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Métodos en Bioquímica
2º Grado en Bioquímica y Ciencias Biomédicas
Facultad de Ciencias Biológicas

Universitat de València
Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Métodos en Bioquímica (I)
TEMA 1: Espectroscopía de absorción

1. Fundamentos físicoquímicos de la espectroscopía.
1.1 Introducción a la espectroscopía
Técnicas que se basan en el estudio de a interacción de la radiación

electromagnética con la materia. Las técnicas espectroscópicas permiten obtener
información de la materia: la naturaleza de las moléculas, su cantidad, su
estructura, su posición y movimiento, interacciones con el entorno.
Hay numerosas técnicas espectroscópicas:
- Espectroscopía de absorción UV-visible

- Fluorescencia
- Espectroscopía de absorción de infrarrojo
- Espectroscopía Raman
- RMN (resonancia magnético nuclear)
- Difracción rayos X
- Dicroísmo circular
- Dispersión óptica rotatoria
- RSE (resonancia de spin electrónico) o RPE (resonancia paramagnética electrónica)
‣ Interacción radiación-materia
Si tenemos una muestra en una cubeta y es irradiada pueden ocurrir tres fenómenos
diferentes:
๏ Absorción: parte de la radiación incidente es absorbida por las moléculas; la radiación

transmitida no altera su dirección ni su naturaleza pero tiene una menor intensidad (ej:
espectroscopía de absorción UV-visible). No cambia la naturaleza de la radiación sino que
falta radiación, es decir, irradias con una intensidad y la radiación que sale es menor, se
ha perdido intensidad.
๏ Emisión: las moléculas emiten la radiación electromagnética absorbida como una

radiación de menor energía en todas direcciones (ej: espectroscopía de fluorescencia). La
radiación no es de la misma naturaleza, sino que las moléculas pierden energía por el
camino por lo que tenemos radiación de menor energía.
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๏ Dispersión
➡ Elástica o de Raleigh: la radiación electromagnética no altera sus propiedades
salvo la dirección, ya que es desviada.
➡ Inelástica o de Raman: la radiación dispersada es de diferente energía que la
incidente (es muy minoritaria). En este caso sí cambia la dirección.
1.2 La radiación electromagnética
Una radiación electromagnética es la propagación en

el espacio de un campo eléctrico y un campo
magnético. Los vectores campo eléctrico ( E )⃗ y campo
magnético ( H )⃗ son perpendiculares y oscilan en
módulo, dirección y sentido con la propagación de la
radiación.
El campo eléctrico se propaga oscilando en el espacio. El

vector E ⃗ no oscila solamente en un único plano sino que lo
hace en todas las direcciones perpendiculares a la dirección
de propagación. Existen dos excepciones:
Luz polarizada en un plano Luz circularmente polarizada
Seleccionar una radiación que solo tenga un plano Radiación oscila en una única dirección que no es
de oscilación fija
‣ Parámetros de la radiación electromagnética
Distancia entre dos puntos con el mismo vector campo

Longitud de onda
eléctrico
λ (nm)
Número de oscilaciones por unidad de tiempo. Cuantas ν (s-1)

Frecuencia
veces oscila el vector campo eléctrico por segundo c = λ ⋅ ν = 3.0x108m/s
Número de oscilaciones por unidad de longitud. 1

Número de ondas Cuantas oscilaciones veríamos si fijamos una ν̄ = (cm-1)
determinada longitud de onda λ
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Banco de apuntes de la
La radiación electromagnética tiene una doble naturaleza, ondulatoria y corpuscular:

propagación de fotones (paquetes de energías).
La energía de los fotones de una radiación es

Energía directamente proporcional a la frecuencia e E = h ⋅ ν = h ⋅ λc (J)
inversamente proporcional a la longitud de onda. h (Cte de Planck)=6.63x10-34Js
Número de fotones que atraviesan una unidad de
Intensidad superfície perpendicular a la dirección de propagación I
por unidad de tiempo.
‣ Espectro de radiación electromagnética
En el espectro de radiación electromagnética vemos radiaciones de alta energía como los

rayos X o Gamma. Encontramos tres regiones UV: la región UV-lejana corresponde a
longitudes de onda entre 170-250nm; la región de UV-próximo está comprendida en
longitudes de onda entre 250-350nm y la UV visible está comprendida entre los 350-800nm.
Más allá del espectro visible encontramos los infrarrojos, las ondas microondas y las ondas
de radio.
1.3 La energía de las moléculas
La energía total de una molécula es la suma de distintos componentes:
Etotal = Etraslacion + Erotacion + Evibracion + Eelectronica + Espinelectronico + Espinnuclear
Todos los parámetros de la radiación electromagnética están relacionados por

constantes. La energía es directamente proporcional a la frecuencia e
inversamente proporcional a la longitud de onda. Si tenemos una escala de
número de ondas creciente es una escala creciente de energía. La energía está
cuantizada ya que los niveles energéticos sólo pueden tener un valor discreto.
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si lees esto me debes un besito

‣ La energía electrónica y vibracional
Los niveles electrónicos se representan en forma de cuchara y los niveles vibracionales

aparecen en forma de rayas dentro de esta cuchara.
En una molécula diatómica se representa la energía frente a la distancia

entre los átomos, si la distancia es muy grande no hay interacción por lo
que la energía es específica. Si empiezas a acercar los átomos la energía
sigue constante hasta que los átomos se encuentran lo suficientemente
cerca para formar los enlaces que son más estables disminuyendo así la
energía hasta que se adquiera la distancia de enlace. A la distancia de
enlace es la forma más estable del sistema al tener una energía mínima.
Si continuamos acercando se produciría una repulsión haciendo que la
energía se disparara.
Cuando se produce una vibración está cambiando la distancia entre los

átomos. Si tienes un enlace la energía vibracional hace referencia a la
vibración del enlace que cambia la distancia entre los dos átomos. Más
energía vibracional quiere decir más cambio en la distancia del enlace.
1.4 Absorción de radiación
Las moléculas suelen estar en el nivel de menor energía posible (estado fundamental). La
molécula tendrá un nivel de energía que tenderá a ser el mínimo posible. Sin embargo, pueden
excitarse adquiriendo energía y pasando a un nivel de mayor energía (estado excitado).
Una molécula en estado fundamental puede tener dos

estados excitados pudiendo excitarse al estado excitado E1
o E2 haciendo que el sistema tenga más energía. Lo
necesario para excitar una molécula es la cantidad de
energía que separa los dos niveles ya que la energía esta
cuantificada. Si la energia suministrada es mayor a la
necesitada, no se quedara en un nivel menor, sino que es
necesaria la energia exacta para excitar una molécula a un
nivel de excitación, no se puede quedar en niveles
intermedios. Cada molécula tiene sus niveles energéticos particulares por lo que responderá de
forma específica a cada radiación electromagnética. Se puede suministrar la energía necesaria a
la molécula mediante radiación electromagnética: espectroscopía.
La forma más fácil de emitir energía a las moleculas es mediante los fotones. Las técnicas
espectroscopicas consisten en excitar moleculas proporcionando energía mediante fotones. Sólo
se producirá absorción de la radiación con una determinada λ, aquella
para la que la energía del fotón coincide exactamente con la distancia
energética entre los niveles.
En la transición vibracional, hay un salto de moléculas entre niveles de

energía vibracional, vamos a excitar una molécula de un nivel de energía
vibracional fundamental a un nivel excitado. Hay una variación
energética de 2x10-20J, por lo que necesitamos calcular la longitud de
onda de los fotones que hemos de irradiar; en este caso λ = 10000nm
que pertenece al espectro infrarrojo.
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En la transición electrónica, hay un salto de moléculas entre niveles de energía electrónicos,

vamos a excitar una molécula de un nivel de energía electrónica fundamental a un nivel
excitado. Hay una variación energética de 5x10-19J, por lo que necesitamos calcular la longitud
de onda de los fotones que hemos de irradiar; en este caso λ = 398nm que pertenece al
espectro UV-visible.
Las distintas técnicas espectroscópicas estudian diferentes tipos de transición energética y por
ello se trabaja en una u otra zona del espectro de radiación electromagnética. Cada tipo de
espectroscopía se refiere a un tipo de transición que hace referencia a un tipo de energia
molecular.
- Transiciones electrónicas en capas internas o átomos → Espectroscopía Rayos X

