METODOLOGIA Y EXPERIMENTACIÓN EN

BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 2: DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS BIOQUÍMICOS EN

ALIMIENTOS

GRUPO 8ª : Sira BÒ CALAF, Miquel ESPUNY LLEIXA, Clémence VAILLANT

ÍNDICE

Resumen .................................................................................................................................................. 3
Materiales y métodos.............................................................................................................................. 4
Resultados y discusión............................................................................................................................. 6
Conclusión ............................................................................................................................................. 12
Bibliografía............................................................................................................................................. 13
Resumen

En las industrias alimentarias, es esencial determinar la concentración de varias sustancias

porque permite informar a los consumidores de la composición del alimento, y también permite
elaborar parámetros de calidad. Para ese fin, se han desarrollado numerosos métodos adaptados a
cada componente para cuantificarlos. Cuatro métodos se estudiarán en esta práctica.

Las proteínas, los lípidos y el colesterol son tres componentes principales en la composición de
los alimentos, por lo que la determinación de su concentración es importante. Para esto, se ha utilizado
el método Bradford y el método Kjeldahl para cuantificar las proteínas en la leche entera,
semidesnatada y desnatada, el método Röse-Gottlieb para cuantificar los lípidos de las mismas leches,
y, por último, la espectrofotometría para cuantificar el colesterol en el huevo.

Con el método Bradford se encontró un contenido en proteína de 1,37g/100mL de leche

entera, 2,74g/100mL de leche semidesnatada y 2,60g/100mL de leche desnatada. El método Kjeldahl
da un contenido en proteínas de 3,77g/100mL de leche desnatada. Además, el método Röse-Gottlieb
llega a un contenido en lípidos de 4,01g/100mL de leche entera. Y en fin, con la espectrofotometría se
encontró un contenido en colesterol de 0,3g/100g de huevo.

Para concluir, los cuatro métodos son fáciles y rápidos a realizar, aunque hay que hacerse con
precisión. Además, los resultados obtenidos son bastante similares a las etiquetas y la bibliografía.
Materiales y métodos

1. Determinación del contenido en proteínas de leche mediante el método

Bradford

El método Bradford utiliza la colorimetría de las soluciones para determinar la concentración de

proteínas en la leche. En efecto, las proteínas constituyen aproximadamente el 50% del peso seco de
las células. Para hacer esta cuantificación, el reactivo de Bradford se añade a cada muestra. Es una
solución ácida de Coomassie Blue G-250 que se colora en azul cuando reacciona con la proteína. Como
hay proteína en la muestra, la solución se vuelve azul. Entonces, se prepara una curva de calibración
con diferentes concentraciones de albúmina (0 ; 0,05 ; 0,15 ; 0,3 y 0,5 mg/mL + 2,5 mL de reactivo de
Bradford 1/5 en cada uno) y después de medir la absorbancia a 595 nm de nuestra muestra (leche
dilución 1/100 + 2,5 mL reactivo de Bradford 1/5) se puede calcular la concentración con la ley de Beer-
Lambert.

Para preparar el reactivo de Bradford, no tenemos que prepararlo con precisión, porque solo es
una cuestión de color, y lo único importante es que la dilución debe ser la misma para todo el patrón
y para las muestras. A lo contrario para la leche necesitamos un volumen preciso para calcular la
concentración exacta de proteína. Diluimos la muestra 1:100 porque al diluirla podemos leer mejor la
absorbancia. Si tenemos demasiada proteína en la solución el valor no sería en la curva de calibración.
Entonces, si un punto sale de la curva, hay que diluirlo.

Cálculos para preparar BSA 1mg/mL:

- A partir de BSA sólido, para un volumen de 500µL:

o 𝑚 = 500µ𝐿 × × µ
= 0,5 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝐵𝑆𝐴 𝑒𝑛 0,5𝑚𝐿
- A partir de BSA 15mg/mL, para un volumen de 500µL:
o 𝑉 = 500µ𝐿 × × µ
× = 0,033𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝐵𝑆𝐴 𝑒𝑛 0,5𝑚𝐿

2. Determinación del contenido en proteínas de leche mediante el método

Kjeldahl

El método Kjeldahl se basa en el análisis de la cantidad de nitrógeno en la leche para cuantificar

las proteínas.

