INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

BITÁCORA PRÁCTICA 7: RESTRICCIÓN, LIGACIÓN Y TRANSFORMACIÓN

Dra. Estela Flores Gómez

Dr. Germán F. Gutiérrez Hernández

Integrantes del equipo:

Cortés Fuentes José Ángel

Espino Olmos Edgar Enrique
Hernández Silva Frida Tamara
López Jiménez Alexis Alberto

Grupo: 4BM1

Martes 15 de marzo 2022

Objetivos
General:
- Realizar la inserción de material genético dentro de un vector plasmídico.
- Realizar la transformación de células competentes con un plásmido extraído
por lisis alcalina.
Específicos:
- Conocer la metodología básica para cortar un vector utilizando enzimas de
restricción
- Conocer la metodología básica para insertar material genético de interés
dentro de un plásmido previamente tratado con enzima de restricción.
- Conocer la metodología básica para transformar células competentes con un
plásmido bacteriano.
- Determinar la eficiencia de transformación de células competentes de
Escherichia coli preparadas con CaCl2.

Metodología:
Reactivos:
Material Equipo Sustancias
Termo bloque Incubadora Plásmido
Placas de agar LB- Enzimas de restricción
Ampicilina Material genético de
interés (gen, producto de
PCR o casete)
T4 DNA ligasa
Buffer de restricción
Buffer de ligación
Células competentes
Reacción de PCR
Medio de cultivo líquido
Cuestionario previo:
1. Coloca una imagen de tu plásmido con sus características.

El vector con el que se trabajó fue el pBI121 con los sitios BamhI, HindIII y EcoRI.
El organismo obtuvo la característica de ser resistente a los antibióticos tetraciclina
y kanamicina (50 mg)
2. En un vector, ¿qué es el sitio múltiple de clonación
(SMC)?
Los sitios múltiples de clonación son regiones o
segmentos de DNA que tienen varios sitios de
restricción diferentes. Los sitios de restricción, por su
parte, son secuencias de entre cuatro y seis pares de
bases que son reconocidas por enzimas de restricción
y así poder cortarlas.
Estos múltiples sitios de restricción son únicos
para el vector y forman parte de un marco abierto de
lectura de un gen que tiene una característica
fenotípica, facilitando la comprobación de la inserción
del fragmento de DNA1.
Sitio de restricción múltiple del
plásmido pBR322. Watson, 1992
Éstos sitios suelen ser muy cercanos unos de otros y presentan una gran
oportunidad para colocar algún fragmento de interés de DNA.

3. ¿Un sito de corte puede encontrarse fuera del SMC?

De acuerdo con Dorado:
“La utilidad del sitio de clonación múltiple es que tiene secuencias de corte únicos en el vector para
decenas de enzimas de restricción, de modo que puede resultar fácil digerir el vector y el pasajero
con enzimas para ligarlos dentro del sitio de clonación múltiple. ”2

Esto presenta la explicación para la ubicación de los sitios de corte, puesto que
éstos se deben encontrar en los SMC y en dichos lugares pueden actuar las
enzimas de restricción.
Sin embargo, observando el vector trabajado en laboratorio, podemos observar
que éste cuenta con diversos sitios de corte, no encontrándose todos
necesariamente en un SMC.

4. De acuerdo con las enzimas de corte que se usaron de forma grupal, busca
los insertos de la marca correspondientes y pégalos en tu bitácora.
Para el vector pBI121, se adicionaron los siguientes insertos para conferir una serie
de resistencias específicas:
- Inserto TetR de 652 pb (entre el sitio 1339 y 1989), codifica para 216
aminoácidos. Es responsable de producir la proteína reguladora a la
resistencia de la tetraciclina.
 - Inserto NeoR/KanR de 795 pb (entre el sitio 2838 y 3632), codifica para 264
aminoácidos. Es responsable de producir la aminoglucósido fosfotransferasa
de Tn5 y confiere resistencia a la neomicina y kanamicina.

- Inserto KanR de 795 pb (entre 11,689 y 12,483), codifica para la

aminoglucósido fosfotransferasa y confiere resistencia a la kanamicina.