- Transiciones electrónicas → Espectroscopía UV-visible
- Transiciones vibracionales → Espectroscopía IR
- Transiciones rotacionales o de spin electrónico → Espectroscopía RSE (microondas)
- Transiciones de spin nuclear → Espectroscopía RMN (ondas de radio)
2. Espectroscopía de absorción UV-visible
2.1 Transiciones electrónicas
El rango de energía de la radiación UV-visible implica la excitación de

las moléculas entre niveles de energía electrónica (transiciones
electrónicas). La transición electrónica es mucho más rápida (10-15s) que
las vibracionales (10-12s). Por eso, las transiciones electrónicas ocurren
sin variación en la distancia entre núcleos (Principio de Franck- Condon).
La transición electrónica es heterogénea debido a la presencia de
niveles vibracionales.
La energía electrónica es la energia que deriva de la configuración electrónica que tiene la

molécula. Saber cómo se distribuyen los electrones entre los orbitales moleculares. Existen tres
tipos:
- Orbitales σ: Forman el enlace sencillo.
- Orbitales π : Fusión de orbitales pi perpendiculares al plano del enlace

sencillo. Forman los enlaces dobles y triples.
- Orbitales n : Átomos que tienen los π ocupados por electrones y no

participan en el enlace.
La distribución de los electrones en los orbitales de menor energía (enlazantes)

determina el nivel fundamental de energía electrónica. Según se distribuyan los
electrones, la energía de los electrones corresponde a la energía fundamental.
La energía de un fotón podrá ser absorbida por un electrón para saltar desde un
orbital molecular enlazante a un orbital antienlazante de mayor energía.
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Sólo van a absorber los enlaces π y heteroátomos con pares de electrones no compartidos. Hay
grupos que abserben luz: cromóforos.
2.2 La Ley de Lambert-Beer
Este proceso a nivel cuantitativo se recoge por una ecuación diferencial conocida como ley de
Lambert-Beer.
La muestra biológica en disolución se irradia una radiación

incidente (I0) de cierta intensidad, y al atravesar la muestras, las
moléculas son capaces de absorber parte de los fotones de la
radiación, de manera que sale de la disolución una radiación
transmitida (I) cuya intensidad es más pequeña que la radiación
incidente (I0), dado a que faltan los fotones de la intensidad de la Ia = I 0 - I
radiación absorbida (Ia).
A medida que la radiación es absorbida por la muestra, la intensidad cae de forma exponencial
dI
=−k ⋅I I = I0 ⋅ 10−k′⋅x
dx
La expresión correspondiente para muestras en disolución es:
I = I0 ⋅ 10−ε⋅c⋅l
ε → Coeficiente de extinción o absorción (M-1 cm-1)

c → Concentración de la disolución (M)
l → Paso óptico o distancia recorrida por la radiación en la muestra (1cm)
El coeficiente de extinción o absroción (ε) describe la capacidad de una molécula para absorber
radiación electromagnética. A mayor coeficiente de extinción, más cantidad de radiación es
capaz de absorber. Esta constante es lo que define las propiedades espectroscópicas de las
moléculas. Nos indica cómo se va a comportar espectroscópicamente una molécula con una
radiación concreta. Describe propiedades intrínsecas de las moléculas. Todo depende de λ , es
decir, es propio de la molécula para cada longitud de onda.
Las unidades del coeficiente de extinción son [mg/mL]-1 · cm-1. Son habituales dos formas del
coeficiente de extinción en función de las unidades de concentración utilizadas:
- ε 1M (coeficiente de extinción molar): M-1 cm-1

mg
1
- ε mL o ε 0.1% (coeficiente de extinción específico): [mg/mL]-1 · cm-1
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Se miden dos magnitudes para seguir el proceso de absorción: la transmitancia y la absorbancia.
‣ La transmitancia es el porcentaje de luz transmitida por la muestra.

Disminuye de manera exponencial al ser absorbida por la muestra al
I
T = 100 ×
atravesarla, entonces tiene una relación directa con la concentración I0
de la muestra ya que al aumentar la concentración la transmitancia
desaparece exponencialmente.
La absorbancia se trata de un logaritmo del cociente de intensidad
( I0 )
‣ I
incidente partido de la intensidad transmitida que indica la A = log
capacidad de absorción de la muestra. La absorbancia se define de
esta manera para llegar a una magnitud medible que refleje la
concentración de la muestra. Existe una relación lineal entre la
absrobancia y la concentración ya que a medida que aumenta la
concentración de la muestra lo hace en igual medida la absorbancia
de esta.
TRANSMITANCIA ABSORBANCIA
LEY DE LAMBERT-BEER
De este modo, la Ley de Lambert-Beer permite cuantificar la concetración
de una muestra usando la siguiente fómula: Aλ = ελ ⋅ c ⋅ l
La relación entre la transmitancia y la absorbancia es la siguiente, y

( T )
100
permite ver al coeficiente de extinción de manera más práctica. A = log
Aλ
Empíricamente podemos definir el coeficiente de extinción como el valor número ελ =
que coincide con la absorción de una disolución de concentración 1. c⋅l
Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extinción es muy eficiente en la absorción de

luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de
absorbancia cuando se encuentra en disolución a concentraciones muy bajas. Si el coeficiente de
extinción es muy pequeña, se necesita más concentración de la molécula para tener una obtener
la misma absorbancia.
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La absorbancia es una magnitud aditiva. Al trabajar

con disoluciones, se encuentran las moléculas del
soluto y del disolvente, por lo que obtenemos la
absorbancia de la disolución. Como la absorbancia
es aditiva la A de disolución = A disolvente + A del
soluto. De ahí podemos despejar y resolver el A
soluto que es el que interesa. Esto en la práctica se
realiza haciendo un cero (automáticamente). La
transmitancia no es aditiva.
2.3 Espectrofotómeros
Espectrofotómetros son el instrumento con el que llevamos a cabo la medida del proceso de
absorción. Están por cuatro elementos fundamentales:
➡ Fuente de radiación (lámpara). Actúa como fuente de radiación electromagnética.

➡ Sistema monocromador. Se encarga de obtener radiación electromagnético monocromática,
es decir radiación de una sola longitud de onda, la que nos interesa. Esa radiación se hace
incidir sobre la muestra.
➡ Celda. Instrumentos donde depositamos nuestra cubetas (1 cm de ancho).
➡ Sistema detector. Mide la radiación transmitida. Constituido por un fotomultiplicador. En
función de esa radiación, se calcula cual ha sido el valor de absorbancia en el proceso.
‣ Fuentes de radiación
Emiten radiación electromagnética, a partir de la cual se selecciona

una determinada longitud de onda. Para la región UV se emplean
lámparas de deuterio, y para la región visible se emplean lámparas
halógenas-tungsteno, cubre prácticamente todo el UV aunque en el
cercano al visible decae.
Necesitamos seleccionar radiación de una sola longitud de onda,

para ello se utilizan sistemas ópticos como lentes condensantes,
rendija y/o lente colimadora, que preparan la radiación para llegar al
monocromador.
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‣ Sistemas monocromadores
Los monocromadores permiten aislar la longitud de onda a la que el compuesto de estudio

va a absorber la luz. Están constituidos por materiales que dejan pasar de forma selectiva las
longitudes de onda deseadas, absorbiendo el resto. Existen dos sistemas monocromadores:
1. Prisma: descompone la radiación policromática en sus componentes monocromáticos

por dos procesos sucesivos de refracción: la luz se desvía al cambiar de medio y el
ángulo de desviación depende de λ. Tienen forma triangular.
2. Red de difracción: refleja la radiación policromática originando fenómenos de

interferencia que dan como resultado una radiación monocromática. Tienen forma
estriada. Generan interferencias que dan lugar al desfase de la radiación reflejada,
aunque hay una longitud de onda que consigue que las radiaciones estén en fase tras la
interferencia.
Las redes de difracción reflejan la radiación policromática originando fenómenos de

interferencia que dan como resultado una radiación monocromática.
Los prismas descomponen la radiación policromática en sus

componentes monocromá4cos por dos procesos sucesivos
de refracción: la luz se desvía al cambiar de medio y el ángulo
de desviación depende de λ. Según el ángulo de incidencia
de la radiación policromática sobre el monocromador se
selecciona radiación monocromática de una determinada λ.
‣ Cubetas para muestras
Se usan cubetas rectangular (las más usadas). Tienen distintos

volúmenes, pero la anchura es siempre 1, y por ello, la luz siempre
recorre 1 cm de muestra. Son de plásticos, que han sustituido el vidrio.
El problema es que en el UV, el plástico tiene ciertas limitaciones. Se
emplean entonces cubetas de cuarzo, pero son mucho más caros.
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‣ Fotomultiplicador
Los fotomultiplicadores transforman la señal luminosa en una señal eléctrica amplificada,

dando lugar a un pulso eléctrico cuya intensidad es directamente proporcional a la energía
de la radiación electromagnética detectada. Lo que se mide es la radiación transmitida, en la
misma dirección. Se mide mediante detectores
llamados fotomultiplicadores, que miden radiación
electromagnética. Lo que hace es medir fotones
amplificando la señal. Tiene un fotocátodo, donde se
produce efecto foto eléctrico, donde los electrones
son arrancados. Los dínodos se encargan de
amplificar la señal.
‣ Espectrofotómetro de doble haz
Son mejores, principalmente por la precisión en la medida. Añaden un divisor de haz, que
divide la radiación en dos iguales, y se duplica el resto de los componentes de modo que
hay dos rutas. En los de simple haz, se mide una
disolución, de modo que se necesitan dos medidas
para saber la absorbancia del soluto (conocer
disolución y disolvente). Es doble trabajo. En los de
doble haz, la medida se hace de forma simultánea, de
forma que se obtiene las dos medidas necesarias a la
vez. La ventaja reside en la simultaneidad, pues se mide
con la misma radiación. Las lámparas pueden fluctuar
en la radiación que irradian. Aunque se supone que son
iguales, pueden oscilar, y por tanto, la exactitud es
dudosa. Si se mide en el doble haz, no hay este
problema.
2.4 Espectros de absorción
El espectro de absorción de un compuesto es la representación gráfica del valor de la

