Instrumentación en fotometría (fluorometría)

La espectrometría de fluorescencia o fluorometría es un tipo de espectroscopía

que permite analizar y medir la fluorescencia de una muestra. Los fluorímetros son
los dispositivos que permiten medir los parámetros de la fluorescencia de una
muestra como su intensidad y la distribución de longitudes de onda del espectro
de emisión después de la excitación por una fuente de luz monocromática de alta
energía.
En este, primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz,
desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del
estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la
molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado
vibracional más bajo del estado electrónico excitado.
La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado
electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden
caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los
fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues,
mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por
espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede
determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración.
Con la absorción de radiación visible o UV por parte de una molécula, el
electrón So (estado basal del singulete), es llevado a S 1 o S2 . La especie
excitada puede retornar al estado basal por disipación de la energía
mediante la colision o por relajación por vibración del estado excitado. La
especie relajada por vibración puede retornar al estado basal con la emisión
de radiación con una longitud de onda mas larga que la que fue absorbida
originalmente. Esta radiación se denomina
fluorescencia.

La intensidad y posición de las bandas de

fluorescencia son afectadas por el pH. El
rendimiento cuantico de la fluorescencia falta el
símbolo es menor que la unidad debido a un
proceso de “amortiguación”: es decir, no todas
las moléculas excitadas retornan al estado
basal por la emisión de radiación fluorescente.
Puede perderse energía por disociación y
desactivación de enlaces.

La espectrofotometría de fluorescencia ofrece limites de detección mas bajos

que los de la espectrofotometría de absorción. Puede medirse una cantidad
de 1.1 µg/L y mantenerse la linealidad hasta los 10,000 µg/L.
En el caso de la fluorometría, al incidir la luz sobre la muestra, una parte de esta
es absorbida y produce la excitación de los átomos que vuelven luego (de 1
nanosegundo a un mili segundo) a su nivel energético previo reemitiendo
radiación. Si esta radiación es visible, se habla de fluorescencia, la cual puede ser
propia de la sustancia o inducida mediante una reacción química.
DESARROLLO
En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de
instrumentos:
* Fluorómetros de filtro, que utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz
fluorescente.
* Espectrofluorómetros, que usan monocromadores de retículo de difracción para
aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
Ambos tipos de instrumentos utilizan un sistema en donde la luz de una fuente de
excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra.
Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las
moléculas de la muestra producen una fluorescencia.

El primero consta de los siguientes componentes:

Fuentes de excitación
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación:
 Lámparas de Xenón y Mercurio: La lámpara de xenón es más versátil que
la lámpara de mercurio, ya que produce una intensa radiación por el paso
de corriente en una atmósfera de xenón; el espectro de este tipo de
lámpara es continua de 250 a 600 nm. Con un pico de máxima intensidad a
470 nm.
 Lámpara de vapor de mercurio: es una lámpara lineal, lo que significa que
emite luz cerca del pico de longitudes de onda.
 Arco de xenón: tiene un espectro de emisión continuo con intensidad casi
constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las
mediciones hasta justo por encima de 200 nm.

Filtros y monocromadores
En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador
transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables, pudiendo
seleccionar las longitudes de onda transmite. Un monocromador ideal sólo
transmite luz en el rango especificado y tiene una transmisión independiente de la
longitud de onda.
En el caso de la fluorometría hay dos filtros:
-Un filtro primario colocado entre la fuente de radiación y la celda, para seleccionar
la longitud de onda de excitación.
-Un filtro secundario colocado entre la celda y el detector, que actua como un filtro
interrumptor fino que permite transmitir la radiación fluorescente, bloqueando en
cambio la radiación dispersa.
Detector
Un detector de fluorescencia colocado de manera que forme un ángulo de 90° con
respecto a la dirección del haz de luz incidente, con el objeto de minimizar la
interferencia de la luz transmitida.
Puede ser de un solo canal o de múltiples canales. El detector de un único canal
sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento,
mientras que el de múltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes
de onda simultáneamente, con lo que el monocromador de emisión o filtro es
innecesario.
Debido a que la señal de fluorescencia es de baja intensidad se requiere de un
potente sistema de amplificación. Por esto son preferidos los tubos
fotomultiplicadores, aunque también se usan comúnmente los fototubos en
aparatos de menor precio.

