Universidad de Guanajuato

Campus Celaya – Salvatierra

División de Ciencias de la Salud e Ingenierías
Departamento de Ingeniería Agroindustrial
Programa de Ingeniería en Biotecnología
Agosto - diciembre 2022
Fisiología Celular
Docente: Dra. Sandra Pérez Aguilar
400-A
“Práctica 2. Concentración proteica”
Guillermo Sebastián Martínez Morales
22 de septiembre de 2022
 PRÁCTICA: DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN PROTEICA POR
ESPECTROFOTOMETRÍA

Incluya aquí la siguiente información de la fuente alimenticia:

¿Cuál fue la fuente alimenticia que empleaste?

La proteína utilizada fue proteína en polvo hecha con suero de leche (usada en los gimnasios).
¿Cuál era la porción recomendada? ¿Qué parte de la porción recomendada empleaste?
La porción recomendada es de 31 gramos por porción, nosotros solo usamos 10 gramos para
hacer la práctica, por lo que se usó un 32.25% de la porción recomendada.
¿Cuál es el contenido de proteína en gramos/porción?
Una porción es de 31 gramos, y por cada porción hay 24 gramos de proteína, así que en la
muestra que nosotros usamos, que fue de 10 gramos, podemos decir que hay
aproximadamente 7.74 gramos de proteína.
¿Cuántos ml finales obtienes después de homogeneizar una parte de la porción
recomendada?
Al agregar los 50ml de buffer a la muestra de proteína y homogeneizar esta, se obtuvieron 58
ml de solución final. l agregar los 50ml de buffer a la muestra de proteína y homogeneizar esta,
se obtuvieron 58 ml de solución final.

Preparación de la Curva Standard de Proteína

1. Encienda el espectrofotómetro y permita que se caliente por 15 minutos. Ajuste la
longitud de onda a 545 nm
2. Prepare los tubos de ensaye de como se muestra en la tabla siguiente. EL ORDEN EN
EL QUE SE ADICIONEN LOS ELEMENTOS ES IMPORTANTE

Tubo Agua (l) BSA 1 mg/ml (l) Reactivo de Biuret (ml)

1 1000 0 2
2 980 20 2
3 950 50 2
4 900 100 2
5 750 250 2
6 500 500 2
7 0 1000 2

3. Usando micropipetas, adicione primero el agua a los tubos. Posteriormente adicione la

solución de BSA, y mezcle con ligeros golpecitos al tubo.
4. Cuando todas las muestras hayan sido preparadas, a todos los tubos se adicionan 2.0
ml (2000 l) del reactivo de Biuret usando la pipeta de 5 ml. Nuevamente se debe mezclar
con ligeros golpecitos al tubo.
5. Permita que los tubos reposen 30 minutos mínimo a temperatura ambiente
6. Use la preparación (solución) en el tubo # 1 para ajustar el espectrofotómetro a
absorbancia cero, ya que éste es el “blanco”, pues solo contiene agua y el reactivo de
Biuret
7. Mida la absorbancia de cada tubo a 545 nm y anote los valores en la tabla a continuación
 Tubo BSA (l) A (545 nm) g de proteína
1 0 0
2 20 0.001 20
3 50 0.003 50
4 100 0.009 100
5 250 0.021 250
6 500 0.042 500
7 1000 0.084 1000

8. Indique la cantidad de proteína total en cada tubo. Recuerde que la solución stock de
BSA es 1.0 mg/ml o 1.0 g/l. Por ejemplo, si el tubo 2 contiene 5 l de la solución se
puede concluir que contiene 5 g de proteína ya que contiene una solución 1.0 g/l

Concentración Proteica del Extracto Alimenticio.

1. Prepare tres diluciones 1/10 seriales de tu solución desconocida de la siguiente manera:
adicione 900 l de buffer de fosfato pH 7.0 a tres vasos de precipitados pequeños. Mezcle
el extracto que se preparó anteriormente (extracto proteico) y adicione 100 l del extracto
al primer vaso y mezcle haciendo subir y bajar a la mezcla por la punta de la pipeta (solo
hasta el primer tope); esta será la dilución 1/10. Posteriormente, adicione 100 l de la
dilución 1/10 al segundo vaso para hacer una dilución 1/100, y mezcle de la misma
manera que con la disolución anterior. Finalmente, adicione 100 l de la dilución 1/100
al tercer vaso para hacer una dilución 1/1000 y nuevamente mezcle. Use estas diluciones
para preparar el ensayo que se describe a continuación.
2. Prepare un nuevo ensayo proteico como se muestra en la siguiente tabla:

Tubo Agua (l) Tipo de Volumen de la Reactivo de

Muestra muestra (l) Biuret (ml)
1 1000 Ninguna 0 2
2 600 Sin diluir 400 2
3 600 Dilución 1/10 400 2
4 600 Dilución 1/100 400 2
5 600 Dilución 1/1000 400 2

El volumen total en cada tubo antes de adicionar el reactivo de Biuret serán 1000 l (1
ml)

3. Usando una micropipeta adicione primero el agua a los tubos. Después adicione el
extracto proteico con contenido teóricamente desconocido; y mezcle mediante suaves
golpecitos al tubo.
4. Cuando todas las muestras estén preparadas, adicione 2 ml del reactivo de Biuret a cada
tubo usando la pipeta de 5 ml, y mezcle mediante golpecitos a los tuvos.
5. Permita que los tubos reposen a temperatura ambiente mínimo por 30 min.
 6. Mida la absorbancia de la solución en cada tubo a 545 nm y registre los valores.
Probablemente suceda que alguna de las soluciones esté muy obscura y de valores más
allá del rango de la curva standard; también puede suceder que alguna de las soluciones
está muy clara y dan valores de absorbancia muy bajos (<0.05) para tener algún
significado o ser precisos. Registre los datos para la proteína desconocida en la siguiente
tabla:

Tubo Muestra Volumen de la A (545 nm)

Muestra (l)
1 Ninguna 0 0
2 No diluida 400 2.157
3 Dilución 1/10 400 0.638
4 Dilución 1/100 400 0.095
5 Dilución 1/1000 400 0.009

1. RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Grafique los valores de la absorbancia de la curva standard de BSA (eje Y) en función de la

cantidad (en g) de BSA (eje X). Inserte la línea recta que mejor se ajuste a los datos, y obtenga
la ecuación de la línea recta (por facilidad realizar la gráfica en computadora). La línea recta
debe cruzar hasta el origen porque 0 BSA = 0 absorbancia (el blanco).