absorbancia en función de la longitud de onda. Coges una muestra, y se determina la
absorbancia por diferentes longitudes de onda.
El espectro de absorción (normalizado) de un compuesto es la representación gráfica del valor

del coeficiente de extinción en función de la longitud de onda. Para ello, se divide la absorbancia
por la concentración.
Se caracterizan por bandas de absorción centradas alrededor de la longitud de onda de máxima

absorción.
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Las bandas del espectro UV son anchas porque una

transición electrónica es heterogénea ya que incluyen la
estructura fina de transiciones vibracionales y rotacionales
de menor energía. El épsilon indica la probabilidad del
salto, de modo que en un espectro, donde esté la lambda
máxima, indica el salto más probable. Hay más de una
posibilidad de excitar a las moléculas, es decir, de que
una molécula pueda absorber radiación, pro siempre
tratándose de energía cuantizadas.
2.5 Desviaciones de la Ley de Lambert-Beer
‣ Si los cromóforos interaccionan entre sí al aumentar mucho la concentración se pueden

alterar las propiedades espectroscópicas de los mismos. No es un
problema común. Si necesitamos concentraciones muy altas de un
cromóforo, pueden establecerse interacciones con las mismas. Las
propiedades espectroscópicas no son constantes, de modo que si
los cromóforos interaccionan, sus propiedades espectroscopias
generalmente cambian. A una concentración en donde los
cromóforos interaccionan, pueden absorber más o menos, de
modo que no sería posible deducir su comportamiento por
Lambert-Beer.
‣ El problema del rayo extraviado hace que el valor de absorbancia se sature alrededor de 2 a
pesar de que siga aumentando la concentración. Es un problema común. Se pone una
saturación al valor de absorbancia. Hay un instante en el que sí o sí, la absorbancia, en vez de
aumentar, mantiene un valor constante, incluso si seguimos
añadiendo concentración de cromóforo. No toda la radiación de
la longitud de onda es exactamente del valor que se ha ajustado.
Es decir, hay una pequeña proporción, del problema del
espectrofotómetro, en el que el 100% de la radiación no es
monocromáticas sino que hay una pequeña proporción que
corresponde a otro valor. Cuanto mayor sea el equipamiento, más
pequeño es el error. El rayo extraviado no se absorbe, sino que
sale como radiación transmitida (T = 1%, A = 2).
2.6 Análisis de mezclas
Si tenemos una mezcla de dos sustancias a y b podremos determinar la concentración de a y de

b presentes en la mezcla problema si:
‣ Si conocemos la absorbancia de la mezcla a dos longitudes de onda diferentes (λ1 y λ2)
‣ Si conocemos los coeficientes de extinción (ε) de las dos sustancias a y b a esas dos
longitudes de onda (λ1 y λ2).
Necesitaremos medir la absorbancia a dos longitudes de onda, y determinar los dos valores de
absorbancia. Necesitamos averiguar cuál es el épsilon de A a las dos landas y el épsilon de B en
las dos landas. Resolvemos la mezcla utilizando la propiedad de que la absorbancia es una
magnitud aditiva.
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a b a b
Aλ1 = Aλ1 + Aλ1 = ελ1 ⋅ ca ⋅ l + ελ1 ⋅ cb ⋅ l
a b a b
Aλ1 = Aλ2 + Aλ2 = ελ2 ⋅ ca ⋅ l + ελ2 ⋅ cb ⋅ l
Cuando tenemos una mezcla de A y B presentes en la disolución el punto isosbéstico se define
como la longitud de onda () en el que los dos compuestos tienen el mismo coeficiente de
extinción (mismo).
A esa longitud de onda son indistinguibles.
a b
ελisos = ελisos
a
Aλisos = Aλisos b
+ Aλisos a
= ελisos b
⋅ ca ⋅ l + ελisos ⋅ cb ⋅ l = ελisos (ca + cb) l = ελisos (ctotal) l
A este punto solo depende de la concentración total. Espectroscópicamente es como si

tuviéramos una sola molécula, ya que se comportan igual.
La definición de punto isosbéstico también se puede

aplicar a casos donde se produce un cambio en las
propiedades espectroscópicas de un cromóforos
(alteraciones en el entorno, ionización, oxidación, unión de
ligando): será la longitud de onda a la que no varía la
absorbancia cuando se produce el cambio espectral.
Solo trabajando en el punto isosbéstico podemos saber la

cantidad total de una molécula en una disolución.
3. Aplicaciones bioquímicas de la espectroscopía de absorción UV-visible
3.1 Absorción de las proteínas en la región UV-visible: aplicaciones
En los espectros de absorción de proteínas de UV-visible

observamos tres categorías de cromóforos, que nos dan banda a
una longitud de onda de 200nm, 280nm y 350nm.
El enlace peptídico es responsable de una banda de absorción en

el UV lejano alrededor de 200nm. En estos aparecen orbitales π , además de
ε 1M = 7000 M −1 c m −1
200
átomos de oxígeno y nitrógeno. Se producen sobre todo transiciones de π a π *,
aunque también de n a π*.
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Es la banda de absorción más intensa ya que tiene el mayor coeficiente de extinción. Esto se
debe a que tenemos tantos cromóforos como enlaces peptídicos tenga la proteína, es decir, el
número de aminoácidos de la proteína menos uno. Sin embargo esta banda no es especialmente
útil, ya que muchos otros compuestos absorben en esta región del espectro.
Para buscar algo específico de las proteínas debemos fijarnos en las bandas de 280 nm. Las
cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos son los cromóforos responsable de que las
proteínas absorban en el UV próximo.
La fenilalanina (Phe) no es muy representativo

debido a su bajo coeficiente de extinción.
La tirosina (Tyr) tiene un pico a una longitud de

onda de 275nm , es un cromóforo relativamente
potente.
El triptófano (Trp) posee el pico a 280nm, y el

mayor coeficiente de extinción con diferencia. El
problema es que este aminoácido no es tan
frecuente en las cadenas polipeptídicas, pero al
ser tan específico trabajamos con este.
La espectroscopía de absorción es útil para determinar el número de tirosinas y triptófanos en las

proteínas, mediante un problema de mezclas. Podemos desnaturalizar la proteína (con cloruro de
guanidino 6M o a diferentes pH) y medir las absorbancias a dos landas, despejando la
concentración de Trp y Tyr e identificando el número conociendo la concentración total de
proteína.
Trp T yr Trp T yr
A280 = A280 + Aλ1 = ε280 ⋅ c Trp ⋅ l + ε280 ⋅ c T yr ⋅ l A288 A c Trp
c Trp = − 280 n oTrp =
Trp T yr Trp T yr 3.103 10.318 c prot
A288 = A288 + Aλ1 = ε288 ⋅ c Trp ⋅ l + ε288 ⋅ c T yr ⋅ l
Algunas proteínas presentan grupos prostéticos. Estos son los responsables de bandas de
absorción preferentemente en la región visible del espectro, en torno a 350nm.
Desde el punto de vista espectroscópico, una proteína con grupo prostético es muy fácil de
trabajar. Una ventaja es que si tenemos una banda de absorción del grupo prostético, y medimos
a esa longitud de onda, solo encontraremos esa proteína, por lo que es una buena forma de que
no te interfieran otras proteínas con la de interés. No exige un gran grado de pureza ni de
purificación.
Lo más interesante de tener grupo prostético es que esta se trata de una molécula orgánica que
está unida a la proteína para que esta sea funcional. El grupo prostético cambia con la función de
la proteína. Cuando se altera la estructura cambiará la espectroscopia, podremos observar estos
cambios que reflejan el funcionamiento de la proteína. Podemos seguir como funciona una
proteína.
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Por ejemplo la hemoglobina, con el grupo hemo. EL grupo hemo es un

grupo con muchos dobles enlaces conjugados, por lo que tenemos
bandas de absorción visible. Lo más interesante podemos tener
hemoglobina o desoxihemoglobina, al tener unido oxígeno, el grupo
hemo cambia sus propiedades espectroscópicas. Nos muestra cambios
en la estructura que significaran cambios en la función.
Podemos utilizar la espectroscopía para saber que fracción de hemoglobina transporta oxígeno,
necesitas trabajar a una longitud de onda determinada (576 nm). A esa longitud de onda sabes
que la desoxihemoglobina absorbe mucho menos que la oxihemoglobina. Buscas cual va a ser la
absorbancia cuando se oxigena totalmente, midiendo el cambio máximo al pasar todas las
moléculas a forma oxi. Para conocer el porcentaje jugamos con las dos referencias que tengamos.
desoxi
A576 − A576
Fracción sitios ocupados =
oxi − A desoxi
A576 576
También se pueden observar asociaciones cinéticas gracias a los cambios de absorción, o

