Guia Preparación Lab Bqa 360-2022 PDF

Laboratorio 1: Cromatografía de exclusión molecular.
Para preparar columnas:

Hidratar en agua destilada o buffer a utilizar. Si se hidrata en agua destilada, se requerirá
mayor tiempo para ambientar la columna una vez empaquetada.
En este práctico se hidrataron con buffer TRIS-HCl.
Se prepararon columnas sephadex G-50, G-75 y G-100 según lo estipulado por las fichas
de cada sephadex.
Sephadex mL necesarios para hidratar 1 gramo

G-25 4-6 mL
G-50 9-11 mL
G-75 12-15 mL
G-100 15-20 mL
Pesar directamente en matraz de Erlenmeyer la cantidad necesaria dependiendo de

cuantas columnas se requerirá montar. Llevar a agitación en un shaker por al menos 2
horas. NO UTILIZAR AGITADOR MAGNÉTICO. Verificar que tienen líquido suficiente para
no secarse. Siempre se puede agregar más líquido porque las columnas no se van a sobre
hidratar.
Se deben guardar a 4°C por al menos 1 semana, posterior a eso, se debe adicionar azida
de sodio (¡ES TÓXICA!, NO TOCAR CON LAS MANOS).
- Preparación de 1 Litro de buffer TRIS-HCl 100 mM:
Pesar 12,11 g de TRIS base. Disolver en 800 mL de H2O destilada. Añadir 2,13 g de HCl
(son 6,45 mL si el HCl está al 33%). Ajustar pH con NaOH o HCl concentrado. Aforar con
agua destilada.
Preparación muestra problema:
La muestra problema consiste en una mezcla de Hemoglobina (Hb), Diclorofenol-indofenol
(DCPIP) y rojo fenol, todos en concentración 0,5 mg/mL. Cada compuesto se prepara antes
y deben mezclarse el mismo día del práctico.
La mezcla a preparar debe contener 0,3 mL de hemoglobina, 0,1 mL de DCPIP y 0,1 mL
de rojo fenol.
Hemoglobina (Hb) Se disuelve en agua. Para un paralelo de 10 parejas, se