La primera etapa es la mineralización. Los compuestos orgánicos que contienen nitrógeno se

descomponen en condiciones de calor mediante ácido sulfúrico y un catalizador. Este catalizador
contiene sulfato de potasio (K2SO4), que hace aumentar el punto de ebullición del ácido sulfúrico. El
nitrógeno dará cuantitativamente sulfato de amonio. Para esta etapa, en un tubo se pone 1 pastilla de
catalizador con unas gotas de antifoam-A, y después se añade 1mL de leche (o de agua para el blanco),
antes de añadir 10mL de H2SO4. Este tubo se pone en el digestor a 420°C durante 1-2h.

Después, se neutraliza el sulfato de amonio con el hidróxido sódico. El amoniaco obtenido se

destila sobre una solución de ácido bórico. Para esto, se añaden 50 mL de agua destilada en el tubo.
Se prepara 26mL de ácido bórico al 4% con unas gotas de indicador rojo de metilo-verde de
bromocresol para la unidad destiladora, y se pone el tubo en la misma unidad. En la unidad se añaden
50-60mL de NaOH al 40% y finalmente se destila la mezcla.

El último paso es la valoración de los aniones borato formados con HCl normalizado para calcular
el nitrógeno de la muestra. Para esto se añade HCl 0,1M hasta que la muestra pasa de color verde a
rosa y se apunta el volumen de HCl utilizado.

Esta técnica puede utilizarse para todos los bioproductos, alimentarios y vegetales líquidos o
sólidos, pero las muestras sólidas deben mezclarse antes, entonces este método es adecuado para la
carne.

cálculos para preparar las soluciones:

- 10mL de HCl 0,1 M a partir de HCl al 37%:

, ,
o 𝑉 % = 10𝑚𝐿 × × × × × ,
=
0,083𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝐻𝐶𝑙 𝑎𝑙 37% 𝑒𝑛 10𝑚𝐿
- 30mL de ácido bórico al 4% a partir de Ácido Borico.2H20:
,
o 𝑚 . = 30𝑚𝐿 × × , ×
= 0,758𝑔 𝑑𝑒 𝐴𝐵. 2𝐻 𝑂 𝑒𝑛 30𝑚𝐿
- 60mL de NaOH al 40% a partir de NaOH solido:
o 𝑚 = 60𝑚𝐿 × = 24𝑔 𝑑𝑒 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑒𝑛 60𝑚𝐿

3. Cuantificación de lípidos totales en muestras de leche mediante el método de

Röse-Gottlieb

Los lípidos representan el 3-4% de la composición de la leche. Pueden ser aislados por gravimetría
porque la leche es una emulsión con dos fases: una acuosa y otra lipídica. Estas dos fases se separan
mediante la adición de éter, que hace pasar todas las moléculas orgánicas de la fase lipídica a la fase
etaria. Para esto, se añaden 1,5mL de amoniaco a 10 mL de leche y se mezcla. Después de añaden 10
mL de alcohol absoluto y se mezcla. Finalmente se añaden 25mL de éter etílico y 25mL de éter de
petróleo, se mezcla y se decanta en una probeta.

Después de la decantación, la parte lipídica se introduce en un crisol seco, previamente pesado, y

se pone en una estufa durante el resto del día para que el éter se evapore. El crisol se pone en un
desecador para evitar que los lípidos se humedezcan y una vez seco se pesa con la misma balanza.

Este método no es una buena opción para los alimentos sólidos porque funciona con la
decantación y ésta se utiliza para separar dos líquidos con densidades diferentes.

Nunca debemos tocar los crisoles para no contaminarlos con los lípidos que podrían estar en
nuestras manos. Usaremos pinzas o guantes para cogerlos.
 4. Determinación del contenido en colesterol del huevo

Las yemas de huevo están compuestas principalmente por colesterol, y su cantidad puede ser
determinar por espectrofotometría.