calcular la proporción de metahemoglobina (hemoglobina con Fe3+) en enfermos de
metahemoglobinemia y medir la gravedad de la enfermedad.
Se hace también uso de las propiedades espectroscópicas

para obtener imágenes tridimensionales de los vasos
sanguíneos. Mediante imagen fotoacustica, no se trabaja la
UV-visible, sino que se trabaja en la visión del infrarrojo
cercano. En este son regiones con un épsilon muy
pequeño, pero presentan diferencias entre la oxi y desoxi, y
esta radiación puede penetrar varios centímetros en unos
tejidos. Permitiendo irradiar una muestra que excite la
hemoglobina, absorbiendo y desexcitandose emitiendo
ondas acústicas que son detectadas por un transmisor de ultrasonidos, que es capaz de calcular
de donde provienen esas ondas. Podemos visualizar hemoglobina, en los vasos sanguíneos. Se
pueden reproducir la estructura de los vasos sanguíneos en un tejido in vivo y analizar la
vascularización.
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3.2 Absorción de las ácidos nucléicos en la región UV-visible: aplicaciones
Los cromóforos son los anillos aromáticos de las bases nitrogenadas (estos poseen resonancia
de dobles enlaces, y nitrógeno y oxígenos con electrones en orbitales n). Hacen transiciones de π
a π* (más frecuentes) y saltos de n a π*.
Se muestran los espectros de cada uno, las purinas absorben más que las pirimidinas, pero el
conjunto nos da la característica espectroscópica de los ácidos nucleicos, una banda de
absorción con un máximo a 260 nm.
‣ Comparación de los espectros de absorción de proteínas y ácidos nucleicos
Es muy fácil separar las bandas de proteínas y de ácido nucleico. Estos últimos tienen un a
230 nm y un máximo a 260 nm. Mientras las proteínas poseen un
mínimo a 260 nm y un máximo a 280 nm.
Se utiliza la medida en las dos bandas cuando haces extractos para

obtener una aproximación de la calidad de la muestra. Si es DNA
puro te debe dar 0,5, si se va para arriba es que hay contaminación
de proteínas. Si por el contrario es con proteína debe de haber un
1.7 de radio.
3.3 Factores a tener en cuenta al trabajar con espectros
El primero de ellos es el disolvente, nuestras muestras serán disoluciones.

El hecho de que un cromóforo se disuelva altera sus propiedades
espectroscópicas.
Cuando un cromóforo está en disolución se observa un desplazamiento

del espectro hacia longitudes de onda mayores y un ensanchamiento de
las bandas de absorción.
La primera modificación es que la banda se centra en una longitud de onda más grande, es decir
se desplaza hacia la derecha. Si necesitamos menor energía (mayor λ ) es porque los niveles
energéticos de la molécula están ahora más cercanos, es decir, requieren fotones de menor
energía para que se produzca la excitación de los electrones.
El desplazamiento batocrómico son con longitud de onda más grandes (menos energía), si se
desplaza a landa más pequeñas (mayor energía) se debe a la separación de niveles
(desplazamiento hipsocrómico).
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Todo el espectro a todos los niveles necesitan menos energía. Es por esto por lo que además de
desplazarse se ensancha. Esto se debe a que una banda ahora tiene más heterogeneidad. La
fuente de heterogeneidad al disolver la muestra proviene de la solvatación de las moléculas, por
lo que para un tipo de molécula en concreto encontramos moléculas con un nivel de solvatación
distinto, por tanto ello supone un aumento de la heterogeneidad de la muestra.
‣ Efecto de la conjugación de dobles enlaces en la absorción de radiación UV-visible
A medida que aumenta la conjugación,

la distancia entre el orbital ocupado de
mayor energía y el orbital vacío de
menor energía disminuya. Por eso, el
sistema absorbe a λ mayores, o sea más
hacia el visible. Aumenta de mismo
modo el épsilon ,es decir absorbe más.
Cuando hay una resonancia es más
probable que los electrones se exciten.
‣ Efecto de la polaridad del disolvente o entorno
Aparte de si la moléculas esta pura o disuelta, influye el tipo de disolvente, sobre todo en
relación con la polaridad. Es decir el entorno va a influir, esto es debido a que absorber
radiación lleva asociado un momento dipolar. Ese momento dipolar transitorio va a
interaccionar con los del entorno.
Vamos a tener una carga en movimiento, lo que genera un momento dipolar, que influye ya
que va a interaccionar con los cromóforos y en función de ello se modifica la capacidad de
absorción de la molécula, lo que tiene su repercusión en la desnaturalización o
renaturalización de proteínas.
El triptófano es el aminoácido más hidrofóbico, y siempre se encuentra fuera de contacto con

el disolvente polar. Si desnaturalizas la proteína, el entorno del triptófano cambia, pasa de
estar en los bolsillos hidrofóbicos a estar rodeado de agua, que origina pequeñas
alteraciones en la absorbancia del mismo. Se puede observar en la comparación de la
proteínas en forma nativa y desnaturalizada.
Por regla general con aumento de polaridad la banda se desplaza hacia al azul, si el entorno
es menos polar podemos tener desplazamientos hacia el rojo.
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A. En línea continua se muestra la proteína en

forma nativa, mientras que en línea
discontinua la proteína desnaturalizada al
romper los puentes disulfuro.
B. En línea continua se muestra una proteína
en disolvente acuoso, mientras la línea
discontinua en presencia de colágeno
(capaz de albergar la proteína).
‣ Espectroscopía diferencial
Consiste en comparar dos espectros en una condición sin alterar y en una condición alterada
mediante espectrofotómetros de doble haz. Se registra la diferencia entre dos espectros de
absorción. Son útiles para estudiar cambios espectroscópicos de un cromóforo producidos
por una perturbación del mismo. Se obtiene colocando el soluto tanto en la cubeta de
referencia como de muestra y añadiendo a ésta el agente de perturbación. Se detectarán
bandas si las propiedades espectroscópicas del soluto están afectadas por el agente
perturbador.
Por ejemplo en una proteína pondrías una disolución

de proteínas y en la cubeta de muestra harías una
desnaturalización.
Esta idea la podemos trasladar a muchas situaciones,

no solo proteína nativa-desnaturalizada. Lo podemos
aplicar a otras situaciones donde alteremos el
cromóforo.
‣ pH del medio
Un segundo factor es el pH del medio, ya que altera como absorbe un cromóforo cuando
ese cromóforo tenga un grupo ionizable. Según como este esté el cromóforo tendrá un
espectro de absorción u otro.
El ejemplo más relevante hablando de proteínas es el caso de la tirosina, ya que

presenta un hidroxilo fenólico (ácido débil) de manera que puedo ionizarse a
ion tirosinato. El tirosinato tiene un máximo a 295 nm donde la tirosina no
absorbe nada.
Podemos ver la ionización de tirosina.
Cuando la tirosina esté protonada su absorbancia a 295 nm va a

ser nula, mientras que si está desprotonada vamos a tener un
máximo a esa longitud de onda. Llegaremos a un pH
suficientemente alto para que toda la tirosina se haya oxidado a
tirosinato. La ionización de tirosina nos permite calcular el pka de
ese grupo ionizable, mediante la ecuación de Henderson-
Hasselbalch:
[ Acido ]
Base
pH = pKa + log
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Cuando la concentración es 1:1 obtenemos el pka. Lo importante es el

punto medio de la transición, cuando empieza desde cero la mitad es la
absorbancia máxima / 2.
De la misma forma esta propiedad nos permite calcular la accesibilidad

de las tirosinas en las proteínas, simplemente viendo cómo cambia la A295
al ir aumentando el pH por la aparición de iones tirosinato. Pudiendo distinguir entre las Tyr
en la superficie y Tyr internas que sólo se ionizan cuando se despliega la proteína.
Tenemos una proteína y vamos a medir absorbancia a 295. En la curva azul, cuando llegas al
pH 9.5 (pka) se observa como aumenta la absorbancia, se observa la ionización de esas
tirosinas.
La curva roja comienza a incrementar a un pH alrededor de 11. A ese pH lo que ocurre es

que se desnaturaliza la proteína. Indicando que
las tirosinas no estas accesibles para ionizarse,
solo se ioniza cuando deshaces la estructura de
la proteína.
La situación más habitual es la verde, es decir

algunas accesibles al entorno, pero que otras no
lo sean.
‣ La orientación de los cromóforos
En las macromoléculas biológicas el tercer factor más relevante es la orientación de los

cromóforos, ya que eso va a originar interacciones entre ellos.
Teniendo en cuenta que la absorbancia es una magnitud aditiva; si tienes un polímero

esperas que absorbe la suma de lo que absorbe cada monómero. A veces no pasa esto y hay
polímeros que absorben más, viendo lo que se absorbe en los monómeros y al contrario
(que el polímero absorba menos). Por eso podemos diferenciar en:
- Efecto hipercrómico. Una molécula polimérica absorbe más de lo que absorben el

conjunto de sus monómeros por separado.
- Efecto hipocrómico. Una molécula polimérica absorbe menos de lo que absorben el

conjunto de sus monómeros por separado.
Ejemplo de proteínas. Como cambia la absorbancia en función de la

estructura secundaria. El cromóforo es exactamente el mismo, pero la
estructura de hoja Beta absorbe más que la hélice alfa.
‣ Efecto hipocrómico del DNA
Si tenemos el DNA en disolución observamos una banda de absorción a 260

nm. Sin embargo si pasamos de una doble hélice a una hélice simple, se
aumenta la banda de absorción de la muestra. Y además, si lo hidrolizamos,
aun teniendo la misma cantidad de nucleótidos y con la misma
concentración, van a absorber más estando libres.
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El efecto hipocrómico se debe a las bases nitrogenadas. Cuando empaquetamos las bases
nitrogenadas en el DNA van a tener menos capacidad de absorción que si están liberadas. Si
una base absorbe momento dipolar que dificulta que las bases del entorno pueden
absorber también radiación.
Si desnaturalizamos el DNA, obteniendo una simple cadena, las

bases no van a estar apiladas y el efecto del momento dipolar afecta
a menos bases (por tanto absorben más), mientras que si están
liberadas, el momento dipolar no afecta a ninguna base y su
capacidad de absorción aumenta.
El efecto hipocrómico se utiliza en las curvas de naturalización del

