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INFORME DE LABORATORIO SOBRE LA ESTRUCTURA DE LOS

AMINOÁCIDOS Y PRECIPITACIÓN DE CASEÍNA

30 de Agosto del 2016 _ Grupo N°5

Ángela Lizeth Ordoñez Ordoñez 216064


aldoñezo@unal.edu.co

Docente: Diego Fernando Mejía Carmona

OBJETIVOS

a) Discutir las características estructurales de los aminoácidos, el concepto de PH o


punto isoeléctrico, mediante la precipitación de la caseína.

MATERIALES Y MÉTODOS

I. Extracción de la caseína

Materiales Reactivo: Instrumentos:


 Ácido acético 2M  Vaso precipitado
 50 ml de leche  Termómetro
 Estufa
 Agitador
Método En un vaso precipitado se calentó 50 ml de leche hasta alcanzar una
temperatura de 40℃, luego se procedió a la adición gota a gota del
ácido acético 2M, es decir que para poder alcanzar o ver un PH de 4.7
se le agregaron 25 gotas y de esto se logró obtener unos resultados
debido a que la cantidad de proteínas es decir la gran parte de caseína
se tornaba de color blanca, quedando el suero, luego se procede a la
filtración de la caseína por medio de un papel filtro que nos permitirá
realizar los diferentes cálculos.

II. Determinación de la presencia de carbohidratos ( Prueba de fehling)

Materiales Reactivo: Instrumentos:


 Reactivo fehling A  Tubo de ensayo
 Reactivo fehling B  Estufa
 1 ml de suero
Método En un tubo de ensayo se le añadió 0,5 ml del reactivo A y 0,5 ml del
reactivo B, luego se pasa a calentar y añadir 1 ml de suero que será
nuevamente calentado.

III. Determinación de la presencia de calcio


Materiales Reactivo: Instrumentos:
 Oxalato de amonio  1 tubo de ensayo
4%
 1 ml de suero
Método En un tubo de ensayo se le añadió 1 ml de suero mezclando este con 3
gotas de oxalato de amonio 4%

IV. Determinación de la presencia de proteínas ( Prueba de Biuret)

Materiales Reactivo: Instrumentos:


 Hidróxido de sodio al  2 tubos de ensayos
10%.
 Sulfato de cobre al
1%
 1 ml de suero
Método Usando dos tubos de ensayo se le añadieron 1 ml de sulfato de cobre al
1% y 1 ml de Hidróxido de sodio al 10%. En uno de los tubos de
ensayo se añadió 1 ml de suero y en el otro tubo de ensayo se agregó
los mismos compuestos pero en este caso se remplazó el suero por un
trozo de caseína disuelto en 3 ml de agua.

V. Determinación de la presencia de riboflavina en la leche.

Materiales Reactivo: Instrumentos:


 Suero  Fuente de luz ultravioleta
Método Se toma el suero que fue resultado de la desnaturalización de la leche y
se somete a la fuente de luz ultravioleta es decir que este es acercado a
esta fuente para poder tener ciertas observaciones acerca de lo que
sucede en ese momento.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

I. Extracción de la caseína
Figura 1. Extracción de la caseína Figura 2. Extracción de la caseína
con 10 gotas de ácido acético. con 25 gotas de ácido acético.
Figura 3. Extracción de suero y caseína Figura 4. Extracción de caseína
finalizada

Al tomar los 50 ml de leche iniciamos agregando cierta cantidad de gotas de ácido


acético a esta secreción nutritiva o compuesto (leche) “Figura 1” lo cual genera la
disminución de su punto isoeléctrico, obteniendo como resultado que al agregarle
las 25 gotas de ácido acético, la leche precipita y comienza a separarse cada uno de
sus componentes “figura 2” debido a que en este momento hemos alcanzado el
punto isoeléctrico de uno de los componentes de la leche, es decir que hemos
encontrado el punto isoeléctrico de la caseína o gran parte de esta caseína debido a
que la leche está formada por el 72% al 82% de esta proteína lo que indica que al
alcanzar el pH de la caseína sus cargas son netas, lo que impide que interactúe con
otras moléculas por lo cual la leche termina precipitándose o la proteína en sí, lo que
genera la separación de los otros componentes y es aquí cuando se puede observar
que el punto isoeléctrico de la caseína es de 4,7 lo cual justifica que al disminuir el
pH de la leche a este valor la precipita, además se puede observar que las demás
proteínas de la leche (lacto albúminas y lacto globulinas) permanecen en el líquido
sobrante, ahora bien, debemos tener en cuenta que solo trabajamos con un pH de 4,7
que es el de la caseína que es la que se aísla pues el pH de la lacto albúmina es por
encima de 5, 2 y el pH de las lacto globulina es encontrada en pH mayores a 3,0, lo
que nos garantiza que la masa obtenida es de la caseína.

Después de que logramos llegar a un punto isoeléctrico de alrededor 4,7,


procedemos a la separación de la caseína del suero de leche “figura 3”, mediante la
separación por gravedad, es decir, se toma un vaso de precipitado vacío y en este se
comienza a arrojar el suero de leche, quedando en el otro vaso precipitado la
caseína, luego se procede al secado de la caseína mediante la utilización de una
toalla o servilleta “figura 4”, ahora bien se procede al pesaje de la caseína y aquí se
debe tener en cuenta que el resultado no es un resultado preciso por más equilibrada
que este la pesa, debido a que en el proceso de extracción de la caseína se pudo
notar que quedaban en ella unas pequeñas partes de caseína que eran más complejas
de sacar con los implementos utilizados en el laboratorio lo que indica que los
resultados serán una aproximación de caseína encontrada en cierta cantidad de
leche, seguido de esta observación ya procedemos a tener un resultado de 7,54 g de
caseína presentes en 50 ml de leche.
De lo anterior podemos dar respuesta a la siguiente pregunta, ¿Podría, a partir de sus
resultados, calcular el contenido de la caseína en un litro de leche? Y la respuesta es
sí como se demostrara en el siguiente proceso:

500𝑚𝑙
= 10 𝑚𝑙
50𝑚𝑙

7,54𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 × 10 𝑚𝑙 = 75,4𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑒𝑛 1𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒

Tabla 1. Peso de la caseína según el volumen de la leche.


Volumen Masa
50 ml 7,54g
500ml 75,4g

De igual manera se puede realizar de la siguiente forma, lo que nos genera el mismo
valor del anterior proceso y lo que representa en la “Tabla 1”

7,54𝑔 × 500𝑚𝑙
= 75,4 𝑔
50𝑚𝑙

II. Determinación de la presencia de carbohidratos de la lactosa ( Prueba de


fehling)

Figura 5. Fehling A Figura 6. Presencia


y B mezclados de carbohidratos

Para determinar la presencia de carbohidratos se realizó la prueba de fehling que


consiste que la utilización de los reactivos de fehling los cuales se utilizan para la
determinación de azúcares reductores, “figura 5”, ahora bien al tener esta mezcla
en presencia de 1 ml de suero nos generó un color azul oscuro que luego de ser
sometido a calor nos da un color anaranjado oscuro casi tendiendo a rojo, lo que
indica que la prueba de carbohidrato es positiva para esta cantidad de suero, “figura
6”, esto se debe a que su acción se fundamenta en el poder reductor del grupo
carbonilo de los aldehídos el cual se oxida a ácido y se reduce la sal de cobre en
medio alcalino a óxido de cobre, formando un precipitado de color rojo.
Figura 7. Estructura de la lactosa

Ahora bien, la presencia de carbohidratos nos arroja un resultado positivo lo cual


implica que la lactosa es un disacárido, que significa que está compuesta de dos
unidades de monosacárido “figura 7”. Específicamente, los monosacáridos en
lactosa son la glucosa y galactosa, es decir que la tonalidad anaranjada tirando a
rojizo se debe a que la lactosa tiene características reductoras, azúcar reductor,
debido a que al formarse el enlace entre los dos monosacáridos se desprende
una molécula de agua. Además, este compuesto posee el hidroxilo hemiacetálico,
por lo que da la reacción de Benedict, es decir es reductor.

III. Determinación de la presencia de calcio

Figura 8. Calcio
presente en 1 ml de
suero

En un tubo de ensayo se introdujo 1ml de suero más 3 gotas de oxalato de amonio al


4%, formando un color blancuzco en un tiempo de segundos, “figura 8”.