Para hacerlo, se añade una enzima en el huevo o la yema (la colesterol oxidasa) que oxida el colesterol
y crea peróxido de hidrógeno. En presencia de catalasa, el peróxido de hidrógeno oxida el metanol en
formaldehído que, en presencia de NH4+, reacciona para dar un derivado de la lutina, un colorante
amarillo.

Para esto se pesó el huevo entero, se pone 1g de huevo mezclado en un tubo con 1g de arena
y 20 mL de KOH metanoico 1M, toda la mezcla se agita hasta que quede una mezcla homogénea,
después se añade 10 mL de isopropanol, y se agita en un baño de PEG durante 30min. Finalmente, se
enfría en un vaso de agua, se filtra y se enrasa hasta 50mL con isopropanol. Así obtenemos la muestra
con la que vamos a trabajar. Después, se mezcla 200µL de muestra con 2500µL de solución S4i para
hacer el blanco, y se mezcla 1250µL de este blanco con 10µL de S3i para hacer la muestra. Se hacen 2
blancos y 2 muestras, y estos 4 tubos se incuban 1h a 37°C antes de leer la absorbancia a 405 nm.

La cantidad de lutina es proporcional a la cantidad de colesterol. La concentración de esta

sustancia se calcula midiendo la absorbancia, y aplicando la ley de Beer-Lambert.

La arena se utiliza para romper y mezclar el huevo. Entonces no hay que tenerla en cuenta para
los resultados porque no reacciona y cuando filtramos nos deshacemos de ella. Después de filtrar la
solución, la enrasamos para obtener un volumen exacto, así cuando calcularemos la concentración el
resultado será más preciso.

Cálculos para preparar soluciones:

- 500 mL de KOH 1M a partir de KOH 85% :

o 𝑚 % = 500𝑚𝐿 × × × × =
32,9𝑔 𝑑𝑒 𝐾𝑂𝐻 85% 𝑒𝑛 500𝑚𝐿

Resultados y discusión

1. Determinación del contenido en proteínas de leche mediante el método

Bradford

Tabla 1 : Valores de absorbancia de varias concentraciones para la recta patrón

leche entera Concentración (mg/mL) 0 0,05 0,15 0,3 0,5

Absorbancia 0,625 0,844 1,049 1,27 1,736
leche Concentración (mg/mL) 0 0,05 0,15 0,3 0,5
semidesnatada Absorbancia 0,616 0,772 0,937 1,3 1,515
leche Concentración (mg/mL) 0 0,05 0,15 0,3 0,5
desnatada Absorbancia 0,634 0,65 0,947 1,33 1,728
Con estos datos se realiza una recta que permite calcular las concentraciones de las muestras. El patrón
de leche semidesnatada no fue realizado con el mismo reactivo de Bradford que las 2 otras leches,
entonces se hace 2 rectas:

Recta patron : leche semidesnatada

1,8
1,6 y = 1,81x + 0,666
R² = 0,9745
1,4
Absorbancia

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Concentracion

Ilustración 1 : Recta patrón para la leche semidesnatada

Recta patron : leche entera y desnatada

2
1,8
y = 2,1918x + 0,6427
1,6
R² = 0,983
1,4
Absorbancia

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Concentracion (mg/mL)

Ilustración 2: Recta patrón para la leche entera y desnatada

Tabla 2 : Valores de absorbancia de las muestras

Muestra absorbancia
leche entera 1 0,925
leche entera 2 0,963
leche semidesnatada 1,162
leche desnatada 1 1,199
leche desnatada 2 1,225

Así, se puede hacer los cálculos de concentración de las muestras, mediante la recta patrón.