prepararon 5 mL: pesar 2,5 mg en un tubo cónico de 15 mL y
adicionando los 5 mL de agua. **es termolábil.
DCPIP Se disuelve en etanol. Para un paralelo de 10 parejas, se
prepararon 3 mL: pesar 1,5 mg en un falcon y adicionar 3 mL de
etanol. **es fotosensible.
Rojo fenol Se disuelve en etanol. Para un paralelo de 10 parejas, se
prepararon 3 mL: pesar 1,5 mg en un falcon y adicionar 3 mL de
etanol. **es fotosensible.
Creado por Paulina Escobar Larenas, Fernanda Olivares Aravena y Daniela Oyarce Witto en 2022 para el ramo BQA 360-
Caracterización de Macromoléculas impartido en la carrera de Bioquímica, PUCV.
- Preparación azul dextrano: Se utilizan 0,5 mL por pareja de laboratorio, para 10
parejas sería un total de 5 mL, pero se preparan 10 para tener extra. Pesar 5 mg y
disolver en 10 mL de agua.
Conservar las muestras de MP y el azul dextrano a 4°C y cubiertos de la luz los que sean
necesarios.
Materiales necesarios para preparar reactivos para un paralelo de 10 grupos:
- 2 vasos precipitados de litro.
- 1 matraz de aforo de litro.
- 1 espátula grande.
- 1 espátula chica.
- 1 botella plástica de 1 litro para guardar buffer.
- 3 falcon de 50 mL para guardar las columnas hidratadas.
- 4 falcon de 15 mL para guardar reactivos de muestra problema y azul dextrano.
- 20 eppendorf de 2 mL para alicuotar azul dextrano y MP.
- 1 probeta de 10 mL.
- 3 Erlenmeyer para hidratar sephadex.
- 1 vaso precipitado de 250 mL para desechos al ajustar pH.
- Papel aluminio.
Reactivos necesarios para preparar reactivos para un paralelo de 10 grupos:
- TRIS base.
- Ácido Clorhídrico.
- Agua destilada.
- Hemoglobina de sangre bovina.
- Diclorofenol-indofenol (DCPIP).
- Rojo fenol.
- Sephadex G50, G75 y G100.
Laboratorio 2: Cuantificación de proteínas.
Preparación reactivo de Bradford: Se desechan en ácidos.
- Disolver 100 mg de Azul de Comassie brillante G-250 en 50 mL de etanol 95%.
- Añadir 100 mL de ácido fosfórico 85%. Una vez que este diluido completamente,
aforar hasta completar el litro.
- Filtrar con papel Whatman antes de utilizar. Debe quedar protegido de la luz una
vez que se filtra. Este reactivo es de color café, pero translúcido. Si se ve turbio, se
debe filtrar sí o sí. Se puede omitir la filtración si este se ve translúcido.
Por grupo utilizan 40,5 mL app  10 grupos por paralelo= 405 mL  1215 mL en total.
Preparación reactivo de Biuret: Se desechan en alcalinos.
Preparar 300 mL de NaOH 10%: Disolver 30 g de la sal en 300 mL de H2O destilada.
En un vaso aparte:
- 6 g de Tartrato de Na y K se disuelven en 500 ml de H2O.
- Adicionar 1,5 g de CuSO4.
- Por último, agregar agitando 300 ml de NaOH 10%.
Por grupo utilizan entre 27 y 32 mL  10 grupos por paralelo= 270- 320 mL  810- 990 mL
en total.
Preparación de método de Lowry: Se desechan en orgánicos halogenados.
CORRECCIÓN PROTOCOLO GUIA BQA 360: Se utiliza reactivo de cobre alcalino (RCA)
y reactivo de Folin (RF). La reacción se lleva a cabo mezclando 500 uL de RCA con 250 uL
de muestra. Incubar 10 min a t° ambiente. Añadir 1 mL de RF e incubar a 55°C por 5 min.
Leer abs a 650 nm.
a) RCA, Reactivo de Cobre Alcalino: (Volumen final 400 mL).
Pesar por separado: 4% g Na2CO3 (16 g); 0,4 g Tartrato de Na y K; 0,2 gr CuSO4 y 8
g NaOH. Disolver siempre por separado en pequeños volúmenes de H2O destilada.
Luego mezclar Na2CO3 con Tartrato hasta disolverse. Agregar lentamente y con agitación
la solución de Cobre e incorporar el NaOH al final.
(Por Grupo se utilizan = 4,5 mL).
b) RF, Reactivo de Folin: (Se prepara el mismo día del Laboratorio, como máximo 6
horas antes)
Para un volumen final de 4,5 mL: Se prepara disolviendo 0,25 mL de Folin ciocalceau en
4,25 mL de H2O destilada.
( Por Grupo se utilizan = 9 mL).
Preparación reactivo BCA:
No se prepara porque hay kit. Vienen 2 reactivos (A y B). Se deben mezclar en proporción
50:1 según el n° de reacciones necesarias. Se debe considerar en el total de reacciones, la
cantidad de reacciones de la o las curvas de calibrado a utilizar.
Los reactivos A y B pueden mantenerse a t° ambiente y en tubo normal mientras estén
separados. Una vez mezclados son fotosensibles por lo que el tubo debe protegerse de la
luz antes de juntarlos.
Si no hay kit disponible, se deben mezclar 50 partes de ácido bicinconínico (SIGMA B9643)
con 1 parte de Sulfato de cobre pentahidratado 4% p/v (SIGMA C2284).
La cantidad de reacciones se calcula de la siguiente manera:
Número total de pocillos a cuantificar * 150 uL + 0,3 mL adicionales (por error de
pipeteo). Dividir el total en 51 y calcular cuánto corresponde a 50 partes de ácido
bicinconínico y cuánto a 1 parte sulfato.
Ejemplo: N° reacciones: 8, curvas de calibrado:2 con 8 puntos=16 reacciones total de
reacciones= 24*150 uL=3600 uL+0,3 mL=3900 uL/51=76,577uL*50=3850 uL de Ácido
Bicinconínico o reactivo A y 77 uL de sulfato de cobre o reactivo B.
Distribuir 10-20 uL de muestra en cada pocillo con 150 uL de mezcla de reactivos. Cubrir la
placa e incubar a 37°C por 30 min o 65°C por 15 min. Observar la aparición de color o
cambio de tonalidad verdosa a violeta.
Se realiza la medición en una microplaca de 96 pocillos. Medir absorbancia a 562 nm en un
lector de placas (se puede utilizar filtro en rango de 540-590 nm).
Considerar restar el promedio de lectura de blanco a 562 nm para la corrección de valores.
Determinar la concentración de proteínas en base a la curva estándar realizada con BSA
como patrón.
**NO SE REALIZÓ EL PROTOCOLO DE BCA EN EL PRÁCTICO DEL 2022.
Preparación BSA-Albúmina de suero bovino.

a) Patrón de Bradford 10 mg/mL : se disuelven 1 g de BSA en 100 mL de agua
destilada.
b) Patrón de Biuret 50 mg/mL : se disuelven 5 g de BSA en 100 mL de agua
destilada.
c) Patrón de Lowry 1 mg/mL : se disuelven 0,1 g de BSA en 100 mL de agua
destilada.
d) Patrón de BCA 2 mg/mL : se disuelven 0,2 g de BSA en 100 mL de agua destilada.
*** no se realizó en el práctico 2022.
No se utilizó PBS, sino que agua destilada en dilución de muestras y preparación de curvas
de calibrado.
CURVAS DE CALIBRADO: Estas curvas fueron probadas 2-3 veces por el grupo de
ayudantes de distintos paralelos y ramos que ejecutaron un práctico similar. Lowry no se
registró.
MÉTODO BIURET
BSA patrón: 50 mg/mL
Tubos [BSA] mg/mL Absorbancia 540 nm Absorbancia 540 nm
Blanco 0 - -
1 8 0,272 0,201
2 10 0,352 0,343
3 15 0,404 0,437
4 20 0,514 0,504
5 25 0,620 0,618
6 30 0,756 0,766
MP1 - 0,738 0,762
MP2 - 0,736 0,744
MP1 LECHE ENTERA (DILUCIÓN 1:100)

MP2 LECHE DESCREMADA (DILUCIÓN 1:100)
MÉTODO BRADFORD
BSA patrón: 10 mg/mL
Tubos [BSA] mg/mL Absorbancia 595 nm Absorbancia 595 nm
Blanco 0 - -
1 0,3 0,349 0,365
2 0,45 0,407 0,434
3 0,6 0,517 0,515
4 0,9 0,598 0,595
5 1,2 0,727 0,707
6 1,5 0,828 0,838
MP1 - 1,408 1,328
MP2 - 1,134 1,128
MP1 LECHE ENTERA (DILUCIÓN 1:10)

MP2 LECHE DESCREMADA (DILUCIÓN 1:10)
Curvas estándar de BCA: no se usaron en este práctico.