Figura 9. Reacción del oxalato de calcio

Oxalato de amonio Oxalato de calcio


lo que indica que el calcio iónico de la muestra (suero) se combina con el reactivo
de oxalato de amonio con el fin de precipitarlo en forma de oxalato de calcio,
“figura 9” de aquí que nos arroje un resultado el cual se puede ver físicamente un
de color blanco o precipitado blanco que genera que la prueba de calcio es positiva.

IV. Determinación de la presencia de proteínas ( Prueba de Biuret)

Figura 10. Mezcla de sulfato de Figura 11. Proteínas presentes en


cobre al 1% e Hidróxido de sodio la cafeína y en el suero de la leche
al 10% en dos tubos de ensayo.
Cafeína Suero

Para la realización de esta prueba se utilizó reactivos de biuret, usando dos tubos de
ensayo en el que en se les agrego sulfato de cobre al 1% e Hidróxido de sodio al
10% en los dos tubos de ensayo, “figura 10”, ahora bien en el tubo de ensayo de la
parte izquierda se le agrega un trozo de caseína disuelto en 1 ml de agua y en el del
lado izquierdo se le añade un mililitro de suero, “figura 11”.

Figura 12. Estructura del reactivo de biuret

Como resultado de estas mezclas se obtuvo tanto un color moradito o violeta claro
como uno más oscurito, lo que se explica mediante los conocimientos obtenidos
referentes al reactivo de biuret, es decir que este se encarga de detectar la presencia
de proteínas, el reactivo de color azul cambia de color azul a violeta en presencia de
proteínas y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadenas cortas pero
en el suero se puede ver claramente que estos están en presencia de proteínas
aunque en la parte de la caseína se tenía más leve que el del suero, cabe destacar que
el hidróxido de sodio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino
necesario para que dé lugar a esta reacción, por lo tanto esta reacción se basa en la
formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo
de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, “figura 12”

V. Determinación de la presencia de riboflavina en la leche.

Figura 13. Fluorescencia


que tiene la vitamina B2

En esta prueba se tomaron los residuos de suero de leche y fueron sometidos a una
lámpara fluorescente que emite luz ultravioleta, al acercar esta lámpara y el suero se
tornó de un color verde fluorescente en el cual se tiene en cuenta que hay presencia
de vitamina B2 también llamada riboflavina.

Figura 14. Estructura de la


riboflavina Ahora bien, esta fluorescencia se debe a
que esta vitamina es hidrosoluble
conformada básicamente por un grupo
de 3 anillos, es decir, un anillo
de isoaloxazina dimetilado al que se une
el ribitol, y un alcohol derivado de
la ribosa. Los tres anillos forman la
isoaloxacina y el ribitol es la cadena de
5 carbonos en la parte superior, lo que
implica que esta vitamina es sensible a
la luz solar y a ciertos tratamientos
como la pasteurización, ahora bien la
fluorescencia se asocia en este caso y en
general en las flavinas (grupo de
pigmentos amarillos), “figura 14”.
DISCUSIÓN

1. ¿Cómo pueden clasificarse los aminoácidos? Examine las características


comunes de cada grupo, compare los diferentes radicales de cada aminoácido y
familiarícese con su estructura.

Según Bohinski (1991) la clasificación a la que podemos llegar según las


características del grupo –R de los aminoácidos esta inicialmente constituida por
aquellos que son neutros (no presenta carga, es decir, no puede ionizarse), los que
son ácidos (se puede cargar negativamente-ácido de Brönsted) y los que son básicos
(se pueden cargar positivamente-base de Brönsted).

Tabla 2. Clasificación de los aminoácidos si son esenciales o no esenciales

Esenciales No esenciales
Treonina Serina
Metionina Alanina
Leucina Glicina
Valina Ácido glutámico
Lisina Ácido aspártico
Arginina Prolina
Fenilalanina Cisteína
Histidina Cistina
Isoleucina Tirosina
Triptófano Taurina

Tabla 3. Clasificación de los aminoácidos según su cadena lateral y funciones.


Tabla 4. Clasificación de los aminoácidos según su polaridad

2. ¿Qué se entiende por pH o punto isoeléctrico de un aminoácido o una


proteína? ¿Por qué, en dicho punto, las especies precipitan? ¿Qué es lo que
permite que los aminoácidos actúen como reguladores de pH de los fluidos
biológicos?

