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LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA GENERAL

PLAN DE ESTUDIO: __INGENIERIA BIOTECNOLÓGICA____

ASIGNATURA: __PRODUCCIÓN DE BIOMOLECULAS___
DOCENTE: _NELSON VEGA__ AÑO:_2020_

PRACTICA # 4: DETERMINACIÓN APROXIMADA DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE UNA

PROTEÍNA

INTRODUCCIÓN
El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala al
número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto
isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoácidos los grupos ionizables
corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos.

Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el comportamiento
de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en estas
moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad. Los aminoácidos y las
proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen
iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma
de sales insolubles a ese pH.

OBJETIVOS:
El objetivo fundamental de esta práctica es la determinación del punto isoeléctrico de la
caseína una vez extraída esta mediante procedimiento químico de la leche entera liquida.

GENERALIDADES:
Caseína. La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y
vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas
cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa)
y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina
C.

En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas
globulares).

La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la
leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de proteínas
que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la
mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina
y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La
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caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en
composición de la leche líquida.

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6

aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal
cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la unidad soluble se
neutraliza ( los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita

Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2

Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio

ácido son proteínas globulares, hidrofilicas y fácilmente solubles en agua así como susceptibles
de desnaturalización por calor. Las principales son ß -lacto globulina, alphalactalbumina, bovine
serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig).

La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto

de tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación
de plásticos.

Punto isoeléctrico (pI): es el pH en que la carga neta total de una molécula es igual a cero y no
migra en un campo eléctrico. Un fenómeno físico importante es que cuando una molécula está
en su punto isoeléctrico tiende a precipitarse, el cual representa un principio importante de
separación de proteínas. Ya que una proteína precipita en su punto isoeléctrico, en esta
práctica determinaremos el punto isoeléctrico aproximado de la caseína (proteína mayoritaria
en la leche) al colocarlos en soluciones con diferentes valores de pH.

La ionización de los aminoácidos es similar a la de cualquier otra molécula, y por lo tanto sigue
la ecuación de Henderson-Hasselbalch:
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El punto isoeléctrico (pI) se define como el pH en el que los aminoácidos naturales o cualquier
otra especie anfótera tienen carga 0.

Para hallar el punto isoeléctrico de un aminoácido hay que calcular sus pKa experimentalmente,
sumarlos y dividirlos entre dos:
pI = (pKa¹ + pKa²)/2

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos: Materiales:
Balanza analítica 10 vasos precipitados de 25 ml
Plancha de calentamiento y agitación 2 vasos precipitados de 50 ml
Potenciómetro (pH-metro) Un vaso precipitado de 250 ml
Espectrofotómetro. Probeta de 50 ml
Balón aforado de 50 ml
Reactivos: Pipeta graduada de 1 ml
Ácido acético al 1M Pipeta graduada de 5 ml
Ácido acético al 1N Pipeta graduada de 10 ml
Ácido acético al 0,1 N Embudo de vidrio
Ácido acético al 0,01 N Erlenmeyer de 100 ml
Agua destilada Papel filtro
Hidróxido de sodio NaOH al 1 N Toalla de papel absorbente
Éter etílico Gotero o pipeta pasteur
Leche entera cruda Pipeteador tipo cremallera
Transfer de 1 -10 ml
Micropipeta de 100 – 1000 µl
Puntas para transfer y micropipeta

PROCEDIMIENTO

A. Aislamiento de la caseína:
1. Caliente en un vaso de precipitado 250ml de agua destilada a 38ºC, añada 50ml de leche y
luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 1M hasta que observe que se forma
un precipitado (la leche se corta).
2. Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.
3. Lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro.
4. Seque el precipitado colocando varias toallas de papel absorbente
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5. Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente pesado, vuelva a

pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico
6. Filtre nuevamente
7. Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que es la caseína.

B. Preparación de la solución de caseína:

1. Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50ml
2. Agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una solución total de
la caseína.
3. Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione 5 ml de ácido
acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien.
4. La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

C. Determinación del pI de la caseína:

1. En diez vasos de 25 ml limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los reactivos
según la siguiente tabla:
Ac Ac
Ac pH
Acético Acético
Tubo H2O Acético resultante pH real OBSERVACIONES
0.01N 0.1N
1N (ml) (aprox)
(ml) (ml)
1 8.38 0.62 5,9
2 7.75 1.25 5,6
3 8.75 0.25 5,3
4 8.5 0.5 5,0
5 8.0 1.0 4,7
6 7.0 2.0 4,4
7 5.0 4.0 4,1
8 1.0 8.0 3,8
9 7.4 1.6 3,5
2. Medir experimentalmente el pH de todos los vasos, que debe cubrir un rango aproximado
semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que deben ser
semejantes a los expresados y en todos los casos crecientes.
3. Añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo.
4. Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.
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5. Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetría de 1 cm

de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de cada tubo para
obtener una solución/suspensión homogénea antes de verter una parte en la cubeta.
6. Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar el punto
isoelectrico aproximado de la caseína.

RESULTADOS
¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?
¿Porque la caseína se precipitó en más de un tubo?
¿Cuál es el uso industrial de la caseína?
¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el punto isoelectrico?

BIBLIOGRAFÍA:
Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México.

Universidad Jorge Tadeo Lozano. Guía 2.2-Determinación del punto isoeléctrico de la caseína.
Bogota. Recuperado de
http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/bioquimica/guia_2_
2.pdf

Sin autor. Práctica 3: Extracción de la caseína y determinación del punto isoeléctrico. Recuperado de:
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf