las glándulas mamarias para luego obtenerla de la
leche, habrá que incluir un promotor que permita que la proteína se exprese en el tejido mamario. Se utilizan
normalmente cerdos, porque tienen un mecanismo de modificaciones postraduccionales similar al del
hombre. permite obtener productos que antes se extraían de la sangre como factores de coagulación o
inhibidores de proteasas.
Las ventajas de la utilización de animales transgénicos para producción de proteínas son: coste de producción poco
elevado, extracción y purificación rápida, se eliminan los residuos y se puede modificar la vida media de la proteína
con alguna modificación.
 ANIMALES KNOCK-OUT
Eliminación de uno o más genes de la dotación genética, a nivel de las células germinales. Se elimina el gen de
interés y se sustituye por recombinación homóloga por otro gen que carezca de función. Se utiliza para el estudio de
distintas enfermedades.
 ANIMALES KNOCK-IN
Son aquellos a los que se les ha sustituido uno o más genes por otros homólogos mutados. Se utiliza para el estudio
de patologías humanas.
En ambos casos, en la célula en estado embrionario se lleva a cabo la inactivación parcial o total de un gen. Las
construcciones (gen sin función o gen modificado) se hace llegar a la célula embrionaria a través de un virus. Por
ejemplo, se emplea el virus del herpes, modificado para no ser patógeno. Puede ocurrir que el gen se integre en los
cromosomas del animal o no. Si queda como molécula extracromosómica tras varias divisiones desaparece. Después
de ello se lleva a cabo la selección de las células mediante diversos mecanismos según el vector que se haya
empleado.
CLONACIÓN DE INDIVIDUOS
La clonación se ha utilizado para estudiar los mecanismos de diferenciación celular, la plasticidad de las cromatina o
estudios sobre la reprogramación de las células. La clonación de Dolly fue la primera clonación exitosa. En ella se
utilizaron células de una oveja adulta blanca donadora de células de la gándula mamaria de las que se obtuvo el
núcleo o material genético, que se introdujo en el óvulo de una oveja negra gestante a la que se le había eliminado
por aspiración dicho núcleo. Las células obtenidas se implantaron en la oveja carinegra, que cuando dio a luz, se
obtuvo una oveja blanca (pues la dotación genética era de la oveja blanca).
Cuando se va a realizar la obtención del núcleo, dichas células deben encontrarse en fase Go con dotación 2n, ya
que si no se producirían aberraciones cromosómicas. Los núcleos fueron reprogramados para comenzaran a
desarrollarse en las nuevas células.
9
El experimento salió adecuadamente pero cuando aún era una oveja joven, Dolly comenzó a desarrollar
enfermedades relacionadas con el envejecimiento prematuro, como la artritis. Esto era debido a que las células
donadoras del núcleo procedían de una oveja que ya tenía seis años, por lo que el DNA de dichas células poseía los
telómeros acortados.
TERAPIA GÉNICA
Estrategia terapéutica basada en la modificación del repertorio genético de células somáticas mediante la
administración de ácidos nucleicos (el DNa es el medicamento) y destinada a curar enfermedades. Cuando se creó
esta técnica se creyó que permitiría acabar con muchas enfermedades, pero el problema es que carecemos de los
vectores apropiados para hacer llegar el DNA a la célula, aunque conozcamos la mutación que la origina.
Se ha utilizado para tratar enfermedades crónicas y adquiridas (cáncer); aunque solo ha sido útil para el tratamiento
de las enfermedades monogenéticas clásicas. Para ello se utilizan dos tipos de estrategias terapéuticas:
- Transferencia génica ex vivo: sacando del organismo las células que necesitan ser tratadas, modificarlas y
volverlas a introducir a su lugar de origen. Los resultados obtenidos son mejores que mediante la segunda
estrategia.
- Transferencia génica in vivo: empleando vectores que hagan llegar el DNA a las células que queremos
tratar. Los resultados son peores porque carecemos de los vectores adecuados. Se suelen utilizar virus
(retrovirus, adenovirus) o liposomas. La tasa de éxito será mayor en el caso de los virus, especialmente en el
caso del retrovirus, ya que el ADN se integra con facilidad. La desventaja de este tipo de vectores, es que
dicha integración es aleatoria, puede que la molécula de DNA interrumpa la secuencia de un gen que
codifique para un producto importante para la célula y puede dar lugar a la aparición de tumores.
TEMA 27 – TÉCNICAS DE SEPARACIÓN E