- 2 vasos precipitados de litro.
- 1 vaso precipitado de 500 mL.
- 2 botella de 1 Litro.
- 1 embudo grande.
- 1 probeta de 100 mL.
- 2 matraz de aforo de 1 Litro.
- 1 matraz de aforo de 500 mL.
- 1 botella de 500 mL.
- 1 vaso precipitado de Litro.
- 1 espátula pequeña.
- 1 agitador magnético.
- Papel aluminio.
- Papel filtro.
- Tartrato de sodio y potasio.
- CuSO4.
- NaOH.
- Na2CO3.
- Reactivo de Folin ciocalceau.
- BSA.
- NaCl.
- Azul de Comassie.
- Etanol 95%.
- Ácido fosfórico.
- NaH2PO4.
- Na2HPO4.
REACTIVOS Y MATERIALES NO CONTEMPLAN METODO DE LOWRY NI BCA.
Laboratorio 3: Electroforesis de proteínas-SDS PAGE.
**Hasta el 2S2022, en docencia no existían soportes ni materiales apropiados para
realizar este práctico de forma segura y exitosa. Para ejecutar este práctico nos
conseguimos el equipo completo de vidrios, soportes y cámaras Mini-PROTEAN
Tetra Vertical Electrophoresis Cell BIORAD ® con el profesor Alexis González.
1. Preparación soportes: Se deben preparar el día anterior al práctico o en su defecto
unas 2-3 horas antes.
Los vidrios a utilizar se deben limpiar. Existen 2 opciones:
a) Agua destilada lavalozas agua destilada agua MiliQ Isopropanol hasta
que “rechine”.
b) Agua destilada Solución NaOH 1M cepillando cada vidrio por ambos lados
agua destilada agua MiliQ Acetona.
Una vez limpios los vidrios se deben montar las bases del soporte, agregar vaselina
y luego montar los vidrios.
2. Preparación gel separador:
Mezclar los reactivos en orden según la tabla dependiendo del % de gel separador
a utilizar. Los geles deben prepararse en matraces de Erlenmeyer pequeños,
utilizando exclusivamente uno para el gel separador y otro para el gel concentrador.
En este práctico se utilizó como muestra leche entera y descremada diluida, por lo
que se prepararon geles separadores de 10%.
** La polimerización se inicia una vez que el APS entra en contacto con el TEMED,
por lo que estos dos componentes deben agregarse al final.
** El APS debe estar lo más “fresco” posible, por lo que se prepara el mismo día que
se prepara el gel y con agua MiliQ.
Siempre se debe preparar ½ gel más dependiendo de las cantidades totales a
preparar, es decir, si se mezclarán reactivos con el objetivo de montar 2 geles, se
debe preparar una mezcla como si se fueran a preparar 3 geles.
Concentración gel separador

Componente 7,5% 10% 12% 15%
Acril/Bis (30%) (mL) 2,5 3,3 4 5
Lower Buffer 4X (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5
H2O MiliQ (mL) 4,94 4,15 3,45 2,45
AGITAR BIEN
APS (uL) 75 75 75 75
TEMED (uL) 7,5 7,5 7,5 7,5
 Acril/Bis (30%) viene lista. Antes de preparar el gel, verificar que es el