Se define el punto isoeléctrico de un aminoácido como el pH en el que la carga neta


es nula, y se representa como pI. En este punto, se deben cumplir dos condiciones:
a. La especie neutra debe ser la predominante;
b. La concentración de especie catiónica en equilibrio debe ser igual a la forma
aniónica, para que se compensen sus cargas, es decir: [+Aa]=[Aa-].

Los aminoácidos se precipitan cuando se encuentran en su punto isoeléctrico debido a


que se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la
proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su
solubilidad, esto se justifica debido a que las moléculas que están cargadas igual se
repelen entre sí, y así forman una dispersión estable en el agua, lo se relaciona con las
interacciones electrostáticas e interacciones antoferas, ahora bien, La eliminación de
la carga elimina la fuerza repulsiva y permita interactuar a las moléculas entre si y
precipitar en la mayoría de los casos.

Además de esto podemos decir porque los aminoácidos actúan como reguladores de
pH de los fluidos biológicos y esto se debe a las características de estos aminoácidos
como el ser anfóteros, es decir que se pueden comportar como ácidos y como bases
dependiendo del pH del medio, esto es debido a la presencia de aminoácidos con
grupos ionizables, que pueden captar y ceder H+, como consecuencia pueden
amortiguar las variaciones de pH, por consiguiente Las proteínas contribuyen a
mantener el equilibrio del medio interno y debido a su carácter anfótero actúan como
sistemas amortiguadores de pH.

3. Experimentalmente, ¿Cómo diferenciaría usted entre un aminoácido


aromático y otro que no lo es? Indague al respecto y diseñe un breve protocolo
de laboratorio para la respectiva experimentación.

Experimentalmente yo realizaría la diferenciación de un aminoácido aromático de


otros aminoácidos mediante la utilización de una fuente de luz ultravioleta porque
los aromáticos contienen en su cadena lateral un anillo del mismo nombre y
absorben la luz ultravioleta, alrededor de 280nm, lo que indica que es mayor la
absorción UV en los aminoácidos fenilalanina, tirosina, y triptófano.

Materiales Reactivo: Instrumentos:


 Aminoácidos  Fuente de luz ultravioleta
Método Se toma el aminoácido y se somete a la fuente de luz ultravioleta es
decir que este es acercado a esta fuente para poder tener ciertas
observaciones acerca de lo que sucede en ese momento.

CONCLUSIÓN

 Conociendo el punto isoeléctrico de una determinada molécula antipática, es posible


aislarla. Por lo que alcanzando el punto isoeléctrico de la caseína, esta se precipita,
lo que hace posible su aislamiento del resto de la leche.
 Los Aminoácidos son compuestos orgánicos que debido a la presencia de dos
grupos funcionales presentan características anfipaticas.

BIBLÍOGRAFIA

● Ospina G, Blanca Lucía, Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica, 2014.


● Trudy Mckee, Bioquímica-La base molecular de la vida, McGraw Hill,
Interamericana de España, S.A.U, tercera edición 2003.
● Hormaza, Angelina, Introducción a la bioquímica-Practicas de laboratorio. Centro
de publicaciones, Universidad Nacional de Colombia-Sede Medellín, primera
edición 2010.
● https://sites.google.com/site/laboratoriosbioquimica/bioquimicai/carbohidratos/reac
cion-de-fehling
● https://sites.google.com/site/bioquia9/home/inform-bqf
● https://es.wikipedia.org/wiki/Reactivo_de_Fehling
● http://www.sandranews.com/que-tipo-de-carbohidrato-es-la-lactosa/
● https://es.wikipedia.org/wiki/Lactosa
● http://www.uv.es/gidprl/Gravimetria/determinacin_de_calcio_con_oxalato.html
● Castillo, Alberto. Determinación de calcio. Universidad Inca Garcilaso de la Vega,
2011, informe.
● https://es.wikipedia.org/wiki/Biuret
● Dergal, S. B., Rodríguez, H. B., & Morales, A. A. (1981). Química de los
alimentos (p. 123). Alhambra.
● Mora, Ileana. nutrición animal, Editorial Universidad Estatal a Distancia San Jose,
Costa Rica, 2007.