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
SEPARACIÓN POR TAMAÑO
~ DIÁLISIS
Es empleada en la purificación y concentración de biopolímeros para eliminar pequeñas moléculas

contaminantes. Además, como vamos a utilizar una membrana semipermeable, vamos a poder
cambiar suavemente las condiciones de una solución tampón. No discrimina de forma efectiva entre
las proteínas.
Se utiliza una bolsa de diálisis con un tamaño de poro de la membrana semipermeable variable. Se introduce las
proteínas en el interior y todo ello se sumerge en el tampón, dejando salir las moléculas inferiores al tamaño de poro.
~ CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
Se conoce también como filtración ene gel y va a permitir una separación de proteínas en función de su tamaño
molecular.
- Fase estacionaria: son esferas de gel que contienen poros de un rango de tamaño estrecho; este tamaño de
pro se determina por el grado de entrecruzamiento entre los polímeros que forman el gel. Los polímeros son
insolubles y deben estar altamente hidratados por la fase móvil.
- Fase móvil: solución tampón que se utiliza para eluir la muestra.
Hay una relación lineal entre el volumen de elución relativo de una sustancia y el
logaritmo de su Pm. Si una columna de filtración por gel se calibra con varias
peoreínas de Pm conocido, se puede determinas la masa de una proteína a partir
de su posición en la elución. Eligiendo el tamaño del poro podemos decidir el rango
de tamaños de las moléculas que queremos separar.
~ CENTRIFUGACIÓN
Se utiliza en la fase de aislamiento y purificación de una proteína, ya que

generalmente se parte de muestras complejas (celulares, tisulares o microbianas).
Hay distintos tipos de Centrifugación:
10

 Centrifugación diferencial
Las partículas en suspensión de  tamaño se pueden separar por centrifugación a  velocidades aislando las
distintas membranas y orgánulos celulares para finalmente obtener un sobrenadante que contiene las proteínas
solubles. Produce varias fracciones de densidad decreciente, cada una de ellas consistente en varios cientos de
proteínas .
 Centrifugación isopícnica, zonal, en bandas o

en gradiente
Se utiliza para separar proteínas con  coeficientes de
sedimentación (por un factor de dos o mayor). Determinar la
masa molecular de forma muy precisa. Se puede aplicar en
condiciones no-desnaturalizantes en las que se mantiene la
estructura 4ia.
 Ultracentrifugación
Es útil para separar u analizar las propias biomoléculas y determinar parámetros tales como la masa y la densidad de
las mismas, por lo que podemos conocer algo sobre la forma de una molécula e investigar las interacciones entre las
moléculas.
La velocidad de sedimentación (S), depende de: la masa y la forma de la partícula; así como de la densidad de
solución.
La ultracentrifugación analítica se usa para caracterizar sistemas de moléculas asociadas no covalentemente,

subunidades de proteínas y otras moléculas que forman complejos macromoleculares (velocidad y equilibrio de
sedimentación). Durante la centrifugación cada tipo de macromolécula se mueve a través de un gradiente a una
velocidad determinada principalmente por su S y forma una zona que puede separarse de otras zonas similares.
~ ELECTROFORESIS EN GEL (PAGE-SDS)
Esta electroforesis se realiza verticalmente, en un gen de poliacrilamida. En