porcentaje que sale en la tabla, si la que está disponible no corresponde a la
del 30%, se deben recalcular las cantidades necesarias para cada gel.
 Lower Buffer 4X Este buffer debe estar a pH 8,8 para la correcta corrida
y gelificación. **SI EL BUFFER SE PREPARA ANTES, VERIFICAR
SIEMPRE EL pH ANTES DE PREPARAR EL GEL. Para 250 mL: Disolver
45,4 g de TRIS Base en 200 mL de agua MiliQ. Añadir 10 mL de una solución
de SDS 10% o 1 g de SDS. Medir pH y ajustar a 8,8. Una vez ajustado, aforar
a 250 mL con agua MiliQ. Guardar a 4°C.
 APS 10% (Persulfato de amonio) Pesar 0,1 g de persulfato de amonio
directo en un eppendorf y añadir 1 mL de H2O MiliQ.
 TEMED Viene listo. Agregar bajo campana o en un lugar ventilado. (Ojala
punta con filtro, aunque nunca hay en docencia).
Una vez agregado el APS y TEMED, agitar nuevamente la mezcla y verter la
solución entre los vidrios montados previamente. Se debe agregar hasta 1 cm bajo
de donde debería quedar la peineta del gel (Siempre sobra un poco de mezcla).
Agregar 200-400 uL de isopropanol sobre el gel separador para eliminar las burbujas
que pudieran haber quedado. Dejar polimerizar en estufa a 27°C durante 30 min o
a temperatura ambiente (sólo si hace calor  app 25°C en el lab).
Pasada la media hora, se nota claramente la diferencia entre el isopropanol y el gel.
ELIMINAR el isopropanol con una jeringa, volteando el gel o con ayuda de papel
absorbente.
Lavar la superficie del gel con agua MiliQ antes de agregar el gel concentrador y
eliminar el agua de lavado de la misma forma que se eliminó el isopropanol.
3. Preparación gel concentrador:
Mezclar los reactivos en orden según la tabla. Siempre se debe preparar ½ gel más
dependiendo de las cantidades totales a preparar, es decir, si se mezclarán reactivos con
el objetivo de montar 2 geles, se debe preparar una mezcla como si se fueran a preparar 3
geles.
Componente Volumen
Acril/Bis (30%) (uL) 650
Upper Buffer 4X (mL) 1,25
H2O MiliQ (mL) 3,07
AGITAR BIEN
APS (uL) 37,5
TEMED (uL) 15
 Acril/Bis (30%) viene lista.

 Upper Buffer 4X Este buffer debe estar a pH 6,8 para la correcta corrida
y gelificación. **SI EL BUFFER SE PREPARA ANTES, VERIFICAR
SIEMPRE EL pH ANTES DE PREPARAR EL GEL. Para 250 mL: Disolver
15 g de TRIS Base en 200 mL de agua MiliQ. Añadir 10 mL de una solución
de SDS 10% o 1 g de SDS. Medir pH y ajustar a 6,8. Una vez ajustado, aforar
a 250 mL con agua MiliQ. Guardar a 4°C.
 APS 10% (Persulfato de amonio) Si se prepara 1 mL para el gel
separador, alcanza para preparar los concentradores.
 TEMED Viene listo. Agregar bajo campana o en un lugar ventilado. (Ojala
punta con filtro, aunque nunca hay en docencia).
Una vez agregado el APS y TEMED, agitar nuevamente la mezcla y verter la solución sobre
el gel separador. Este se debe agregar hasta el tope e introducir las peinetas (ojalá las de
15 pocillos) a utilizar en posición horizontal, verificando NO FORMAR BURBUJAS. Lo más
fácil para que no queden burbujas entre los pocillos es hacer que el gel concentrador
rebalse al introducir las peinetas.
Dejar polimerizar en estufa a 27°C durante 30 min o a temperatura ambiente (sólo si hace
calor  app 25°C en el lab). **Este gel, está listo más rápido, por lo que es probable que a
los 15-20 min esté listo.
Una vez listos los geles, se deben desmontar del soporte y montar en el soporte de corrida
si se utilizarán de inmediato o guardar envueltos en papel absorbente empapado con H2O
dentro de una bolsa hermética a 4°C para evitar que se deshidraten. Se pueden preparar
como máximo 2 días antes de correrlos.
4. Preparación de las muestras:
Se utilizan por grupo una muestra de leche entera y una de leche descremada. Alicuotar
muestras de 1 mL para cada grupo. Para cargar un volumen de 15 uL y que esta contenga
30 ug de proteína se deben mezclar:
A) 18,18 uL de leche entera con 281,82 uL de agua.
𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑒𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎 → 3,3𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑝𝑜𝑟 100 𝑚𝐿
3,3 𝑔 1000 𝑚𝑔 1000 𝜇𝑔 1 𝑚𝐿 𝜇𝑔
× × × = 33
100 𝑚𝐿 1𝑔 1 𝑚𝑔 1000 𝜇𝐿 𝜇𝐿
𝜇𝑔
𝜇𝑔 𝜇𝑔 2 ×300 𝜇𝐿
𝜇𝐿
33 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 = 2 × 300 𝜇𝐿 → 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 = 𝜇𝑔 = 18,18 𝑢𝐿 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑒𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎.
𝜇𝐿 𝜇𝐿 33
𝜇𝐿
B) 18,75 uL de leche descremada con 281,25 uL de agua.

𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑒𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎 → 3,2𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑝𝑜𝑟 100 𝑚𝐿
3,2 𝑔 1000 𝑚𝑔 1000 𝜇𝑔 1 𝑚𝐿 𝜇𝑔
× × × = 32
100 𝑚𝐿 1𝑔 1 𝑚𝑔 1000 𝜇𝐿 𝜇𝐿
𝜇𝑔
𝜇𝑔 𝜇𝑔 2 ×300 𝜇𝐿
𝜇𝐿
32 𝜇𝐿
× 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 = 2 𝜇𝐿
× 300 𝜇𝐿 → 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 = 𝜇𝑔 = 18,75 𝑢𝐿 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑟.
32
𝜇𝐿
ESTO APLICA PARA LECHE COLUN. Si es otra la leche disponible, se deben rehacer los
cálculos. ***En rigor este cálculo deben hacerlo los/las estudiantes.
Lo ideal es que utilicen las mismas muestras cuantificadas de la sesión anterior de
cuantificación de proteínas y con ello deberían sacar este cálculo con las concentraciones
obtenidas. El cálculo anotado aquí se realizó con lo reportado en la información nutricional
de cada caja de leche que deberían ser similar a lo que llegan en cada grupo.
Para la preparación de las muestras se deben mezclar 5 uL de buffer de carga con 15 uL
de muestra diluida para que quede un volumen final de carga de 20 uL.
 Buffer de carga (LBS) 10 mLSE PREPARA BAJO CAMPANA. Se agrega todo