Ex: para la leche semidesnatada

Recta patrón: 𝐴 = 1,81 × 𝑐 + 0,666

 , , ,
 𝑐= ,
= ,
= 0,27 mg de proteínas / mL de leche diluido
 Como la leche fue diluida 100 veces:
𝑐= × × × 100𝑚𝑙 = 2,7 g de proteínas/100mL de leche

Tabla 3 : Resultados del contenido en proteínas de leche

muestra concentración media valor fabricante

(g/100mL) (g/100mL) (g/100mL)
leche entera 1 1,29 1,37 3
leche entera 2 1,46
leche semidesnatada 2,74 2,74 3,1
leche desnatada 1 2,54 2,60 3,2
leche desnatada 2 2,66

Los valores obtenidos son un poco inferiores a los valores de fabricante, pero están en el mismo orden
de magnitud. El contenido de proteínas en leche entera es inferior a la leche semi y desnatada, como
los valores del fabricante. La concentración obtenida para la leche semidesnatada no es inferior a la
leche desnatada, cosa que no tendría que pasar. Esto se puede explicar por el hecho que solo hay una
muestra de leche semidesnatada (la otra fue descartada), y que el patrón de la leche semi no es el
mismo que las dos otras leches.
Tabla 4 : Estudio de los datos de todos los grupos

contenido en proteinas (g/100mL)

leche leche semi leche
entera desnatada desnatada
grupo 1 2,28 2,28 2,1
grupo 2 2,94 2,2 2,4
grupo 3 2,3 2,15 1,9
grupo 4 2,2 2,5 2,2
grupo 5 1,17 1,43
grupo 6 2,31 2,3 2,56
grupo 7 2,12 1,84 1,92
grupo 8 1,37 2,74 2,6
Media 2,08625 2,18 2,24
Fabricante 3 3,1 3,2

Con los valores medios de todos los grupos, se confirma que el contenido en proteínas obtenido es
más bajo que el contenido indicado por el fabricante, pero está claro que el contenido de leche entera
es inferior al de la leche semidesnatada, que además es inferior al de la leche desnatada.
 2. Determinación del contenido en proteínas de leche mediante el método
Kjeldahl

En nuestro grupo estudiamos el contenido de proteínas de la leche desnatada.

Tabla 5 : Volumen de HCl gastado en la valoración del ión borato

Volumen de HCl (mL)

Muestra 4,32
Blanco 0,1

Ahora calculamos la diferencia entre el volumen gastado para la muestra y para el blanco:

𝑉 = 4,32 − 0,1 = 4,22 𝑚𝐿

Sabemos que la cuantidad gastada de HCl en la valoración del ion borato es idéntica a la cantidad de
de nitrógeno, y que la solución de HCl utilizada es de 0,1M. Entonces:
0,1𝑚𝑜𝑙 1𝐿
𝑛 =𝑛 = 4,22𝑚𝐿 × × = 4,22. 10 𝑚𝑜𝑙
1𝐿 1000𝑚𝐿
Con la masa molecular del nitrógeno podemos calcular la masa de proteína contenida en la muestra:
14𝑔
𝑚 = 4,22. 10 𝑚𝑜𝑙 × = 0,00591𝑔
1𝑚𝑜𝑙
Como la muestra es de 1mL:

% = 0,00591𝑔 × 100 × 6,38 = 3,77g de proteína /100mL de leche

Tabla 6: Estudio de los datos de todos los grupos

contenido en proteínas (g/100mL)

leche leche semi leche
entera desnatada desnatada
grupo 1 3,6
grupo 2 3,8
grupo 3 3,6
grupo 4 3,7
grupo 5 3,67
grupo 6 3,8
grupo 7 3,66
grupo 8 3,77
Medio 3,68 3,65 3,79
Fabricante 3 3,1 3,2
Los valores de contenido de proteínas en la leche con este método son un poco más altas que los
valores del fabricante, y no siguen el mismo orden: el contenido es más alto en la leche desnatada que
las 2 otras leches, pero la leche entera no es inferior a la leche semi como debería ser. Pero, las valores
de cada grupo son muy similares, y esto es porque todo fue realizado con la maquina automática,
entonces hay menos errores de dilución y de medida.