función de la concentración del gel el tamaño de los huecos del gel será
distinto, actuando como un tamiz. Además, si queremos separar las
proteínas según su tamaño y no su carga, utilizamos el gel en condiciones
desnaturalizantes, eliminando la diferencia de cargas de las proteínas.
Podemos utilizar SDS (dodecilsulfato sódico, una agente desnaturalizante de
carácter aniónico que elimina las asociaciones no covalentes entre
proteínas, es decir, las diferentes cadenas polipeptídicas que forman parte
de las proteínas uniéndose a ellas y elimina las diferencias de cargas de las
proteínas). Si la proteína posee puentes disulfuro, se eliminan con un
tratamiento con β-mercaptoetanol y ditiotreitol (agentes reductores).
La visualización de las proteínas se realiza mediante tinción con azul de

coomasie (permite detectar hasta cantidades de 0,1 μg de proteínas) o con
anticuerpos (cantidades hasta 0,02 μg). La resolución de este procedimiento
es muy alta, permite separar proteínas que difieren en solo 10 aminoácidos
en su tamaño.
Esta técnica recibe el nombre de PAGE-SDS. Se suele utilizar después de cada etapa del procedimiento de
purificación para determinar la pureza y el rendimiento, hasta obtener una sola banda. El rendimiento se calcula a
partir de la afinidad total, asignando al primer caso rendimiento del 100%. La pureza se determina a partir de la
afinidad específica, asignando al primer caso pureza de 1. Conforme avanza el proceso el rendimiento va
disminuyendo y la pureza va aumentando.
11

SEPARACIÓN POR SU SOLUBILIDAD
~ PRECIPITACIÓN FRACCIONADA O SALINA
Permite la separación de fracciones proteicas en base a la  solubilidad que presentan las proteínas en una solución
salina concentrada. Técnica más utilizada en la purificación y concentración de grandes cantidades de proteínas. La
sal más empleada es el sulfato amónico.
- Salting in: La solubilidad de la proteína  en una [sal].

- Salting out: La solubilidad de la proteína , si se agrega más sal.
SEPARACIÓN POR SU CARGA
~ ENFOQUE ISOELÉCTRICO
Se emplea para separar a las proteínas según su punto isolectrico (situación en

la que la carga neta de la molécula es 0). En un soporte de papel, generalmente
nitrocelulosa, se crea un gradiente de pH, ya que se añaden anfolitos (moléculas
pequeñas con cargas diversas) y se lleva a electroforesis. Posteriormente se
lleva a cabo la separación electroforética de las proteínas que van avanzando por el soporte hasta que quedan
retenidas en el pinto en el que el pH coincide con el punto isoeléctrico de la misma.
Permite distinguir proteínas que difieren en sus pI en 0.01, lo que significa que se pueden separar proteínas que
difieran en una sola carga neta.
~ ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Permite la separación de mezclas complejas de proteínas. Esto

es posible ya que se hace la combinación de: Enfoque
isoeléctrico + Electroforesis con SDS. Es un método analítico
muy sensible; separa proteínas: (=Mm pero pI) o (= pI pero  Mm).
Se lleva a cabo el desarrollo mediante dos direcciones. La primera dirección es horizontal, utilizando el
isoelectroenfoque y quedando las proteínas separadas en función del punto isoeléctrico. El resultado se transfiere a
un gel, que se encuentra en posición vertical, y es sometido a electroforesis separándose las proteínas en función de
su tamaño. Permite separar un elevado número de proteínas.
~ CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Permite la separación de las moléculas en función de su carga neta (signo y magnitud) a un pH determinado. Se
utiliza una columna rellena de un polímero con carga positiva (grupo carboximetilo) o negativa (grupo
dietialaminoetilo).
- Columna de intercambio catiónico: cargas negativas en la columna, quedando retenidas las moléculas con
carga positiva.
- Columna de intercambio aniónico: cargas positivas en la columna, quedando retenidos las negativas.
Posteriormente, la molécula que ha quedado retenida puede ser eluída cambiando la fuerza iónica del medio. Cuanto
menor sea la carga de la proteína antes saldrá de la columna.
~ CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA O HPLC
Dan lugar a una separación rápida y una elevada resolución y reproducibilidad, esto es asi ya que la fase estacionaria
está hecha de resina densamente empaquetada, por lo que al ser las bolitas más finas hay una mayor superficie de
interacción, por lo que aplicando presión vamos a favorecer esta separación y obteniendo mejores resultados.
SEPARACIÓN POR AFINIDAD
~ CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Se utiliza para separar proteínas con afinidad por un determinado ligando. La columna estará rellena de un material
unido a ese ligando. Quedan retenidas las proteínas que sean específicas del ligando que hay en el interior, mientras
que las otras son eluídas. Después se pueden eluir las proteínas que quedan retenidas cambiando la fuerza iónica
del medio.
12