en orden en un vaso precipitado de 50 mL con un agitador magnético. Una vez
agregado el azul de bromofenol, esperar que la mezcla esté homogénea, ajustar a
10 mL, alicuotar y guardar a -20°C.
TRIS-HCl (pH 6,8) (1M) 0,61 g de TRIS BASE disueltos en 2,5
mL, ajustar pH.
SDS 0,8 g
Glicerol 4 mL
Β-mercaptoetanol 2 mL
Azul de bromofenol 4 mg
Calentar tubos a 95°C por 5 min. Lo ideal es que sea en baño seco, pero no hay en docencia
por lo que se calientan a baño maría sellando cada tubo con parafilm y procurando tener
cuidado una vez que se sacan del agua porque las tapas saltan y se podrían perder las
muestras. Conseguirse flotadores de eppendorf o preparar uno con plumavit de cajas de
cubetas.
5. Electroforesis:
Montar el gel preparado en el soporte de corrida y luego dentro de la cámara de
electroforesis. Añadir buffer de corrida entre los geles y hasta que rebalse y alcance la
marca de 2 geles o 4 geles dependiendo de la cantidad a correr.
Si se decide correr sólo 1 gel (que es poco probable por la cantidad de muestras y grupos)
se debe poner la resistencia acrílica que viene en el BIORAD.
Una vez que se agregó el buffer de corrida, se pueden cargar las muestras. Cargar en el
primer pocillo de cada gel 10 uL de estándar de proteínas. En el resto de los pocillos cargar
20 uL de muestras. Se deben anotar orden de carga para poder diferenciar los resultados
después.
Correr la electroforesis a 60-80 V hasta que las muestras o marcador de peso alcancen el
gel separador. Luego aumentar a 100-120V 1-2 horas o hasta que el frente de corrida llegue
a 1 cm del borde inferior.
 BUFFER DE CORRIDA:
TRIS BASE 15 g
GLICINA 72 g
SDS 5g
Disolver en H2O MQ, ajustar pH a 8,3 (casi nunca es necesario ajustar, queda justo
a 8,3, pero es necesario verificar). Aforar a 1 L y almacenar a 4°C. Se suele utilizar
1 L para llenar la cámara de electroforesis del BIORAD.
6. Desmonte y tinción del gel:

Desmontar el gel con cuidado, descartar el gel concentrador y teñir con solución de tinción
por 30 min a t° ambiente en agitación o por 15 min a 37°C.
Luego desteñir con solución de destinción hasta que se puedan distinguir bien las bandas.
Este proceso es más rápido y efectivo en agitación y añadiendo un pedazo de esponja
amarilla. La solución de destinción se debe cambiar si está excesivamente azul y se puede
reutilizar si se destiñe con carbón activo y luego se filtra
 SOLUCIÓN DE TINCIÓN (metanol/ácido acético/ H2O c/ Comassie):

500 mL H2O+ 50 mL ácido acético +450 mL ETANOL+ 2,5 g de Azul Comassie.
** Agregar en orden, cubrir de la luz antes de agregar Comassie, solución de tinción
es fotosensible.
 SOLUCIÓN DE DESTINCIÓN (metanol/ácido acético/ H2O):
550 mL H2O+50 mL ácido acético+400 etanol. **Agregar en orden, no es necesario
cubrir de la luz.
PROTEÍNAS PRESENTES EN LA LECHE:
KDa Proteína
14 α-lactoglobulina
18 β-lactoglobulina
24-25 Caseína
69 BSA
78 Lactoperoxidasa
80 Lactoferrina
150- Inmunoglobulinas
900 IgG (85)

- 2 vasos precipitados de 250 mL.
- 3 vasos precipitados de 1L.
- 2 matraz de Erlenmeyer de 100 mL.
- 1 Probeta de 250 mL.
- 1 Probeta de 1 L.
- 2 Matraz de aforo de 250 mL.
- 1 matraz de aforo de 1 L.
- 4 Agitadores magnéticos (3 grandes 1 pequeño).
- 3 botellas de 1 Litro.
- 2 botellas de 250 mL.
- 1 tubo cónico de 15 mL.
- 4 Vidrio reloj.
- 1 embudo grande.
- 1 espátula pequeña.
- Papel aluminio.
- ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA (30%).
- TRIS BASE
- SDS (DODECILSULFATO SÓDICO O LAURILSULFATO SÓDICO)
- PERSULFATO DE AMONIO (APS).
- TEMED
- GLICINA
- GLICEROL
- Β-MERCAPTOETANOL.
- AZUL DE BROMOFENOL.
- METANOL
- ÁCIDO ACÉTICO
- AZUL DE COMASSIE.
- NaOH
- HCl
Laboratorio 4: Identificación de carbohidratos.
1) MOLISCH  Disolver 3,75 g de α-naftol en 25 mL etanol al 96%. Se usan app 65
mL por paralelo.
2) LUGOL Disolver 10 g de Yoduro de potasio en 100 mL de H2O. Una vez disuelto,

mantener agitación y agregar poco a poco 5 gramos de Yodo. Filtrar la solución
resultando y diluir 1:5 con H2O. Se usan app 65 mL por paralelo.
3) REACTIVO DE TOLLENS Agregar NaOH al 5% a una solución de AgNO3 al 5%.