5. ¿Cuántos tipos de enzimas de restricción se conocen?, ¿qué características

tiene cada tipo?
Recordemos que las enzimas de restricción son las responsables de cortar el DNA
en los sitios de restricción. Las enzimas de restricción cortan el DNA rompiendo el
enlace fosfodiéster (en el eje azúcar fosfato) que une los nucleótidos adyacentes en
una cadena de DNA3. Se clasifican de la siguiente manera:
- Tipo I: son capaces de reconocer una secuencia de nucleótidos específica
para llevar a cabo un corte aleatorio en la cadena doble de todo tipo de
secuencia de DNA. Se realiza a una distancia de cerca de 1000 pb del sitio
de corte. Requieren de ATP para desplazarse en la cadena de DNA (del sitio
de reconocimiento hasta el sitio de corte). También son capaces de llevar a
cabo metilaciones en su genoma.
- Tipo II: son capaces de reconocer secuencias específicas y realizan los
cortes de la cadena doble cerca o en el mismo sitio de reconocimiento. Para
poder reconocer los sitios de restricción, éstos no deben estar metilados.
Utilizan magnesio como cofactor y sus secuencias de reconocimiento son
palindrómicas. Tienen gran utilidad en Ingeniería Genética.
- Tipo III: son capaces de reconocer secuencias específicas, cortando el DNA
en secuencias cortas fuera de la secuencia diana en dirección downstream.
Poseen actividad de metilasas y requieren de ATP para desplazarse por la
cadena de DNA.
 - Tipo IV: tienen la capacidad de reconocer regiones modificadas como es el
DNA metilado. Tiene naturaleza de tipo endonucleasa que permite la
reparación de sitios apurínicos y apirimídicos.

6. ¿Para qué utilizan las bacterias las ER?, ¿por qué es importante la
metilación?
En un contexto histórico, en la década de los 60, científicos estudiando bacterias
dieron con el descubrimiento que éstas eran capaces de tornarse resistentes a
bacteriófagos al limitar su replicación.
Werner Arber propuso que la limitación en la replicación de los fagos era
debida a enzimas que restringían su desarrollo al cortar su material genético. Es
importante recordar que, puesto a que las bacterias no cuentan con sistema inmune,
recurren a las enzima de restricción para fungir como un mecanismo de defensa.
La metilación tiene como función silenciar regiones del genoma, promotores
o enhancers que evita el reconocimiento por enzimas.

7. ¿Qué características posee un sitio de corte?

Generalmente son secuencias de nucleótidos de entre cuatro y seis pares de bases,
las cuales son reconocidas por las enzimas de restricción.
Los sitios de corte son palíndromos puesto que el orden de los nucleótidos
puede leerse tanto hacia adelante como hacia atrás.
Pueden ser cortes con extremos sobresalientes de una hebra que
conocemos como extremos cohesivos o pegajosos; mientras que puede haber por
otro lado cortes con fragmentos no sobresalientes de doble hélice a los cuales
llamamos extremos romos.

8. ¿Qué aplicaciones adicionales tienen las enzimas de restricción?

Son herramientas esenciales para el trabajo en ingeniería genética y clonación,
mapas de restricción de genomas o de plásmidos.
En nuestro caso, presentan la utilidad de construir vectores (o el uso de
plásmidos como fragmentos de DNA que pueden replicar otros fragmentos de DNA
de un organismo diferente para realizar clonaciones o producciones de un producto
de interés.
 9. ¿Qué tipo de ligasas se prefiere emplear?, ¿para qué necesitan las células
ligasas?
Una vez se tiene el fragmento de DNA separado y se pretende adicionar el
fragmento externo, es necesario unir los extremos cohesivos o romos, dependiendo
del caso.
Para esto, la enzima de preferencia es la DNA ligasa, aquella que actúa en
la replicación del DNA y tiene la capacidad de unir los fragmentos del DNA. Si los
extremos del DNA cuentan con extremos complementarios, la ligasa puede unirlos
para producir una única molécula. (Preferentemente la T4 ligasa)
Ésta reacción se lleva a cabo por medio del ATP que proporciona energía a
la ligasa para catalizar una unión del grupo fosfato del extremo 5’ al grupo hidroxilo
del extremo 3’ de la cadena opuesta para dar lugar a un esqueleto azúcar fosfato
completo.

10. ¿Qué contiene el buffer de la ligasa?, ¿cuál es la función de estos

componentes?
Para el buffer de DNA ligasa T4 se tiene una composición de las siguientes
sustancias:
a) Tris-HCl: abreviatura de trishidroximetil aminometano es una sustancia muy
usada para soluciones tapón con alta solubilidad en agua y tiene un rango de
acción de pH entre 7 y 9, presentando utilidad para el trabajo con ácidos
nucleicos. El HCl es responsable de bajar el pH a 7.
b) MgCl2: es usado por la DNA polimerasa como cofactor (Mg+), también
permite la estabilización de la doble cadena de DNA.
c) ATP: proporciona la energía a la DNA ligasa para la reacción de ligación.
d) DTT: es un agente reductor en el trabajo con proteínas y permite reducir
disulfidos en soluciones tampón biológicas.
e) Polietilenglicol 8000: es usado para prevenir la formación de cristales en
emulsiones, protege al DNA.