Celdas
En fluorescencia se utilizan celdas de vidrio común cuando la radiación que se
maneja es de rango visible. Para Ultravioleta es necesario utilizar sílice o cuarzo.

El espectrofluorómetro presenta los mismos componentes que el fluorómetro

de filtro, sólo que los filtros se han reemplazado por sistemas
monocromadores como prismas o redes de difracción, siendo
frecuentemente empleada una lámpara de arco de xenón a alta presión
como fuente de radiación.

El fluorímetro más versátil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de

excitación continua, puede registrar tanto un espectro de excitación como un
espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de
onda de la luz de excitación se mantiene constante, de preferencia en una longitud
de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro.
Para medir los espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del
filtro o monocromador de emisión se mantiene constante y el monocromador de
excitación va escaneando. El espectro de excitación generalmente es idéntico al
espectro de absorción, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a
la absorción.

Importancia
Para llevar a cabo el análisis de determinadas muestras o compuestos, es importante la
selección en la compra del espectrofluorímetro o fluorímetro, en donde se debe
considerar el costo y la finalidad del trabajo que se desea hacer con un instrumento de
este tipo. Un espectrofluorímetro es mucho más costoso que un simple fluorímetro de
filtros. Con el primero es posible hacer estudios sofisticados sobre una estructura
electrónica y de niveles energéticos en moléculas o iones además de análisis
cuantitativo. Un fluorímetro de filtros es de mucho menos precio y funciona en forma
completamente satisfactoria en aspectos de trabajo rutinario y con técnicas ya
establecidas (Ejemplo:laboratorios de análisis clínicos, laboratorios de control de
calidad), por lo que en laboratorios de análisis, es mucho más frecuente encontrar
fluorímetros simples que espectrofluorímetros.

Aplicaciones

La espectrometría de fluorescencia o espectrofluorimetría es el método espectroscópico

óptico más extensivamente usado en mediciones analíticas y en investigación científica.
El gran número de aplicaciones va desde la determinación analítica de trazas de
metales en el ambiente a mediciones de pH en células completas bajo condiciones
fisiológicas. En la investigación en laboratorio, la espectrofluorimetría se está aplicando
para estudiar procesos físicos fundamentales de moléculas; relaciones estructura-
función e interacciones de biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos;
secuenciación de DNA y caracterización genómica. En aplicaciones analíticas, el uso de
la fluorescencia es dominante en laboratorios clínicos donde inmunoensayos de
fluorescencia han reemplazado ampliamente a los radioinmunoensayos. Hay dos
razones principales para el extensivo uso de la espectrofluorimetría. La primera, es el
alto nivel de sensibilidad y el amplio rango dinámico que pueden realizarse. Un gran
número de laboratorios han reportado detección de una sola molécula. En segundo
lugar, la instrumentación requerida es conveniente y para la mayoría de propósitos
puede adquirirse por un costo no muy elevado.

Frente a la espectroscopía de absorción, la fluorometría posee la ventaja de una mayor

sensibilidad y menores interferencias. La mayor sensibilidad es debida a que no se mide
una magnitud relativa (diferencia de absorciones), sino absoluta (cantidad de luz
reemitida). Las menores interferencias se deben a que hay pocas sustancias
fluorescentes y menos con emisión y absorción igual, por supuesto que también se
utilizan cubetas de sílice o cuarzo (lo cual reduce aún más las interferencias a
longitudes de onda inferiores a 320 nm). La resolución en la fluorometría es de 1 a 100
ng/ml. Su principal inconveniente es la influencia de la temperatura.

REFERENCIAS:
 Gennaro,A. 2003. Remington. Farmacia. Editorial Medica Panamericana.
Argentina. Pp-741.
 Estrada,M.,Gonzales,C. 2006. Espectrofluorimetria. Universidad Nacional
Autonoma de Mexico. Instituto de Biotecnologia. Metodos Fisico-quimicos
en biotecnología. Mexico. Tomado de:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrofluorimetria.pdf. Pp-72.
 Mompín, J. (1988). 10. Instrumentación para el laboratorio clínico. En
Introducción a la bioingeniería (195 - 197). Barcelona, España: Marcombo
Boixareu Editores.
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 SKOOG, D.A.; Leary J.J.; ANÁLISIS INSTRUMENTAL, 4° ed.; Ed. McGraw-
Hill, (1994), págs. 201-219.