Con esto precipita un sólido oscuro de tonalidad café. Agregar NH4OH hasta
disolver el precipitado. Todos estos volúmenes dependen de la cantidad final a
preparar. Se suelen usar 65 mL por paralelo y se debe acidificar las muestras
antes de ser eliminada.
4) REACTIVO SELIWANOFF 50 mg de resorcinol en 33 mL de HCl concentrado

(6N), diluir con 100 mL de H2O. Almacenar en botella ámbar o cubierto de la luz. Se
usan app 65 mL por paralelo.
5) FEHLING Se deben preparar la solución A Y B porque la mezcla final no es
estable por mucho tiempo. MODIFICAR PROTOCOLO EN LA GUÍA.
PROTOCOLO ACTUAL: Agregar a un tubo de ensayo 1 ml de cada solución a probar,

agregar 1 ml del reactivo de Fehling y mezclar. Calentar en baño María durante 5 minutos.
PROTOCOLO REAL: Agregar a un tubo de ensayo 1 ml de cada solución a probar,

agregar 500 uL del reactivo A. AGITAR. Agregar 500 uL del reactivo B. Calentar en baño María
durante 5 minutos y observar si hay algún signo de formación de precipitado.
REACTIVO A: CORRESPONDE A UNA SOLUCIÓN DE CuSO4: Disolver 7 g de

sulfato de cobre pentahidratado en 70 mL de H2O. Aforar a 100 mL. Cubrir de la luz
una vez disuelto.
REACTIVO B: FEHLING INCOLORA. Disolver 12 g de NaOH en 70 mL de H2O.
Agregar 35 g de tartrato de sodio y potasio.
6) Disoluciones de carbohidratos a preparar:
Glucosa 5% 10 g en 200 mL de H2O.

Fructosa 5% 10 g en 200 mL de H2O.
Galactosa 5% **no es seguro que Álvaro tenga 10 g en 200 mL de H2O.
Sacarosa 5% 10 g en 200 mL de H2O.
Lactosa 5% 10 g en 200 mL de H2O.
Almidón 5% 10 g en 200 mL de H2O.
Manosa 5%no hubo en el práctico 2022 10 g en 200 mL de H2O.
Glicógeno 1% 2 g en 200 mL de H2O.
Dextrina 5% 10 g en 200 mL de H2O.
MP1- glucosa+ dextrina
MP2- lactosa+dextrina Mezclar cantidades iguales de cada
MP3- fructosa+ glicógeno solución mencionada en cada MP.
******Prender baño María para Tollens, Seliwanoff y Fehling.
Prueba de Molish identificación azúcares en general.
- POSITIVO (+): Aparición anillo rojo violeta en la interfase.
- NEGATIVO (-): Sin cambios.
Prueba Lugol Identificación de polisacáridos-almidón.
- POSITIVO (+): Aparición tonalidades púrpuras. Si es un polisacárido lineal: purpura-
azul, si es un polisacárido ramificado: púrpura a rojo. Suele dar súper púrpura para
almidón.
- NEGATIVO (-): sin cambios. Solución incolora.
Prueba Tollens Identificación presencia de aldehídos y cetonas.
- POSITIVO (+): Aparición espejo de plata por presencia de aldehído.
- NEGATIVO (-): No se forma espejo de plata y podría ser presencia de cetonas.
Las muestras tratadas con el reactivo de Tollens deben ser acidificadas con ácido
diluido antes de ser eliminadas, esto para prevenir la formación de nitruro de plata,
el cual es explosivo.
Prueba Seliwanoff Diferencia cetosas de aldosas.
- POSITIVO (+): Cambio de color de incoloro a rojo. Las cetosas dan (+).
- NEGATIVO (-): Queda incoloro. Las aldosas dan (-)
Prueba de Fehling Determinación de azúcares reductores.
- POSITIVO (+): Formación de un precipitado color rojo ladrillo.
- NEGATIVO (-): No cambia de color o se torna azul verdoso.
Molish Lugol Tollens Seliwanoff Fehling
Glucosa + - + - +
Fructosa + - + + +
Galactosa + - + - +
Sacarosa + - + + -
Lactosa + - + - +
Almidón + + + - -
Manosa + - + - +
Glicógeno + + + - -
Dextrina + + + - +/-
MP1- glucosa+ + +/- + - +/-
dextrina
MP2- + +/- + - +/-
lactosa+dextrina
MP3- fructosa+ + +/- + +/- +/-
glicógeno