DNA, midiendo a 260 al aumentar la temperatura, ya que la
temperatura de fusión depende de la composición de pares de
bases G-C, y esta se alcanza cuando tenemos 50-50 de DNA de
doble cadena y simple cadena.
‣ Efecto de la interacción de ligandos con DNA
La unión de ligandos a proteínas y DNA puede originar cambios espectrales en los

cromóforos de las macromoléculas o del ligando que pueden ser utilizados para estudiar la
afinidad y las características de dicha interacción.
Ejemplo. Las antraciclinas, drogas antitumorales, moléculas planas

que se intercalan entre los pb y bloquean la función de DNA.
Con una muestra de daunomicina (absorbe entorno a 500nm), si

añadimos cantidades crecientes de DNA se ve cómo se modifica el
espectro de daunomicina, absorbiendo menos la disolución de
daunomicina y DNA que la de sólo daunomicina, ya que al
intercalarse en el DNA se produce una especie de efecto
hipocrómico y absorben menos.
Esto permite estudiar la afinidad de las antraciclinas con

DNA, y estudiar el efecto de los ligando de DNA sobre la
estabilidad de la doble hélice, mediante curvas de
desnaturalización (con ligandos cuesta menos separar la
doble hélice y se desnaturaliza a temperaturas más bajas,
mientras que si los ligandos refuerzan la doble hélice, la
temperatura de desnaturalización sería más alta.
constante de afinidad, diferentes variedades de interacción y optimizar el comportamiento.
3.4 Ensayos enzimáticos
La aplicación de la espectroscopía para medir la actividad enzimática es el denominado ensayo

enzimático. Encontramos de dos tipos:
‣ Directos. Se mide la absorbancia de un sustrato o producto.

‣ Indirectos. Se transforma un producto en un compuesto medible. Puede ser:
- Discontinuos. Se realiza en dos pasos.
- Continuos (reacciones acopladas). Se realiza en un paso.
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‣ Ensayos directos
La situación más ideal es que algún sustrato o producto tenga unas

propiedades espectroscópicas especiales que nos permita seguir su
evolución. Se miden normalmente ensayos en enzimas metabólicas para
medir sus actividades o concentraciones de metabolitos, entre otros.
Un ejemplo son los ensayos de reacciones con deshidrogenasas dependientes de NADH o
NADPH, que catalizan reacciones redox, y son útiles debido a las características de este
coenzima. El NAD+ (o NADP) es un nucleótido de adenosina
y nicotinamida, que absorbe a unos 260nm, en ambas
formas, debido a la absorción de las bases nitrogenadas de
la adenina. Cuando cambia a NADH (o NADPH) cambian
sus propiedades espectroscópicas, teniendo este último
una banda a 340 nm que en NAD+ no se aprecia, por tanto,
si medimos a esa longitud de onda solamente se va a
detectar la absorbancia de NADH, que nos permite seguir
el desarrollo de la reacción.
Esto es una ventaja ya que en la reacciones donde intervengan

deshidrogenasas que utilicen NADH, tenemos un factor que podemos
medir. Pudiendo medir exactamente una molécula concreta.
Esto es lo que se hace en estos dos ensayos. Ensayo de lactato

deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa. La transformación
de Lactato a piruvato se realiza mediante una lactato
deshidrogenasa, que tiene NADH como producto. En este caso
se sigue fácilmente la absorbancia , ya que a tiempo 0 no va a
haber absorbancia y va air creciendo con el paso de la
reacción. Lo mismo ocurre con la reacción de transformación
del etanol a acetaldehído mediante la alcohol deshidrogenasa.
Hay enzimas de las que no se tiene el conocimiento suficiente

de las reacciones que catalizan. Una alternativa es diseñar sustratos artificiales para investigar
esos enzimas. Por ejemplo ensayo de tripsina, la tripsina es una proteasa que corta el enlace
peptídico después de una arginina, por lo que se ha creado la molécula BAPNA, pudiendo
obtener un producto amarillo. En este caso se mide la absorbancia a 405 nm, pudiendo
seguir la reacción. Lo mismo sucede con la fosfatasa alcalina.
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‣ Ensayos indirectos
No siempre vamos a tener algo medible en la reacción enzimática, cuando no tenemos ni

sustratos ni productos que nos permitan medir la absorbancia, vamos a generar el
compuesto medible, transformando el producto en un compuesto X, esto de denomina
ensayos enzimáticos indirectos. Hay que tener varias precauciones ya que no puede afectar a
la reacción enzimática, por ejemplo, no puede actuar como inhibidor.
Antiguamente esta etapa se hacía de manera discontinua, primero S se

transforma en P, se paraba la reacción inactivando el enzima y se añadía lo
necesario para transformar P en X, siendo X perfectamente medible. Ahora
se suele realizar de manera continua, es decir, que en la reacción tienes
todo lo necesario para transformar P en X simultáneamente. En este último
caso tenemos además otra segunda precaución, al
añadir la segunda reacción este segundo paso tiene que
estar muy favorecido de manera que cuando veamos una cinética de este
proceso, tiene que reflejar la cinética de la primera reacción, es decir la
primera reacción debe ser la etapa limitante. Por eso se optimiza la
segunda reacción. Muchas de las reacciones acopladas es añadiendo
deshidrogenasas dependientes de NADH.
Un ejemplo es el ensayo de la aspartato aminotransferasa. Una reacción en la que el

aspartato y el 2- cetoglutarato se convierten en oxalacetato y glutamato, ninguno de los
productos ni reactivos poseen propiedades espectroscópicas, por lo que se utiliza la malato
deshidrogenasa, capaz de reducir oxalacetato a malato, utilizando NADH, el cual es medible
a 340 nm. De la misma forma ocurre en el ensayo de la piruvato quinasa.
‣ Estudio de la cinética de una reacción enzimática
Es un estudio que pretende la determinación de los parámetros cinéticos,

es decir Vmax y KM. Para saber cómo cambia la velocidad de reacción (cómo vo =
d[P]
=−
d[S ]
dt dt
aumenta la concentración de producto con el tiempo o disminuye la de
sustrato) y la afinidad de la enzima por el sustrato.
Utilizamos la ecuación de Michaelis-Menten, siendo Vmax la K2 por la concentración de

enzima; y KM igual a la suma de K2 y K-1entre K1. La velocidad máxima se produce cuando la
enzima ha alcanzado su punto de saturación, y de ahí definimos KM, que es la velocidad de
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sustrato a la que la velocidad es la mitad, por tanto KM pequeñas indican que la enzima
funciona de manera más eficiente.
Para obtener eso utilizamos reacciones con distinta concentración de sustrato y observamos
que velocidad tiene midiendo los cambios de sustrato y producto con el tiempo a través de
la absorbancia y aplicando Lambert-Beer. Para conocer los parámetros, podemos utilizar la
aproximación de dobles inversos, la cual nos proporciona la linealización de la ecuación de
Michaelis-Menten, siendo la ordenada ene l origen la inversa de la Vmax y la abscisa en el
−1
origen igual a .
KM
Vmax[S ]
Vo =
Km + [S ]
1 K 1 1
= m +
Vo Vmax [S ] Vmax
El producto ha de ser medido con una absorbancia a

una longitud de onda determinada para que nos
permite diferenciarlo, siendo la velocidad el incremento
de la absorbancia partido del tiempo, y aplicando
Lambert-Beer se cambia ese valor de la absorbancia a
diferentes concentraciones, lo que nos permitirá saber
la velocidad. Es una velocidad indirecta. Si aplicamos
Lambert-Beer a esta pendiente, nos queda la velocidad
en forma de M7s, convirtiendo así la absorbancia en
Δ[P ]
concentración. V0 = .
Δt
Se pueden realizar ensayos con un inhibidor que compite con el sustrato por el sitio de unión
en la enzima, es decir reacciones con inhibición competitiva. Se llevan a cabo dos ensayos,
uno con inhibidor y el otro en condiciones normales, midiéndose la absorbancia en ambos.
Con los datos de las cinéticas se hacen dobles inversos y se puede calcular Ki.
En la inhibición competitiva, la velocidad máxima no varía. Esto es debido a que la propia