~ INMUNOPRECIPITACIÓN
Se trata de una purificación de afinidad basada en el uso de anticuerpos para aislar la proteína de interés.
Inicialmente está basado en la centrifugación supramoleculares (ahora también con imanes). Hay dos tipo generales:
de proteína individual (IP) o de inmunoprecipitación de complejo proteíco (Co-IP).
Hay 4 pasos generales:
- Preparación de la muestra: Lísis de células (RIPA buffer + inhibidores de proteasas, etc.).

- Formación del complejo Ag:Ac.
- Separación del complejo Ag:Ac.
- Análisis de los complejos (WB, actividad enzimática,
etc.)
TEMA 28 – TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN DE PROT.

Mediante las técnicas de purificación se pueden evaluar cuantitativamente y cuantitativamente una proteína antes de
proceder a la caracterización de su composición química, estructura y función. Un protocolo típico de purificación de
una proteína soluble implica:
1. Rotura de la membrana celular  centrifugación diferencial en gradiente de densidad.

2. Purificación y concentración: por precipitación selectiva por adición con sales inorgánicas (precipitación
salina).
3. Separación e identificación: con una combinación de técnicas de separación basadas en la carga
molecular, el tamaño molecular o en la afinidad.
En el proceso de purificación de una proteína es esencial

disponer de un método para detectar y cuantificar dicha
proteína de forma que podamos hacer un seguimiento:
Detección de proteínas:
- Proteínas enzimáticas: Actividad enzimática (AE) o

actividad enzimática específica (AEE).
- Proteínas de transporte: Ensayos de unión a la
molécula que transportan.
- Hormonas y toxinas: Efectos biológicos que
producen.
- Proteínas estructurales: Se encuentran en  %, no
necesitan de un ensayo funcional para valorar su
pureza ya que suele ser elevada.
Cuantificación de proteínas:
- Métodos colorimétricos: Bradford, Lowry, BCA.
13
TEMA 29 – TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN DE
LA ESTRUCTURA PROTEICA
Pasos para hacer una secuenciación peptídica de un tejido:
- Aislamiento y purificación de las cadenas.
- Romper las fuerzas que unen las cadenas.
- Aislamiento de las cadenas polipeptídicas.
- Composición de los aa de la cadena.
COMPOSICIÓN DE LOS AA DE UN PÉPTIDO
Para determinar la secuencia de una proteína, hay una serie de etapas:
1. Identificación de los residuos aminoacídicos C‐ y N‐terminal.

