Trabajo práctico N° 1

ALUMNO: Julio Ochoa

BIOTECNOLOGIA 1º año - 2023
Objetivo:

Elaboración de una curva de calibración. Construcción de la curva: relación concentración de

analito y señal analítica. Uso de la curva de calibración con muestras desconocida y Determinar
la concentración de proteínas de leche comercial

Fundamento: DETERMINACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD

En método que vamos a utilizar durante estas prácticas se emplea un colorante hidrofóbico
cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. fosfórico tienen un color pardo y que, al
encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul
intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende de la interacción relativamente
inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas. Su principal ventaja es que resulta
más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de
absorbancia a 280 nm. Para determinar la concentración de proteína total presente en una
muestra se requiere la preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón,
que generalmente suele ser la albúmina.

Materiales:

1. Reactivo de Bradford
Azul de coomasie G-250 5mg
Alcohol etílico 2.5ml
Ac. fosfórico 5ml
Agua Hasta 50ml

2. Patrón de albúmina: Disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de agua destilada,

con lo que tenemos una disolución madre con una concentración de 1 mg/ml.

3-Balanza analítica

4-Agua destilada

5-Tubos de ensayo

6-Matraces aforados de

7-Espectrofotometro

8-Espatula

9-Leche vacuna

Metodología:

1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal manera
que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl. Mezclar para ello el volumen adecuado de la
disolución madre de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el correspondiente volumen necesario
de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.

µl (alb) 0 200 400 600 800 1000 1200

µl (agua) 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800
µl (total) 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

µl (alb)
µl (agua)
µl (total)

2-Preparación de tres diluciones de la muestra problema: Hacer una dilución 1/2 de la leche
comercial; a continuación, realizar las diferentes diluciones de acuerdo con la siguiente tabla.
Leche Diluida A B C
V. leche (µl) 500 750 1000
V. agua (µl) 1500 1250 1000
V. total 2000 2000 2000

Leche Diluida A B C
V. leche (µl) 0.5 0.76 1.0
V. agua (µl) 1.5 1.25 1.0
V. total 2 2 2

3-Finalmente añadir 3 ml del reactivo de Bradford a todos los tubos; tanto a las diluciones que
contienen la albúmina como a las que contienen la leche diluida. Agitar los tubos y a
continuación proceder a la lectura de la absorbancia a 595 nm en el colorímetro o
espectrómetro. Toma de datos:

Muestras con Bradford

Tubo 1: 0

Tubo 2: 0.03

Tubo 3: Color violeta (en esta muestra, hay una INTERFERENCIA). 1.71

Tubo 4: 0.08

Tubo 5: 0.11

Tubo 6: 0.17

Tubo 7: 0.14
Aclaración

Muestras con leche comercial y biured

Tubo A y C de leche: no se pudieron leer.

Tubo con muestra B del tubo 3 queda DESCARTADO, por lo que se recomienda tomar una
nueva muestra o descartarla totalmente.

Leche comercial utilizada:

Primera solución de leche a partir de la muestra madre

Tubos con solución de la leche comercial y tubos con Bradford

Curva de Calibracion y datos

Conclusión: Se realizo la curva con valores obtenidos de TP anteriores, nuestro TP tuvo un
inconveniente porque estaba mal tipeado la dilución, por lo tanto los valores obtenidos eran
erróneos.
Pero como conclusión general se ve que realizando una curva de concentraciones conocidas de
proteinas y obteniendo su absorvancia se puede cuantificar (utilizando la misma técnica que
las concentraciones conocidas) el valor incognita de proteínas de nuestra leche. Usando la
absorvancia obtenida y extrapolándola en la curva y/o ecuación de la recta