definición se muestra como la velocidad a las que todas las moléculas de enzima están
saturadas de sustrato, solamente va a
requerir una mayor concentración de
este para alcanzar dicha velocidad. Lo
que altera es la KM, aparentemente el
enzima parece que una peor el
sustrato, pero no ha cambiado nada
que cambie la interacción real del
sustrato. Si une menos sustrato, tiene
menos afinidad aparente, por tanto la
KM es mayor que al real en ausencia de
inhibidor), y se denomina constante de
ap
Michaelis aparente KM , que va a estar
relacionada con la constante de
inhibición.
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‣ Determinación de la cantidad de enzima
Una segunda utilidad es usar esos ensayos y medidas de absorbancia para cuantificar
cantidad de enzima.
Si voy a medir una velocidad de reacción enzimática y quiero saber la cantidad de enzima,
para ello necesitamos que la concentración del sustrato sea mucho más alta que el enzima
([E]<<<[S]). Si una reacción trabaja en esas condiciones la velocidad máxima es la K2 (o kcat)
por la cantidad de concentración de enzima (V0 = Vma x = kcat ⋅ [E ] ). Lo que tenemos es una
velocidad de reacción directamente proporcional a la cantidad de enzima. Viendo la
velocidad que te da sabes cuánto enzima tienes.
Muchas veces no quieres buscar cantidad exacto sino comparar muestras.
‣ Determinación de la concentración de un metabolito
La tercera aplicación es usar el ensayo enzimático para cuantificar un sustrato (un metabolito
de interés) para ello usamos una reacción enzimática que utilice ese metabolito. Buscamos
acoplar una reacción para que dé un compuesto de un color y poder medir cuanto
compuesto coloreado aparece en tu ensayo enzimático.
Un ejemplo es el empleo de la peroxidasa con el peróxido de hidrógeno (H2O2) como

agente oxidante. Cuando con la acción de la peroxidasa el peróxido se reduce a agua,
podemos añadir un agente reductor como la 4-aminoantipirina (en presencia de fenol) que
al ser oxidado absorbe una longitud de onda a 505 nm. Acoplar esta reacción a otras como
transformación de glucosa a gluconolactona mediante la glucosa oxidasa nos permite
calcular la cantidad de glucosa que se transforma. Lo mismo para el ácido úrico.
La manera óptima de llevar acabo

estos ensayos es la precaución,
buscas intentar llevar la reacción a
término, es decir que consumas
toda la glucosa que hay en la
muestra. Estrategias para llegar a
término como tiempo largo y
condiciones de arrastre que
consigan facilitar su terminación.
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‣ Enzimunoensayos: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Para acabar con ensayos enzimáticos hay que hablar de un tipo de ensayos enzimáticos
especiales que van asociados al uso de anticuerpos. Es una manera de cuantificar moléculas.
Estas técnicas son poderosas como ensayo ya que combinan los ensayos enzimáticos de alta
sensibilidad con la alta especificidad de un método inmunológico antígeno-anticuerpo.
Se requiere un anticuerpo específico contra la molécula que se va a cuantificar, y luego tener
unido covalentemente una enzima para disponer de un ensayo enzimático, de esta formar
podremos realizar un ensayo enzimático ya que tendremos
productos con algo fácil de medir. Actualmente, es más
frecuente generar ensayos en los que en vez de generar algo
que absorbe generar luminiscencia o emisión de fluorescencia.
Estos son muchísimo más sensibles.
Originalmente, en la versión más básica de ELISA, se tiene la

muestra a la que se aplica un anticuerpo específico, que lleva
un enzima conjugado y se mide la reacción enzimática
mediante el ensayo enzimático. Te da una alta sensibilidad, ya
que por cada molécula detectada, genera muchas moléculas
de productos medibles por la amplificación del enzima. Se
suele utilizar para cuantificar metabolitos o compuestos de
interés. Se está cuantificando estrictamente cuánto enzima hay,
para globalmente en el experimento, calcular cuánto
metabolito de interés hay.
Rápidamente se cambió a una estrategia tipo sándwich, pegando

el anticuerpo, que solo se reconoce a la molécula de interés y con
el enzima conjugado realizar el ensayo enzimático.
Actualmente se realiza la técnica de ELISA indirecto, que tiene una

estrategia basada en el uso de dos anticuerpos: el anticuerpo
primario, que reconoce la molécula de interés, y el anticuerpo
secundario, que reconoce inmunoglobulinas (en este caso el
anticuerpo primario) y que lleva conjugado la enzima que lleva a cabo el ensayo (son
comodines, conjugados a peroxidasas u otras enzimas). Con una curva patrón donde se tiene
el metabolito a concentraciones conocidas, se hace ELISA y se saben los datos luminiscentes
o del método empleado, se interpola y se cuantifica la molécula.
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3.5 Colorimetrías
Colorimetría se refiere al cálculo de la concentración de una sustancia a partir de la absorbancia

de un cromóforo coloreado obtenido por la transformación de la misma. En un extracto hay
muchas sustancias que interfieren la absorbancia a 280 nm, por lo que se utiliza esta técnica.
Vamos a generar un compuesto coloreado que refleje cuanta proteína hay.
‣ Método del BCA (ácido bicinconínico)
Dos pasos:
I. El primer paso es la reducción de biuret, que consiste en

la reducción de Cu2+ a Cu+ en medio alcalino por los
enlaces alcalinos.
II. En un segundo paso el Cu+ se une a dos moléculas de
bicinconino y da un color púrpura.
El patrón más habitual es la BSA. Con ese patrón de proteínas concentraciones conocidas y
tus muestras problemas obtienes una curva patrón.
‣ Método de Bradford
La asociación de azul brillante de Coomasie G-250 a

proteínas desplaza el máximo de absorción del
pigmento desde 465 nm (marrón) a 485 nm (azul).
Este se pega al esqueleto de la proteína y cambia su
espectro.
4. Espectroscopía de infrarrojo
En estas técnicas trabajaremos en la región del infrarrojo. Esta se divide en el cercano (780-2500nm),
intermedio (2500-50000 nm) y la lejana (50000-100000 nm). La espectroscopia infrarroja tradicional
trabaja en el infrarrojo intermedio y se utiliza el número de ondas, para manejar valores más
pequeños.
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4.1 Espectros de transiciones vibracionales
El rango de energía de la radiación infrarroja implica la

excitación de las moléculas entre niveles de energía
vibracional (transiciones vibracionales). Los cambios en
niveles de energía vibracionales implican paquetes de energía
cuantizada más reducidos que los del UV-visible.
Analizaremos como vibran los enlaces e intentaremos inferir
información, muchas veces sobre conformación.
Consideramos el enlace como un muelle. Cuando está en reposo, se encuentra quieto y estable,
al estirar el muelle y soltarlo vuelve al estado de equilibrio oscilando. Vibra oscilando, cambiando
esa distancia.
4.2 Los enlaces como oscilador armónico
Cuando tenemos dos bolas de masa m1 y m2 conectadas por un muelle al soltar vuelve a la
posición de equilibrio mediante un movimiento oscilatorio con una frecuencia propia de cada
muelle, vuelve con un movimiento de oscilador armónico. Esa oscilación va marcado con una
frecuencia de oscilación:
1 k
ν=
2π μ
Asimilamos nuestro enlace a esa situación. El enlace vibrará con esa fórmula y será dependiente
de la energía de enlace (k) y de la naturaleza de los átomos que une (μ).
( 2 )
n+1
Las reglas cuánticas determinan como va a vibrar, que niveles de energía E= hν
vibracional van a ser posibles.
Si se pretende absorber radiación para pasar de un nivel a otro, se

requiere de una energía concreta que separa los dos niveles: ∆E = h ·
v (relación de Planck- Einstein). Para que se produzca la absorción
necesitaremos fotones cuya energía coincida con el ∆E entre niveles
y se dé la condición de resonancia, es decir, v = v’ (condición de
resonancia)
Las moléculas absorben fotones solo cuando tenga la energía la

frecuencia correspondiente.
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Esta aproximación nos sirve para explicar la absorción de radiación infrarroja. Sin embargo, los
enlaces no se comportan como osciladores armónicos sino anarmónicos. Se desvía del
comportamiento del oscilador armónica, para darnos las cucharas, con nombre técnico de curva
de Morse. En los átomos hay un elemento extra que hace que se desvía el oscilador armónico,
dándonos la curva de Morse. La diferencia fundamental ocurre a niveles de energía más altos. Los
saltos no son constantes, sino que cada vez es más pequeño. Además la oscilación no es
simétrica.
( 2 ) vib
1
Evib = h V + ν
[( ) ( 2) ]
1 1
Evib = h V+ νvib V + Xcνvib
2
Como ya sabemos, la frecuencia de vibración varía según las instauraciones y la naturaleza de los
átomos que conforman el propio enlace. A mayor fuerza de enlace (k), más frecuencia de
vibración y más energía hace falta para la transición vibracional .
En la tabla vemos como afecta que sea un enlace simple, doble o triple en la absorción de
radiación infrarroja. Si vibra con mayor frecuencia absorberá radiación infrarroja con mayor
número de ondas. La frecuencia es directamente proporcional al número de ondas.
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Si cambiamos la masa reducida pero no cambiamos la fuerza del enlace (como cuando usamos
isótopos). A mayor masa menor frecuencia de vibración y menos energía hará falta para la
transición vibracional.
‣ Tipos de vibración de enlaces en moléculas poliatómicas
Podemos dividir las vibraciones del enlace en dos tipos:
๏ Stretching vibrations. Las vibraciones de estiramiento (modelo de muelle), en las que