3. Cuantificación de lípidos totales en muestras de leche mediante el método de

Röse-Gottlieb

Tabla 7 : Datos de la cuantificación de lípidos en leche

Masa del Masa del crisol Masa de lipidos en Volumen total de Contenido de
crisol solo (g) con lípidos (g) 15mL de fase eteria fase eteria (mL) lipidos (g/100mL)
39,1880 39,3159 0,1279 47 4,01
41,7091 41,8361 0,1270 46 3,89
43,7680 43,8965 0,1285 48 4,11

Para conocer el contenido de lípidos en la leche, se calcula la diferencia de masas de los crisoles, y
después se calcula la cantidad de lípidos obtenida en 15mL de fase etaria al volumen total de esta fase
obtenido para cuantificación de 10mL de leche:

% = (39,3159 − 39,1880)𝑔 × × = 4,01 g de lípidos/100 mL de leche

Tabla 8: Estudio de los datos de todos los grupos

contenido en lipidos (g/100mL)

leche leche semi leche
entera desnatada desnatada
grupo 1
grupo 2 0,76
grupo 3 1,77
grupo 4 1,61
grupo 5 0,02
grupo 6 2,24
grupo 7 3,27
grupo 8 4,01
Medio 3,64 1,60 0,02
Fabricante 3,6 1,6 <0,3

Los contenidos en lípidos medios obtenidos por todos los grupos corresponden a los valores del
fabricante.
 4. Determinación del contenido en colesterol del huevo

Tabla 9 : Valores de absorbancia para la determinación del contenido en colesterol del huevo

Absorbancia Absorbancia
Blanco 1 0,206 Muestra 1 0,285
Blanco 2 0,200 Muestra 2 0,291

La concentración en colesterol se calcula con la ley de Beer Lambert:

𝐴 −𝐴
𝑐= × 𝐷𝑖𝑙 × 𝐷𝑖𝑙
𝜀×𝑙
0,285 − 0,206 1260 2700
𝑐= × × = 1,46. 10 𝑚𝑜𝑙/𝐿
7,3. 10 𝐿. 𝑚𝑜𝑙 . 𝑐𝑚 × 1𝑐𝑚 1250 200
Ahora como tenemos una muestra de 50mL y con la masa molecular del colesterol:
, . ,
% = 50𝑚𝐿 × × × × 100 = 0,28 g colesterol/100g huevo

Tabla 10 : Contenido en lípidos de las muestras de huevo

Contenido en lipidos
(g/100g huevo)
Muestra 1 0,28
Muestra 2 0,32

Tabla 11: Estudio de los datos de todos los grupos

Contenido en
colesterol (g/100g)
grupo 1

grupo 2 0,33
grupo 3 0,4
grupo 4 0,5
grupo 5 0,41
grupo 6 0,31
grupo 7 0,23
grupo 8 0,3
Medio 0,35
Teoria 0,372ii

El contenido medio en colesterol en el huevo es de 0,35 g/ 100g, y este valor está muy cerca del valor
teórico.
Conclusión

Como conclusión, los cuatro métodos son fáciles y rápidos de realizar, aunque hay que hacerse
con precisión.

Con el método Bradford se encontró un contenido en proteína de 1,37g/100mL de leche

entera, 2,74g/100mL de leche semidesnatada y 2,60g/100mL de leche desnatada. El método Kjeldahl
da un contenido en proteínas de 3,77g/100mL de leche desnatada. Además, el método Röse-Gottlieb
llega a un contenido en lípidos de 4,01g/100mL de leche entera. Y, finalmente, con la
espectrofotometría se encontró un contenido en colesterol de 0,3g/100g de huevo.

Debido a que estos resultados son bastante similares a las etiquetas y la bibliografía podemos
concluir que los métodos utilizados son bastante fiables.
Bibliografía
i
BOEHRINGER MANNHEIM, Colorimetric methoc for the determination of cholesterol in foodstuffs and other
materials.
ii
http://www.dietandfitnesstoday.com/cholesterol-in-an-egg.php