2. Fragmentación de la cadena para obtener péptidos menores más fáciles de secuenciar por hidrólisis
selectivas, combinando agentes químicos y/o biológicos específicos.
3. Aislamiento y secuenciación de los péptidos menores por eliminación sucesiva de residuos
aminoacídicos e identificación de los mismos.
4. Reconstitución de la cadena, ordenando los péptidos menores, buscando superposiciones (secuencias
parciales coincidentes entre ellos) y continuidad.
5. Localización de los puentes de disulfuro.
~ IDENTIFICACIÓN DEL AMINOÁCIDO C-TERMINAL
- Métodos enzimáticos
Catalizan específicamente la hidrólisis del último enlace peptídico de una

cadena peptídica, liberando un péptido con (n‐1) aa y el residuo C‐
terminal que se identifica por cromatografía. Tratamiento del péptido con aminopeptidasa que liberan de la cadena
polipeptídica el aa que tiene el grupo ‐amino libre (el N‐terminal).
- Hidrazinolisis
El tratamiento de un péptido con hidracina anhidra a 100ºC produce la escisión de todos los enlaces peptídicos de la
cadena, produciendo (n‐1) derivados aminoacilhidrazina + 1aa libre que es el residuo Ct identificable.
- Conversión del aa Ct en aminoalcohol
Por reducción (hidruro de Al y Li), hidrólisis de la cadena, (n‐1) aa + aminoalcohol correspondiente al Ct (método de
Fromageot) que se identifica.
- Método de Sanger.
Reactivo Sanger o fluoruro de 2,4‐dinitrobenceno (FDNB). El FDNB

reacciona con el grupo amino N‐terminal de un polipéptido en solución
alcalina, obteniéndose un péptido modificado. La unión aa‐FDNB es fuerte y
sometido a una hidrólisis ácida con HCl 6M, se libera una mezcla de aa
libres (n‐1) y el dinitrofenilderivado del aa N‐terminal. Los aa pueden
separarse por electroforesis o cromatografía en papel y la mancha del residuo N‐terminal es amarilla que pueden
identificarse por comparación con la migración de dintrofenil (DNF) derivados de aa conocidos.
- Tratamiento con Cloruro de Dabsilo
El cloruro de dabsilo reacciona con el grupo amino del aa Nt y se forma un derivado de dabsilo que por hidrólisis se
libera el dabsil‐aa y una mezcla de aa libres. El dabsil‐aa es de color muy intenso y proporciona más sensibilidad que
los compuestos dinitrofenilados
14