cambia la distancia de enlace.
๏ Bending vibrations. Vibraciones en el ángulo de enlace. Vibraciones con deformación

del ángulo sin cambio de la distancia.
‣ Modos activos e inactivos de vibración en el infrarrojo
Para que tengamos bandas, es decir para que un modo de

vibración sea activo en el infrarrojo, es esencial que la manera a
de vibrar origine cambios en el momento dipolar, si no se
producen esos cambios se dice que la vibración no es activa en
el infrarrojo ya que no da lugar a una banda.
Una molécula apolar, aunque se excite, no se va a detectar bandas en el IR midiendo su

absorbancia, mientras que una molécula con un momento dipolar, al estirarse el enlace sí
que cambia el dipolo, y da lugar a una banda en el IR.
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4.3 Espectros de absorción IR
En el infrarrojo se basa en una información estructural. Es más complicado obtener las medidas
ya que a veces vamos a hacer un uso semi-cuantitativo.
Esta dado la vuelta porque no se trabaja con absorbancia sino con la transmitancia. Se representa
transmitancia frente a número de onda. El eje x está en ascendencia al revés, se hace así para
que tenga el mismo significado que la longitud de onda (como son inversos).
Se mide la transmitancia ya que los enlaces son super abundantes, y no se cumple la ecuación de
Lambert- Beer. La absorbancia está hecha para tener una relación directa. Por ello la
interpretación no es cuantitativa. Las bandas se catalogan como como fuertes (s), media (m) y
débiles (w).
Se conoce la absorción IR asociada a la vibración de los enlaces presentes en los grupos

funcionales de moléculas orgánicas. Se puede interpretar las moléculas mediante el estudio
enlace a enlace mediante las bandas de absorbancia en el IR, pues una molécula es la
combinación de las bandas de enlace.
Así pues, en la Química Orgánica se ha hecho mucho uso

de las espectroscopía IR, pues permite identificar diferentes
grupos funcionales de un determinado compuesto a partir
del patrón de vibración de los distintos enlaces. A nivel de
proteínas y ácidos nucleicos no es posible hacer este tipo
de aproximaciones.
Ejemplo: Etanol
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‣ Medida de la absorción IR
Medimos en espectrofotómetros del infrarrojo. Pero tenemos un inconveniente, el problema

principal que hace que esta espectroscopia sea más complicada en biología es que no se
puede gastar agua ya que esta absorbe mucho en el infrarrojo. Lo que te puede interferir al
comportamiento de las moléculas. El agua produce mucho ruido, ocultando los datos de las
moléculas de interés.
Por tanto, para la preparación de muestras, se gastan otras opciones como disolventes
orgánicos (Cl4C o Cl3CH), muestras sólidas (pastilla o película) y espectros H2O / D2O.
Para un químico orgánico puede utilizar disolventes que no sean agua. La solución para los
bioquímicos es trabajar con muestras sólidas, por lo que ya no podemos tener disoluciones.
Estas muestras serán o una pastilla o una película sólida. Las pastillas se forman con bromuro
potásico. Las películas son fluoruro de calcio.
‣ Espectroscopía de absorción IR tradicional
El espectrofotómetro IR presenta la estructura básica del espectrofotómetro de UV-visible.

Necesita de una fuente de radiación de cerámica caliente (no lámpara) que emite radiación
en el infrarrojo. Un sistema monocromador, que puede ser un prisma o una rede de
difracción de sales inorgánicas como NaCl (no vidrio) para obtener una radiación
monocroma. Una cubeta de sales (NaCl, CaF2, AgCl) para nuestra muestra sólida. Para la
detección de radiación se utiliza un termopar, un dispositivo que detecta el calor de la
radiación IR (no se puede emplear fotomultiplicadores ya que la radiación IR no cuenta con la
energía suficiente para arrancar electrones).
Estos son los espectrofotómetros originales, y suponían grandes problemas. El termopar es

de poca sensibilidad y genera medida con mucho ruido, por lo que se tendría que repetir
varias veces el proceso.
‣ Espectroscopía de absorción IR con transformada de Fourier (FTIR)
El espectrofotómetro de absorción IR con transformada de Fourier supuso un gran cambio.

Ya no se emplea el sistema monocromador, pues se deja de medir el comportamiento de
absorción mediante radiación monocromada, y se estudia el comportamiento a cada
longitud de onda. LA fuente de cerámica caliente irradia radiación policromática, que se
altera con el tiempo, y se mide la radiación policromática transmitida.
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También se introdujo el interferómetro de Michelsen, que genera interferencias en la

radiación (idea similar a la rede de dispersión), pues actúa como un divisor de haz. El haz se
divide en dos direcciones, ya hay dos espejos que reflejan la radiación, y por tanto, vuelven a
unirse en el mismo punto de división. Uno de los espejos es móvil (moving mirror), de modo
que los haces al encontrarse pueden generar diferentes interferencias que forman una
radiación policromática particular. Si el espejo móvil se encuentra a la misma distancia que el
espejo fijo, las haces se encuentran en fase (interferencia constructiva), mientras que si el
espejo se encuentra a diferente distancia, las haces se encuentran en desfase (interferencia
destructiva). El interferómetro genera un conjunto de radiaciones que cambia con el tiempo,
según la longitud de onda y la distancia del espejo móvil, y a partir de los datos se genera un
interferograma.
Una función compleja se puede representar como la suma de funciones periódicas simples
de diferentes frecuencias. Mediante el uso de este concepto, los interferogramas se pueden
convertir mediante la transformada de Fourier en espectros de absorción que proporciona
un resultado más estándar. Consiste básicamente en descomponer funciones complejas del
interferograma y estudiar la absorción de la muestra a cada longitud de onda.
El espectrofotómetro de absorción IR con transformada de Fourier es un método mucho más

sensible, que permite llegar al espectro de absorción de forma más rápida y barata.
4.4 Absorción de las proteínas y los ácidos nucleicos en el infrarrojo: aplicaciones
‣ Proteínas
Las bandas de absorción más características de proteínas son las de vibración del enlace
peptídico. Se distinguen dos bandas:
๏ Amida I. Estiramiento de C=O

๏ Amida II. Cambio de ángulo de enlace N-H
BCB 31 de 36

Los grupos implicados en el enlace peptídico forman los puentes de hidrógeno en las
estructuras secundarias de las proteínas. La vibración de los enlaces se ve influenciado por la
formación de esas interacciones que determinan la estructura secundaria, lo que permite
distinguir la formación de una α- hélice o una hoja β.
En función de la estructura secundaria adoptada, las vibraciones de amida I y amida II son

diferentes, y la comparación de los parámetros de los enlaces implicados permite distinguir
la estructura secundaria.
El dicroísmo IR se aplica al estudio de estructura secundaria de polipéptidos, ya que el

efecto dicroico observado es diferente según la estructura.
El dicroísmo se refiere al hecho de que la absorción de radiación por una molécula varía en
función del ángulo con el que incida la radiación. La absorción de radiación por una
molécula necesita de una energía concreta, y además de un ángulo concreto de radiación.
En dicroísmo lineal se aprovecha esta propiedad irradiando muestras orientadas con luz
polarizada en un plano. Si las moléculas de una muestra están orientadas en una sola
dirección se obtendrán diferentes espectros de absorción en función de la dirección de la
radiación incidente. A partir de una muestra se irradia con radiación paralela y perpendicular
a las transiciones de las moléculas polarizadas, y se obtienen diferentes vibraciones entre un
plano de radiación y otro. Este tipo de técnica se aplica generalmente a proteínas fibrilares.
BCB 32 de 36
Si ordenamos las estructuras α-hélices o hojas β en una

dirección paralela a la luz polarizada, se puede hacer el
efecto de dicroísmo para analizar amida I y amida II, ya
que ambas van a estar en orientaciones difernetes. En
una α-hélice, amida I es máxima (paralelo) mientras que
amida II es mínima (perpendicular). En una hoja β,
amida I aborbe el mínimo y amida II al máximo.
Si ordenamos las estructuras α-hélices o hojas β en una

dirección paralela a la luz polarizada, los resultados son
lo inverso. En una α-hélice, amida I es mínima mientras
que amida II es máxima. En una hoja β, amida I absorbe
lo maximo y amida II al mínimo.
Con ello, se puede discernir qué estructura secundaria,

y además también se podría observar la inclinacion de
las estructuras en una bicapa lipídica.
‣ Intercambio isotópico H2O/D2O
El Intercambio isotópico H2O / D2O consiste en la