Una vez que se tenga una buena curva standard, obtenga el factor de conversión que relaciona
la absorbancia a 545 nm con la cantidad de proteína: __________ A545/g.
Este factor de conversión es la pendiente de la línea recta que se ajustó a la curva standard, y
puede ser calculada a partir de cualquier grupo de puntos convenientes dentro de la región
lineal de la curva.
Sin embargo, también se puede emplear directamente la ecuación de la línea recta que ya se
tiene para calcular cualquier valor deseado dentro de ésta curva standard. Anexe la gráfica a la
presente práctica.
El factor de conversión es de 0.00008

Para el análisis del contenido de proteína use solo aquellas muestras que presenten
absorbancias que “caigan” dentro del rango lineal de la curva standard de BSA.
Se puede interpolar directamente sobre la línea recta de la curva standard, usar la ecuación de
la recta, o simplemente usar el factor de conversión (la pendiente de la recta); pero
preferentemente emplee la ecuación de la recta.
Calcule la cantidad de proteína en g en cada una de las muestras que se puedan emplear. Es
decir, despeje “x” de la ecuación de la recta que debe tener la forma: y = m*x + b.

La ecuación de la recta es:

𝑦 = 8 ⋅ 10−5 𝑥 − 0.0003
La ecuación de la recta queda despejada de la siguiente forma:
(−𝑦 − 0.0003)
𝑥=
−8 ⋅ 10−5
De acuerdo con esto se obtuvo la siguiente tabla, en la cual se muestra el único valor de
absorbancia permitido, esto quiere decir que fue el único que cayó dentro del rango lineal de la
curva standar de BSA
X calculada Y
116.25 0.009

Corrija por el volumen usado en cada muestra y el factor de dilución, para calcular la
concentración de proteína en la suspensión proteica original en mg/ml. Por ejemplo, suponga
que 30 l de una dilución 1/10 contiene 13. 7 g de proteína, por lo tanto, la concentración de
proteína es:

Anexe los cálculos a la presente práctica

400 l de una dilución 1/1000 contiene 116.25 g de proteína, por lo tanto, la concentración de
proteína es:

(116.25µ𝑔) 1000µ𝑙 1𝑚𝑔 𝑚𝑔

⋅ 1000 ⋅   ⋅  = 290.625
400µ𝑙 𝑚𝑙 1000µ𝑔 𝑚𝑙
Si se tienen varias muestras que presentan valores de absorbancia dentro del rango lineal de
la curva standard, calcule la concentración de cada muestra proteica por separado; entonces,
obtenga el valor de la media de los valores de concentración para la solución original. De
presentarse esta situación registre el valor de concentración aquí. Concentración Final
promedio de Proteína: ____________ mg/ml

Después de completar la sección anterior, se debe tener un valor de concentración proteica del
extracto alimenticio en mg/ml. Multiplique este valor por el volumen total del extracto que
registraste después de mezclar con el buffer, de manera que así se obtendrá la concentración
total de proteína de tu muestra. Por ejemplo, si la concentración proteica fue 9.42 mg/ml, y el
volumen total del extracto fue 53.5 ml, la cantidad total de proteína puede ser calculada como:

Anexe los cálculos a la presente práctica

290.62𝑚𝑔
𝑥58𝑚𝑙 = 16856.25𝑚𝑔 = 16.85𝑔
𝑚𝑙

Toda esta proteína viene de la cantidad inicial de material que se adicionó al buffer medido
como peso o volumen. Dependiendo de si se usó la porción recomendada completa, un cuarto
de la porción o un octavo, calcule la cantidad total de proteína por porción recomendada
mediante una regla de tres. Realice los cálculos y anéxelos a la presente práctica.
La mayoría de las investigaciones sugieren que las personas muy activas deben ingerir de 1.2
a 2 gramos de proteína por kilogramo de peso corporal. Eso significa que una persona de 68
kilos debe comer de 82 a 136 gramos por día.

Suponiendo que la porción recomendada es de 82 g la porción utilizada fue de 1/8

82-100 x=12.195
10- x

2. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Los valores que se tienen en la etiqueta de valor nutrimental no son iguales a los valores
calculados en esta práctica, esta diferencia se debe principalmente a que la porción de proteína
que usamos no fue la sugerida por el producto, pero realizando los cálculos se puede llegar a
un análisis de que, en ambas porciones, el porcentaje de proteína corresponde al que marcan
las etiquetas.
Con esto, podemos decir que los resultados que nos dio esta práctica son confiables.

3. CONCLUSIONES

La absorbancia de la muestra es directamente proporcional a su concentración, ya que a mayor

cantidad y/o concentración de proteínas será mayor la interacción de “luz” con ellas, también
depende la distancia que recorre la luz por la muestra proteica y cuanta mayor sea la distancia
que recorre la “luz” por la muestra será mayor la concentración de proteínas.