REPORTE DE LA PRÁCTICA # 2

“Cuantificación de proteínas”
Integrantes:
Acosta Fernández Ilya Fabiola, Luna Vargas Tiaret, Reyes Emmanuel Cristian
Alejandro, Torres López Nallely Paola.
Fecha de entrega: 08/11/2021
Asignatura: Biología Molecular de la Célula I
Grupo: 5045
Profesor: Felipe Alcantara Sanchez

Introducción

La cuantificación de proteínas en un experimento puede servir para medir la

biomasa, medir el rendimiento a lo largo de un proceso de purificación, para medir la
actividad enzimática específica (la cual se expresa como velocidad por masa de
proteína usada); o también es requisito para otros procedimientos analíticos como la
evaluación de pureza, la secuenciación de aminoácidos, la espectrometría de
masas, etc. En un laboratorio de bioquímica, para la cuantificación de proteínas, se
utilizan diversas técnicas espectrofotométricas que se basan en la interacción de la
luz con la materia.

La espectrofotometría UV-visible es una técnica que permite determinar la

concentración de un compuesto en una disolución. Su fundamento es que las
moléculas absorben radiaciones electromagnéticas y la cantidad de luz absorbida
dependerá de la concentración. Para este método se utiliza un espectrofotómetro
en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una
solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

También son muy utilizados los métodos colorimétricos cuyo fundamento es un

reactivo o colorante que se une a las proteínas, y con esto hay un cambio en la
coloración de la sustancia examinada.

El método de Biuret, se basa en la formación de un complejo coloreado entre el

Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se
acompleja con 4 NH. (Fernandez 2010, p. 3) La intensidad de la coloración es
proporcional a la cantidad de proteínas. Aunque la sensibilidad de este método es
muy baja por lo que solo se recomienda para la cuantificación de proteínas en
disoluciones muy concentradas, como los sueros. El color violeta se lee a 540nm
contra curva estándar BSA y la intensidad del color es proporcional a la cantidad de
proteína

El método de Bradford se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250

(también Serva Blue) a las proteínas (Fernandez 2010, p. 3). Es un método
sensible, simple, rápido y barato y son pocas las sustancias que interfieren en la
determinación de las proteínas. Se basa en la unión del reactivo Comassieblue
G250 a las proteínas en medio ácido, reconoce los aminoácidos como arginina,
fenilalanina, triptófano y prolina y también origina color azul intenso A=595nm

En el método de BCA, se utiliza el ácido bicinconínico, que es un compuesto capaz

de formar iones Cu1+ en medio alcalino. En este método se monitorea el ión
cuproso que es producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio
alcalino. Como resultado se tiene un método que es sencillo, rápido y muy sensible,
además de que tolera varios compuestos que podrían alterar los anteriores
métodos. Se basa en que las proteínas reducen los iones cúpricos del reactivo BCA
a iones cuprosos en medio básico. Se observa un cambio de color del verde (BCA)
al morado.

Finalmente el método de Lowry combina la reacción del Biuret con la reducción del
reactivo de FOLIN-CIOCALTEAU por los grupos aromáticos de residuos de tirosina,
triptófano, cistina cisteína e histidina. A partir de esto se origina compuesto azul
intenso y mide a 750nm.

Para esta práctica, previamente se realizó la purificación de la proteína de la leche

por medio de precipitación con ácido de una muestra de leche desnatada, se
obtuvieron 6.33 g de un polvo color crema a partir de 200 mL de leche.

El objetivo de esta práctica es cuantificar la concentración de proteína en la leche y

el suero por medio de un ensayo de Biuret, para esto se usará albúmina sérica
bovina (BSA) como proteína de referencia.
Objetivo: Conocer las técnicas espectrofotométricas y saber la concentración de la
proteína que pudimos extraer de la leche.

Hipótesis: ¿Cuánta concentración de proteína podremos obtener después de hacer

los cálculos necesarios?

Material y métodos

Para realizar el procedimiento se siguieron una serie de pasos para la

cuantificación, comenzando con lavar 20 tubos de ensayo para posteriormente
etiquetarlos en 3 series del 1-6 y acomodarlos en una gradilla, los dos tubos
sobrantes se etiquetaron como “muestra problema 1” y “muestra problema 2”.
Posteriormente se preparó un stock de BSA a una concentración de 20 mg/mL y se
preparan diluciones en serie de la proteína de referencia (BSA) por triplicado a un
volumen final de 1.0 mL. Las concentraciones de cada tubo deben cubrir el rango
de sensibilidad del ensayo que se va a seguir. Para el ensayo de biuret, de 1 a 15
mg/mL es adecuado. Para este ejercicio se usaron las siguientes concentraciones
finales: 2, 5, 8, 10 y 12 mg/mL. Se calcula el volumen del stock (V1) para cada
dilución y se calcula el volumen de agua necesario para completar el mililitro por
sustracción. Estos datos se documentaron en la siguiente tabla.

