Determinación de proteínas por el método de Bradford

El método de Bradford emplea un colorante hidrofóbico (azul brillante de coomassie),

su solución en medio acuoso y en presencia de ácido fosfórico tiene un color rojo-
parduzco, pero al reaccionar con proteínas origina un complejo de color azul intenso.
Este complejo, colorante-proteína, tiene un alto coeficiente de extinción que implica una
alta sensibilidad para la cuantificación de proteínas, además es un método rápido y fácil
de emplear.

Materiales

Azul de coomassie G-250 ………………. 5,0 mg

Etanol 95%...............................................2,5 mL
Ácido fosfórico……………………………5,0 mL
Agua destilada………………………csp. 50,0 mL
Papel de filtro tipo Whatman
Patrón de albúmina

Tubos de ensayo de 5 mL
Pipetas/micropipetas 10mL; 5 mL; 1 mL
Vortex
Espectrofotómetro
Balanza analítica
Preparación de reactivos

1- Preparación del reactivo de Bradford:

Azul de coomassie G-250 5 mg
Etanol 95% 2,5 mL
Acido fosfórico 5 mL
Agua destilada csp 50 mL

a. Disolver el azul de coomassie en el etanol. Agregar el ácido fosfórico y

enrasar con agua destilada.
b. Filtrar si es necesario (2 veces) empleando papel de filtro Whatman Nº1.
c. Guardar bajo refrigeración, empleando un frasco oscuro.

Nota: si el reactivo fue preparado con mucha anticipación, filtrar antes de usar.

2- Patrón de albúmina. Disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de agua

destilada.

Preparación de la curva patrón y protocolo de trabajo

Reactivos Bco Pto 1 Pto 2 Pto 3 Pto 4 Pto 5

µg de proteínas: 0 10 20 40 80 100
Madre albumina (1:1) µL 0 10 20 40 80 100
Agua csp 300 µL 300 290 280 260 220 200
Adicione 3 mL del Reactivo de Bradford (Indicado en el punto 1)

a. Homogenice las soluciones con la ayuda de un vortex.

b. Incube a temperatura ambiente.
c. Lea la absorbancia desarrollada a 595 nm dentro del lapso de 2 min-1 hora.
d. Grafique µg de proteínas vs absorbancia.

Preparación de Muestras

a. Prepare al menos 3 diluciones seriadas de la muestras, empleando agua como

solvente o en el buffer adecuado.
b. Tome una alícuota de 300 µL de cada una de las muestras, colóquela en los
tubos de ensayo adecuados y adicione 3 mL del Reactivo de Bradford (Indicado
en el punto 1). Continúe como se indica en el punto a (Preparación de la curva
patrón y protocolo de trabajo).
c. Extrapole el valor de absorbancia obtenido para las muestras en la curva patrón.
d. Considere las diluciones realizadas en la preparación de las muestras.

Interferencias: SDS, Triton X-100 y detergentes comerciales. Pequeñas cantidades de

color son desarrolladas en presencia de buffers fuertemente alcalinos o Tris 2M, pero
estas pueden ser eliminadas por el uso de los controles adecuados.
Notas
El complejo proteína-colorante puede fijarse al material de las cubetas (cuarzo). Esta
coloración no representa un problema para el ensayo (< 1% error). Pero para garantizar
la limpieza el material puede emplearse alguna de las siguientes técnicas de lavado:
 Método 1: Lave las cubetas con detergente para vidrio concentrado, siguiendo
con agua y acetona. Removiendo inmediatamente.
 Método 2: Lave las cubetas con HCL 0,1M (Remueve el complejo en unas
pocas horas).

Bibliografía

Bradford, M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram

Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem.
72: 248-254. 1976.
Determinación de proteínas por el método del ácido bicinchoninico

La sal sódica del ácido bicinchoninico, es un compuesto estable y soluble en agua capaz
de formar un complejo de color purpura intenso con el ión cuproso (Cu+1) en medio
alcalino. Esta reacción es la base de un método analítico capaz de monitorear la
reducción mediada por las proteínas del ión Cu+2 (reacción de Biuret). El color
producido por dicha reacción es estable e incrementa de forma directamente
proporcional a la concentración de proteínas. Adicionalmente es menos sensible a
interferencias como las mediadas por detergente no-iónicos o sales y se considera que
mantiene la alta sensibilidad asociada a la técnica de Lowry.

Materiales

Ácido bicinchonìnico, sal sódica

Na2CO3 H20
Tartrato de sodio
NaOH
NaHCO3

Agua destilada
Patrón de albúmina

Tubos de ensayo de 5 mL
Pipetas/micropipetas 10mL; 5 mL; 1 mL
Vortex
Espectrofotómetro
Balanza analítica
Preparación de reactivos

1- Solución A
Ácido bicinchonìnico, sal sódica 1%
Na2CO3 H20 2%
Tartrato de sodio 0,16%
NaOH 0,4%
NaHCO3 0,95%
Ajuste la solución obtenida a pH 11,25 empleando NaOH 50% o NaHCO3
sólido.

2- Solución B: CuSO4 5H2O 4%

3- Solución de trabajo

Mezcle: 100 volúmenes solución A + 2 volúmenes solución B (Reactivo color

verde-manzana)

Nota: Las soluciones A y B son estables a temperatura ambiente. La solución de trabajo

prepárela semanalmente.

4- Solución de albumina

Disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de agua destilada (1000 μg/mL).

Preparación de la curva patrón y protocolo de trabajo

Rango de trabajo recomendado: 100-1200 μg/mL

Reactivos Bco Pto 1 Pto 2 Pto 3 Pto 4 Pto 5

(μg/mL) 0 100 200 400 600 800
(µg de proteínas): 0 30 60 120 180 240
Madre albumina (1:1) µL 0 30 60 120 180 240
Agua csp 300 µL 300 270 240 180 120 60
Adicione 6 mL de la solución de trabajo (Indicada en el punto 3)
Nota: Cualquier múltiplo de la proporción volumen de Muestra: solución de trabajo
(1:2) puede ser empleado.

a. Homogenice las soluciones con la ayuda de un vortex.

b. Incube a 37ºC durante 30 min. (Da otras opciones)
c. Lea la absorbancia desarrollada a 562 nm.
d. Grafique µg de proteínas vs absorbancia.

Preparación de Muestras

a. Prepare al menos 3 diluciones seriadas de la muestras, empleando agua como

solvente o en el buffer adecuado.
b. Tome una alícuota de 300 µL de cada una de las muestras, colóquela en los
tubos de ensayo adecuados y adicione 6 mL de la solución de trabajo (Indicada
en el punto 3). Continúe como se indica en el punto a (Preparación de la curva
patrón y protocolo de trabajo).
c. Extrapole el valor de absorbancia obtenido para las muestras en la curva patrón.
d. Considere las diluciones realizadas en la preparación de las muestras.
Bibliografía

Smith, P.; Krohn, R.; Hermanson, G.; Mallia, A.; Gartner, F.; Frovenzano, M.;
Fujimoto, E., Goeke, N.; Olson, B.; Klenk, D. Measurement of protein using
Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150: 76-85. 1985.