sustitución H (hidrógeno) por su isótopo D (deuterio). -O – H
Los átomos de H unidos a átomos con pares -S – H

electrónicos presentan cierto carácter positivo por la
-N -H
diferencia de electronegatividad de los átomos a los
H
que se une (-OH, -SH, -NH, benceno), y tienen cierta
tendencia a sufrir intercambio con los protones del
disolvente. Cuando la muestra está disuelta, existe un
intercambio entre los átomos de H del enlace y los
átomos de H del entorno. De modo que si la muestra
se disuelve en agua desterrada, los átomos de H se
cambian por átomos de D. Como consecuencia, la
naturaleza del enlace se mantiene igual, pero la masa
se reduce y cambia la frecuencia a la que vibra el
enlace (frecuencias más bajas), lo que origina un
desplazamiento de las bandas del espectro a número
de onda menores. Cuando hay una mezcla en la que el intercambio sea intermedio, se
presentas bandas referidas a H y otras referidas a D.
‣ Ácidos nucleicos
En los ácidos nucleicos, las bandas de absorción más características son las de vibración del
enlace C=O (guanina, timina, uracilo) y C-N (adenina, citosina) de las bases nitrogenadas con
valores de número de onda entre 1600 y 1700 cm-1. Estos grupos intervienen en la formación
de puentes de H por lo que la frecuencia de vibración se altera según la estructura
secundaria .
BCB 33 de 36
La vibración de estos grupos permite el análisis de tautomerías, que pueden originar

apareamientos incorrectos, diferentes a los del Modelo Watson y Crick. Para ello se emplea el
espectro IR, detectando los cambios producidos en el espectro de absorbancia, ya que, en
función de la forma tautomérica que presente, la vibración es diferente.
Permite estudiar los fenómenos de amino/imino con adenina y citosina; y la otra tautomería
cetonólica con timinas y guaninas.
4.3 Otras formas de espectroscopía vibracional
‣ Espectroscopía Raman
Hay otra espectroscopia que nos permite estudiar esos cambios vibracionales, y es la
espectroscopía Raman. La espectroscopía Raman se basa en la dispersión de radiación, no
en la absorción. La radiación incidente al interaccionar con la muestra cambia la dirección de
la radiación. Medimos la luz dispersada.
๏ Dispersión elástica o de Raleigh es decir que la radiación

no se altera, el único cambio es la dirección. La radiación
dispersada tiene la misma v que la radiación incidente.
๏ Dispersión inelástica o de Raman. Hay un pequeño

porcentaje de dispersión en el que sí que hay
transferencia de energía entre moléculas y radiación, en
Detector
esta la radiación se ha alterado. La radiación dispersada

tiene distinta v que la radiación incidente.
El ∆E entre la radiación incidente y Raman corresponde a

Láser
transiciones vibracionales: la espectroscopía Raman
estudia transiciones vibracionales, aunque la radiación
utilizada suele ser visible.
En este espectroscopia se gasta una radiación muy

potente, ya que la probabilidad de dispersión Raman es
muy pequeña. Se irradia la muestra, y parte de la
radiación se dispersa, que llega a detectores en posición
perpendicular a la radiación incidente. Además, para detectar el cambio energético, se
realiza un análisis mediante el monocromador, que compara los cambios producidos. En este
caso, el agua no genera ruido, y por tanto no impide trabajar con muestras disueltas en agua.
Se obtienen los mismo comportamientos que el IR, pero en disoluciones acuosas (ventaja
bioquímica).
BCB 34 de 36
En un detector se analiza la radiación dispersada que ha cambiado su energía y ello se

representa en función de la energía incidente para comparar. Los cambios producidos se
producen cuando aumenta la energía en paquetes de energía vibracional, paquetes Stokes,
o la pierden, paquetes anti-Stokes. Los saltos Stokes son más probables, puesto que las
moléculas suelen estar en su estado basal (nivel 0), y por tanto, es más probable aumentar la
energía.
En el espectro Raman se obtienen bandas que representan saltos vibracionales iguales a los
que se pueden observar en espectros de IR, cambiando las intensidades relativas al basarse
en fundamentos fisicoquímicos distintos.
‣ Microespectroscopía FTIR y aplicaciones biomédicas
Se han desarrollado sistemas de imagen basados en espectroscopía

FTIR o Ft-Raman que permiten estudiar la composición bioquímica
en muestras de células y tejidos.
A partir de cortes histológicos y técnicas de espectroscopía IR con

transformada de Fourier, se obtienen mapas de riqueza biológica de
biomoléculas (lípidos, carbohidratos, proteínas), cuyos patrones de
absorbancia son distintos. Se pueden obtener medidas de IR en
tejidos vivos, ya que la radiación IR puede penetrar unos
centímetros en los tejidos y ver respuestas.
BCB 35 de 36
La espectroscopía IR y Raman también se aplica en diagnosis. Se pueden obtener mapas de

muestras de diferentes tejidos para encontrar correlaciones de muestras sanas y enfermas, e
identificar las diferencias o determinar el grado de enfermedad. Se aplican en la
caracterización y diagnóstico de tumores.
Además también sirve en estudios de enfermedades neurológicas como el Alzheimer
(diagnóstico de forma temprana detectando placas amiloides) o las enfermedades de
priones (enfermedades de las vacas locas o enfermedad de scrapie), y la caracterización de
cepas patológicas (identificación de presencias en muestras comparando y encontrando
diferencias.
BCB 36 de 36

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2º Grado en Bioquímica y Ciencias Biomédicas

Facultad de Ciencias Biológicas

Reservados todos los derechos.

Métodos en Bioquímica (I)

TEMA 1: Espectroscopía de absorción

1.1 Introducción a la espectroscopía

Técnicas que se basan en el estudio de a interacción de la radiación

Hay numerosas técnicas espectroscópicas:

- Espectroscopía de absorción UV-visible

๏ Absorción: parte de la radiación incidente es absorbida por las moléculas; la radiación

๏ Emisión: las moléculas emiten la radiación electromagnética absorbida como una

Una radiación electromagnética es la propagación en

El campo eléctrico se propaga oscilando en el espacio. El

Luz polarizada en un plano Luz circularmente polarizada

‣ Parámetros de la radiación electromagnética

Distancia entre dos puntos con el mismo vector campo

Número de oscilaciones por unidad de tiempo. Cuantas ν (s-1)

Número de oscilaciones por unidad de longitud. 1

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La radiación electromagnética tiene una doble naturaleza, ondulatoria y corpuscular:

La energía de los fotones de una radiación es

Número de fotones que atraviesan una unidad de

‣ Espectro de radiación electromagnética

En el espectro de radiación electromagnética vemos radiaciones de alta energía como los

1.3 La energía de las moléculas

La energía total de una molécula es la suma de distintos componentes:

Etotal = Etraslacion + Erotacion + Evibracion + Eelectronica + Espinelectronico + Espinnuclear

Todos los parámetros de la radiación electromagnética están relacionados por

si lees esto me debes un besito

‣ La energía electrónica y vibracional

Los niveles electrónicos se representan en forma de cuchara y los niveles vibracionales

En una molécula diatómica se representa la energía frente a la distancia

Cuando se produce una vibración está cambiando la distancia entre los

1.4 Absorción de radiación

Una molécula en estado fundamental puede tener dos

En la transición vibracional, hay un salto de moléculas entre niveles de

Sorteamos 50 abonos para el festival Zevra ¿Te unes? ¡Clic aquí!

En la transición electrónica, hay un salto de moléculas entre niveles de energía electrónicos,

- Transiciones electrónicas en capas internas o átomos → Espectroscopía Rayos X

2. Espectroscopía de absorción UV-visible

2.1 Transiciones electrónicas

El rango de energía de la radiación UV-visible implica la excitación de

La energía electrónica es la energia que deriva de la conﬁguración electrónica que tiene la

- Orbitales σ: Forman el enlace sencillo.

- Orbitales π : Fusión de orbitales pi perpendiculares al plano del enlace

- Orbitales n : Átomos que tienen los π ocupados por electrones y no

La distribución de los electrones en los orbitales de menor energía (enlazantes)

2.2 La Ley de Lambert-Beer

La muestra biológica en disolución se irradia una radiación

La expresión correspondiente para muestras en disolución es:

ε → Coeﬁciente de extinción o absorción (M-1 cm-1)

- ε 1M (coeﬁciente de extinción molar): M-1 cm-1

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Se miden dos magnitudes para seguir el proceso de absorción: la transmitancia y la absorbancia.

‣ La transmitancia es el porcentaje de luz transmitida por la muestra.

La relación entre la transmitancia y la absorbancia es la siguiente, y

Un compuesto con un alto valor de coeﬁciente de extinción es muy eﬁciente en la absorción de

si lees esto me debes un besito

La absorbancia es una magnitud aditiva. Al trabajar

➡ Fuente de radiación (lámpara). Actúa como fuente de radiación electromagnética.

Emiten radiación electromagnética, a partir de la cual se selecciona

Necesitamos seleccionar radiación de una sola longitud de onda,

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