- Traramiento con Cloruro de Dansilo.
Tratamiento de una cadena polipeptídica con el cloruro de dansilo se obtiene un péptido modificado, dansilderivado
del péptido, seguida de una hidrólisis libera el dansilderivado del aa Nt, compuestos incoloros estables pero
fluorescentes. La reacción y el análisis son muy similares al método de Sanger, pero el cloruro de dansilo tiene la
ventaja de que es intensamente fluorescente. Con este reactivo, puede detectarse una concentración de un residuo
de 1 nM.
- Degradación de Edman.
Cuando se utiliza el reactivo de Sanger, se destruye el polipéptido y únicamente nos vale para identificar el aa del Nt.
Sin embargo, cuando se utiliza el reactivo de Edman, el péptido queda acortado en un aa y sobre él puede aplicarse
de nuevo el reactivo, que se unirá al segundo aa de la cadena inicial que ahora se ha convertido en el Nt del péptido
(n‐1). Por eso, con este método que se conoce como degradación de Edman, la aplicación sucesiva del reactivo
sobre el péptido permite secuenciar péptidos pequeños.
~ FRAGMENTACIÓN DE LA CADENA
- Rotura de los enlaces disulfuro
Los puentes disulfuro interfieren en el procedimiento de secuenciación. Ej: Cys al que se cortara uno de sus enlaces
peptídicos mediante el procedimiento de Edman, podría permanecer unida a otra cadena polipeptídica a través de su
puente disulfuro. •Hay varios métodos para romper los puentes disulfuro con ácido perfórmico, DTT o 2‐
mercaptoetanol, después ‐SH libres serán alquilados, en general con yodoacetato para evitar que se formen
nuevamente los enlaces disulfuro por oxidación con O2.
- Rotura de la cadena por agentes enzimáticos
TRIPSINA: Cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en los que el grupo ‐ COOH que se va a hidrolizar es
aportado por los aa fuertemente básicos (Lys y Arg), siempre que el grupo amino de ese enlace no sea aportado por
una Pro. Rn‐1 =residuos con carga +: Arg, Lys; RnPro
QUIMIOTRIPSINA: Cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en que el grupo ‐carboxilo del enlace peptídico que
se va a hidrolizar es aportado por aa con cadenas laterales apolares de gran tamaño como son los aa aromáticos
(Phe, Tyr, Trp) siempre que el grupo amino del enlace no esté aportado por la Pro. Rn‐1 =residuos hidrofóbicos
voluminosos Phe, Tyr, Trp; RnPro.
PEPSINA: Cataliza la hidrólisis del enlace peptídico en que el aa que cede el grupo ‐amino sea de carácter
aromático, acídico o Leu y siempre que el grupo carbonilo no pertenezca a un residuo de Pro. Rn=Leu, Phe, Trp, Tyr;
Rn‐1Pro.
TERMOLISINA: Cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en que el aa que participa con el grupo amino sea de
carácter hidrófobo y siempre que el que cede el grupo carbonilo no sea Pro. Rn=Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val; Rn‐
1Pro.
- Rotura de la cadena por agentes químicos
BROMURO DE CIANÓGENO (Br‐ CN). Cataliza la hidrólisis del enlace peptídico en el que el grupo –COOH que se
va a hidrolizar es aportado por la Met. En la acción del Br‐CN, el residuo de Met que quedaría como Ct de los
péptidos parciales, aparece como homoserina.
~ AISLAMIENTO Y SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS MENORES
En esta fase hay que separar los péptidos menores, secuenciar las cadenas polipeptídicas por la degradación de
Edman e identificarlos. Se aíslan los péptidos individuales de cada mezcla utilizando por ejemplo la cromatografía de
intercambio iónico. Con la reacción de Edman, es posible secuenciar con eficacia unos 50 residuos aminoacídicos.
Como la mayoría de las proteínas contienen más de 50 aa, su secuencia se deberá determinar en partes y será
necesario realizar una previa fragmentación de la molécula en fragmentos lo suficientemente pequeños para permitir
la secuenciación por el método de Edman.
Para ordenar de forma correcta los fragmentos peptídicos secuenciados y obtener la secuencia completa del péptido
original, se somete una muestra de esta a una segunda hidrólisis parcial mediante un reactivo hidrolítico diferente del
utilizado inicialmente y se secuencian los nuevos péptidos. Esto produce secuencias solapadas con las del primer
conjunto de secuencias que permite averiguar la secuencia completa.
15

~ RECONSTITUCIÓN DE LA CADENA
La secuencia aminoacídica de la cadena de un polipéptido se determina por comparación de las distintas secuencias
de los péptidos parciales obtenidos tras la acción de distintas enzimas. La superposición de dichas secuencias debe
determinar una sola disposición de la cadena polipeptídica completa.
~ LOCALIZACIÓN DE PUENTES DISULFURO
La caracterización completa de la estructura covalente de una proteína, requiere localizar las posiciones de todos los
enlaces disulfuro. Estos enlaces han sido destruidos en la preparación de la secuenciación. Para determinar la
disposición de los enlaces disulfuro, se parte de la proteína nativa que se somete a dos procesos diferentes:
1. Localización de las Cys libres. Se marcan los residuos de Cys libres con yodoacetato radiactivo. Se
rompen los enlaces disulfuro liberándose las mismas cadenas polipeptídicas de la secuenciación anterior.
2. Localización de las Cys que forman parte de los enlaces disulfuro. Se fragmentan muestras de la
proteína intacta con varias enzimas, pero en esta ocasión sin romper primero los puentes disulfuro. Algunos
péptidos, que están conectados por estos enlaces estarán unidos entre sí. A continuación, se pueden aislar y
romper sus enlaces disulfuro y localizar la posición en esta cadena.
TÉCNICAS DEL DNA RECOMBINANTE
Determinar la secuencia peptídica de la proteína a partir de secuencia de nt del gen o a partir del RNA mensajero
leído a partir de este gen. La secuenciación del DNA es un proceso sencillo en la actualidad, por lo que la
determinación de la secuencia de una proteína por este método suele ser más simple y rápido que la secuenciación
directa de la cadena polipeptídica. Sin embargo, este método presenta ciertas limitaciones:
- No establece la situación de puentes disulfuro en la cadena plegada.