Concentración Volumen necesario de

Número de final de BSA Volumen necesario agua para completar 1.0
tubo (mg/mL) del stock (mL) mL
1 0 0 1
2 2 0.1 0.9

3 5 0.25 0.75

4 8 0.4 0.6

5 10 0.5 0.5

6 12 0.6 0.4

Para seguir con el experimento después de documentar los datos, se pipetea una
muestra de cada dilución, 1.0 mL de suero sin diluir y 1.0 mL de leche diluída al 10%
(v/v). Se añade a un tubo a la vez, el volumen de reactivo recomendado en los
manuales de laboratorio con una pipeta exclusiva para este reactivo y se agita de
inmediato hasta lograr una mezcla uniforme y evitar la formación de espuma. Para
mezclar, se recomienda usar vórtex a velocidad media-alta por 10 segundos y
después regresar el tubo a su lugar en la gradilla se deja reposar a la temperatura y
tiempo recomendados. Después se enciende el espectrofotómetro para que se
caliente la lámpara y se ajusta en el espectrofotómetro la longitud de onda (λ)
requerida. Para biuret, se lee a 545 nm, la cual es la longitud de onda del máximo
de absorción del complejo llamado biuret. Se vierte el volumen adecuado del tubo
blanco a una celda o cubeta para espectrofotómetro y se coloca correctamente
dentro del equipo, de manera que la luz pase a través de la muestra sin
interferencia. Se configura el blanco en el equipo para que en el display aparezca
Abs 0.000 y se vierte a una segunda cubeta, la primera muestra por leer para
anotar el valor numérico que se muestra Si el valor cambia constantemente, la
muestra o no es homogénea o la reacción continúa. Se prepara otra muestra. Si el
valor que aparece en el display es negativo, eso significa que la concentración del
analito está por debajo del límite de sensibilidad del ensayo y se registra como 0
mg/mL o bien, como “menor al límite de sensibilidad”. Si el valor es cercano o mayor
a 2, la muestra está demasiado concentrada y rebasa el límite de sensibilidad del
ensayo. Inmediatamente después de cada lectura, hay que retirar la muestra de la
cubeta y enjuagar varias veces con agua destilada o etanol al 70%.

Finalmente se apaga y desconecta el equipo, se limpia con un trapo húmedo y se

desechan los residuos en los contenedores designados.

Resultados

Tabla 1. Valores de absorbencia a 545 nm (A545) de las diluciones de BSA

A545 Proteína
BSA (mg/mL) e1 e2 e3 promedio (mg/mL)
0 0 0 0 0 0
2 0.076 0.044 0.078 0.066 2
5 0.135 0.125 0.129 0.130 5
8 0.195 0.162 0.195 0.184 8
10 0.263 0.241 0.221 0.242 10
12 0.314 0.305 0.26 0.293 12
Tabla 2. Absorbencia a 545 nm de las muestras problema con reactivo de biuret

Vol. [*] de
Muestra Vol. H2O Vol. Total proteína
Muestra (mL) (mL) (mL) A545 (mg/mL)
Leche 0.1 0.9 1 0.087 3.37 mg/0.1mL
Suero 1 0 1 0.128 5.12 mg/1mL

Curva patrón

Discusión y conclusiones

Como se puede observar en la tabla 1 el promedio de la absorbancia es

proporcional a la concentración de proteína como se había especulado.

Y a partir de los valores obtenidos en la tabla 1 se puede obtener un promedio de

las concentraciones de BSA lo que nos permitirá establecer una curva patrón, de la
cual podremos obtener una ecuación que nos indicará la correlación que existe
entre la recta y los resultados que nosotros obtuvimos, debido a que la correlación
de la recta R tiene un valor cercano a 1, nuestra relación es buena, Por lo que
podríamos despejar X de nuestra ecuación y sustituirla por cualquier valor de
absorbancia para poder obtener la concentración de proteínas de una manera más
precisa.

Como tal no pudimos obtener resultados, ya que la sesión fue puramente en línea
por lo cual los resultados que utilizamos fueron los mostrados en la clase.

Bibliografía

Fernández Reyes, Emilio y Aurora Galván Cejudo. "Métodos para la cuantificación

de proteínas". Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, 2010.

Del Puerto, Marta. "Determinación de proteínas". 2013.

http://www.fagro.edu.uy/~nutrical/ensenanza/AVI%20WEB/cursoema/detdePC.pdf.

Clases con Felipus. "Cuantificación de proteínas". YouTube, 5 de noviembre de

2021. Video, 33:30. https://www.youtube.com/watch?v=ZJcaPFy17eI.