- 2 vasos precipitados de 250 mL.
- 1 vasos precipitados de 1L.
- 6 Agitadores magnéticos (3 medianos 3 pequeños).
- 4 Vidrio reloj.
- 3 embudo mediano.
2 espátulas grandes.
- 2 espátulas pequeñas.
- Papel aluminio.
- Alfa Naftol.
- Etanol 95%
- Yodo
- Yoduro de potasio.
- HCl
- Resorcinol.
- Sulfato de Cobre pentahidratado.
- Tartrato de Na+ y K+
- NaOH
- AgNO3
- NH4OH
- Glucosa
- Fructosa
- Galactosa
- Sacarosa
- Lactosa
- Almidón
- Manosa
- Glicógeno
- Dextrina.
Laboratorio 5: EXTRACCIÓN DE DNA.
Este práctico se canceló y no se realizó en el 1S2022. No hubo un LAB 5, ya que
fueron las pruebas de lab.
**TODO SE DEBERÍA REALIZAR CON H2O MILIQ.
1) SOLUCIÓN DE LISIS: Se utilizan 10 mL por grupo, se preparan 100 mL considerando
10 grupos. La solución de lisis contiene: SDS 1,2%, EDTA 25 mM, TRIS-HCl 100 mM
(pH 8) y NaCl 1 M. Para preparar esta solución se pesan:
- 1,2 g SDS.
- 0,7706 g de EDTA.
- TRIS-HCl (0,1 M, pH 8,8) Para 100 mL pesar 1,21 g TRIS BASE + 0,21 g HCl
(son 149 uL).
- 5,844 g de NaCl.
Se disuelven agregando de uno en uno los reactivos en 50 mL de H2O. Aforar a 100 mL.
2) Acetato 3M: Se utilizan 1 mL por grupo, se preparan 50 mL considerando 10 grupos.
Disolver 14,72 g de acetato de potasio en 30 mL de H2O. Aforar a 50 mL.
3) BUFFER TE (pH 7,6) : Se utilizan 1,7 mL por grupo, se preparan 50 mL considerando
10 grupos.
Contiene 10 mM TRIS (0,061 g) y 1 mM EDTA (0,0146 g). Disolver sales en orden y luego
ajustar pH a 7,6 con HCl. Aforar a 50 mL.
4) BUFFER TAE (1X): Este buffer contiene: TRIS ACETATO 0,04M y EDTA 0,001M.
Preparar 1,5 L. Las cantidades a continuación corresponden a 1L.
- 4,85 g de TRIS-BASE.
- 0,74 g EDTA.
- 1,2 g Ácido acético glacial (1,14 mL, considerando densidad 1,05 g/cm3)
Se disuelven agregando en orden los reactivos a 800 mL de H2O. Ajustar pH y aforar a 1L.
5) BUFFER DE CARGA (6X) Este buffer contiene: Azul de bromofenol 25%, glicerol
30%.
Se preparan 10 mL: pesar 0,025 g de azul de bromofenol a 5 mL de H2O. Añadir 3 mL de
glicerol y aforar a 10 mL.
6) GEL DE AGAROSA  Se prepara en buffer TAE 1X. El gel utilizado en este práctico
debería ser de 0,8% de agarosa. Se debe calcular dependiendo del soporte a utilizar.
Los de docencia son de entre 50-75 mL de volumen.
**no se pidieron materiales ni reactivos para este práctico, ya que no se realizó.
Laboratorio 6: Espectros de fluorescencia de aminoácidos y proteínas
1) Buffer fosfato (0,1 M, pH 7,4) Disolver 20,214 g de Na2HPO4 en 800 mL de

H2O. Agregar 3,394 g de NaH2PO4. Ajustar pH a 7,4 y aforar a 1L.
Este buffer se utilizó para preparar los siguientes aminoácidos.
2) Tirosina (0,1 mg/mL) Se prepararon 50 mL por paralelo. Pesar 5 mg y disolver
en 50 mL. Almacenar en un tubo cónico de 50 mL protegido de la luz.
3) Triptófano (1 mg/mL) Se prepararon 50 mL 50 mL por paralelo. Pesar 50 mg y

disolver en 50 mL. Almacenar en un tubo cónico de 50 mL protegido de la luz.
4) Fenilalanina (2 mg/mL) Se prepararon 50 mL 50 mL por paralelo. Pesar 100 mg

y disolver en 50 mL. Almacenar en un tubo cónico de 50 mL protegido de la luz.
5) HSA (1 mg/mL) Se prepararon 15 mL en total para todos los paralelos. Pesar 1,5
mg de HSA y disolver en 15 mL de buffer fosfato.
**TODOS LOS AMINOÁCIDOS LOS TENÍA LA PROFESORA María Elena Tarnok, no
Álvaro.
6) Clorhidrato de guanidina (5 M) Disolver 23,87 g en 30 mL de H2O. Una vez
disuelto, aforar a 50 mL. Se prepararon 50 mL por paralelo.
Laboratorio 7: Apagamiento de la fluorescencia de proteínas y anisotropía de
Rodamina.
1) BUFFER FOSFATO (pH 7,4)  Disolver 20,214 g de Na2HPO4 en 800 mL de H2O.