- No se identifican aa que hayan sufrido modificaciones tras su incorporación en la cadena, como 4‐
hidroxiprolina, 5 hidroxilisina….
16
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- Clorhidrato de Guanidina: agente desnaturalizante que contribuye a la inactivación de RNasas

3) FASE DE CONCENTRACIÓN O PRECIPITACIÓN

VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y PUREZA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

FRACCIONAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

- Agarosa: polímero fácil de preparar, no tóxico y poco costoso.

TEMA 25 – TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE

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A continuación, se prepara un gel de agarosa donde se realiza una electroforesis. Se disponen 4

 SECUENCIACIÓN DEL RNA

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 RFLP: polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción

Técnica dirigida a la detección de mutaciones responsables de enfermedades humanas. El fundamento se basa en la

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 Hibridación “in situ”

 PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

También se conoce como clonaje acelular. Consiste en la síntesis

1. Desnaturalización: Se realiza a temperaturas muy altas, de unos 90-95 ºC.

Los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción son:

- DNA problema (molde).

- RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa acoplada a la transcripción reversa): Se utiliza para

- PCR cuantitativa a tiempo real: La cantidad de material amplificado

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- Estudiar la estructura de genes.

Las principales etapas son:

1. Preparación del DNA problema que se quiere clonar

2. Elección del vector

Existen dos tipos de vectores según la finalidad:

- Vectores de clonación: se emplean cuando el objetivo es la obtención de copias de DNA in vivo.

3. Unión del DNA al vector

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4. Introducción del DNA recombinante en el sistema celular

- Transfromación: transferencia del DNA recombinante a células procariotas.

6. Selección de clones positivos o recombinantes

ANIMALES MODIFICADOS GENETICAMENTE

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1. Preparación del fragmento de DNA que se desea introducir en forma de cDNA.

Esta técnica se puede utilizar, por ejemplo, para:

TEMA 27 – TÉCNICAS DE SEPARACIÓN E

Es empleada en la purificación y concentración de biopolímeros para eliminar pequeñas moléculas

~ CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Se utiliza en la fase de aislamiento y purificación de una proteína, ya que

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 Centrifugación isopícnica, zonal, en bandas o

La ultracentrifugación analítica se usa para caracterizar sistemas de moléculas asociadas no covalentemente,

~ ELECTROFORESIS EN GEL (PAGE-SDS)

Esta electroforesis se realiza verticalmente, en un gen de poliacrilamida. En

La visualización de las proteínas se realiza mediante tinción con azul de

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~ PRECIPITACIÓN FRACCIONADA O SALINA

- Salting in: La solubilidad de la proteína  en una [sal].

Se emplea para separar a las proteínas según su punto isolectrico (situación en

Permite la separación de mezclas complejas de proteínas. Esto

~ CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

~ CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA O HPLC

SEPARACIÓN POR AFINIDAD

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Hay 4 pasos generales:

- Preparación de la muestra: Lísis de células (RIPA buffer + inhibidores de proteasas, etc.).

TEMA 28 – TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN DE PROT.

1. Rotura de la membrana celular  centrifugación diferencial en gradiente de densidad.

En el proceso de purificación de una proteína es esencial

- Proteínas enzimáticas: Actividad enzimática (AE) o