Agregar 3,394 g de NaH2PO4. Ajustar pH a 7,4 y aforar a 1L.
*Se utilizó el que quedaba del práctico anterior.
2) Albúmina de suero Humano (HSA) Preparar solución 1 mg/mL. Se utilizaron

2,5 mL por cada paralelo. Se prepararon 15 mL pesando 1,5 mg de HSA que se
disolvieron en 15 Ml de buffer fosfato.
La absorbancia es de 0,1 UA a 295 nm con una concentración de 0,9 mg/mL.
3) ACRILAMIDA (8M) disolver 28,43 g de Acrilamida en 30 mL de H2O. Aforar a
50 mL. Almacenar en un tubo cónico de 50 mL.
4) Triptófano (1 mg/mL) Se prepararon 50 mL 50 mL por paralelo. Pesar 50 mg y

disolver en 50 mL. Almacenar en un tubo cónico de 50 mL protegido de la luz.
La absorbancia es de 0,1 UA a 295 nm con una concentración de 0,04 mg/mL.
Laboratorio 8: Marcaje fluorente de proteínas.
Corrección guía: Se disuelve 1 mg y no 10 mg de BSA en 1 Ml de buffer Bicarbonato.
El punto 1.2 y 1.3 están listos.
a) Lavar columnas: Las columnas las tiene la profesora María Elena Tarnok. Se
lavan agregando agua a tope y centrifugando a 2000 rpm por 1 min. Se equilibran
de 4 columnas en la centrífuga.
b) Se agregan 500 uL de muestra en la columna y la fracción recuperada se mide
a 280 nm y 494 nm.
1) BUFFER BICARBONATO (0,2 M, pH 9,0) Disolver 0,57 g de Na2CO3*10H2O

en 80 mL de H2O. Agregar 1,51 g de NaHCO3. Ajustar pH a 9,0. Aforar a 100 mL.
2) BSA Lo preparan directo en el práctico.
3) Sonda/Solvente Prof María Elena.
4) Columna Se deben rehidratar y lavar (al menos 5 veces) previo al práctico.

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Laboratorio 1: Cromatografía de exclusión molecular.

Para preparar columnas:

Sephadex mL necesarios para hidratar 1 gramo

Pesar directamente en matraz de Erlenmeyer la cantidad necesaria dependiendo de

Hemoglobina (Hb) Se disuelve en agua. Para un paralelo de 10 parejas, se

Preparación BSA-Albúmina de suero bovino.

MP1 LECHE ENTERA (DILUCIÓN 1:100)

MP1 LECHE ENTERA (DILUCIÓN 1:10)

Materiales necesarios para preparar reactivos para un paralelo de 10 grupos:

REACTIVOS Y MATERIALES NO CONTEMPLAN METODO DE LOWRY NI BCA.

Concentración gel separador

 Acril/Bis (30%) viene lista. Antes de preparar el gel, verificar que es el

 Acril/Bis (30%) viene lista.

B) 18,75 uL de leche descremada con 281,25 uL de agua.

 Buffer de carga (LBS) 10 mLSE PREPARA BAJO CAMPANA. Se agrega todo

6. Desmonte y tinción del gel:

 SOLUCIÓN DE TINCIÓN (metanol/ácido acético/ H2O c/ Comassie):

PROTEÍNAS PRESENTES EN LA LECHE:

Materiales necesarios para preparar reactivos para un paralelo de 10 grupos:

2) LUGOL Disolver 10 g de Yoduro de potasio en 100 mL de H2O. Una vez disuelto,

3) REACTIVO DE TOLLENS Agregar NaOH al 5% a una solución de AgNO3 al 5%.

4) REACTIVO SELIWANOFF 50 mg de resorcinol en 33 mL de HCl concentrado

PROTOCOLO ACTUAL: Agregar a un tubo de ensayo 1 ml de cada solución a probar,

PROTOCOLO REAL: Agregar a un tubo de ensayo 1 ml de cada solución a probar,

REACTIVO A: CORRESPONDE A UNA SOLUCIÓN DE CuSO4: Disolver 7 g de

6) Disoluciones de carbohidratos a preparar:

Glucosa 5% 10 g en 200 mL de H2O.

Materiales necesarios para preparar reactivos para un paralelo de 10 grupos:

**no se pidieron materiales ni reactivos para este práctico, ya que no se realizó.

1) Buffer fosfato (0,1 M, pH 7,4) Disolver 20,214 g de Na2HPO4 en 800 mL de

3) Triptófano (1 mg/mL) Se prepararon 50 mL 50 mL por paralelo. Pesar 50 mg y

4) Fenilalanina (2 mg/mL) Se prepararon 50 mL 50 mL por paralelo. Pesar 100 mg

1) BUFFER FOSFATO (pH 7,4)  Disolver 20,214 g de Na2HPO4 en 800 mL de H2O.

2) Albúmina de suero Humano (HSA) Preparar solución 1 mg/mL. Se utilizaron

4) Triptófano (1 mg/mL) Se prepararon 50 mL 50 mL por paralelo. Pesar 50 mg y

1) BUFFER BICARBONATO (0,2 M, pH 9,0) Disolver 0,57 g de Na2CO3*10H2O

2) BSA Lo preparan directo en el práctico.

3) Sonda/Solvente Prof María Elena.

4) Columna Se deben rehidratar y lavar (al menos 5 veces) previo al práctico.

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