11. ¿Cómo funciona el sistema de selección de colonias blancas y azules del

gen lac?
La selección azul-blancas es una de las más usadas en las técnicas de clonación,
por lo que es necesario explicar el funcionamiento de éste.
En organismos como E. coli, el gen lacZ es responsable de la producción de
la β-galactosidasa, enzima responsable de la degradación de la lactosa en glucosa
 y galactosa. Este gen puede ser interrumpido al insertarse otro fragmento de DNA
que previene que se codifique la enzima.
Al tenerse a las bacterias transformadas, se procede a sembrarlas en agar
con presencia de ampicilina (un antibiótico). Aquellas bacterias no transformadas
son incapaces de crecer en este medio debido a la ausencia del gen que les confiere
resistencia al antibiótico.
Por otro lado, el agar tiene una sustancia cromogénica llamada x-gal,
parecida a la lactosa estructuralmente y que cambia de color a azul una vez la β-
galactosidasa actúa sobre ella.
Con esto, las bacterias que no son recombinantes y tienen un gen lacZ
funcional, producen tanto β-galactosidasa, de manera que tornan el color de x-gal a
azul. Mientras tanto, las bacterias recombinantes son las que no producen β-
galactosidasa y su color permanece como blanco cremoso.
Así, decimos que las bacterias (colonias) no recombinantes (o azules) son
seleccionadas en contra, mientras que las blancas y sí recombinantes son
seleccionadas a favor.

12. ¿Cómo se puede prevenir que se recircule un vector con extremos

compatibles?
Es importante conocer que la ligación de DNA es aún ineficiente por cualquier
método puesto que se presenta un fenómeno que llamamos recirculación. Cuando
se lleva a cabo una ligación, los plásmidos digeridos pueden unirse consigo mismos
nuevamente, creando un plásmido circular sin DNA externo.
Para evitarse este problema, se debe tener un vector adecuadamente
tratado, con una buena purificación, digestión y que haya sido defosforilado. Este
último paso es importante puesto que, al cortarse con una enzima, se retiran los
fosfatos terminales del DNA, previniendo así la recirculación.

13. ¿Qué métodos de transformación conoces? Realiza una tabla y coloca

método, cómo es la técnica, ventajas y desventajas y a qué tipo de célula se
aplica?
Método Descripción Ventajas Desventajas Célula a la
que aplica
Químicos
Heat shock/ Por medio de un Relativamente sencillo No se tiene un Células
cloruro de tratamiento químico se y rápido de obtener consenso completo competentes
logra neutralizar la resultados. sobre cómo funciona
calcio carga de la membrana esta técnica.
 celular, posteriormente
se recurre a un cambio
brusco de temperatura
que lleva a la
formación de poros en
la célula y el material
genético puede entrar
a ésta.
DEAE dextrano Los polímeros de No requiere de El uso del DEAE se
DEAE dextrano o cambios bruscos de limita a transfecciones
polybreno tienen una temperatura transientes.
carga que permite la
unión a las moléculas
negativas del DNA.
El DNA ingresa por
medio de un choque
osmótico o glicerol.
Lipofección Basado en formar El complejo tiene Los lípidos tienen alto
complejos de lípidos afinidad por la precio y no todos son
catiónicos y DNA. membrana y por ello útiles para diferentes
puede entrar el DNA. tipos de células.
Tiene eficiencias del 70
al 90%
Esferoplasto Remueve la pared de Se corre el riesgo de Células con
celular con enzimas muerte de la célula. pared celular
que las degradan y hay
recaudos que evitan su
muerte. Se incuban en
medios PEG para
incorporar DNA ajeno.
Litio Incuba células con Puede desestabilizar a Se limita al trabajo con Hongos con
acetato de litio y PEG las células sin requerir hongos pared celular
para realizar un shock esferoblastos
térmico.
Físicos
Electroporación Provoca un aumento Uno de los métodos Puede provocar un Células
en la permeabilidad más comunes en el severo estrés celular o bacterianas,
celular recurriendo a trabajo de DNA la destrucción de las levaduras y
micropulsos eléctricos recombinante membranas vegetales
Sistemas Cubre micropartículas Rápidamente introduce Es caro por el tipo de Células con
biobalísticos de oro con DNA y se el material genético. metales que se usa y pared celular
disparan como no siempre garantiza el como hongos y
proyectiles a las ingreso del material plantas
células. genético
Microinyección El DNA se introduce Es directo eficiente en Es un proceso tedioso Células de
directamente al citosol la inserción del al hacerse célula por mamíferos
fragmento célula

14. De acuerdo con el tipo de célula competente que usaste, ¿qué método de
transformación de los anteriores puedes usar?
Podemos recurrir al uso de choque térmico mediante la adición de sustancias
químicas como el CaCl2, de manera que se neutraliza la carga de la membrana
celular y se puede inducir a la formación de poros por donde puede ingresar el
material genético que deseamos incorporar.
Por otro lado, podemos recurrir también a la electroporación dado a que es
un método muy común en este tipo de trabajos, cuidando la potencia de la corriente
eléctrica para así no dañar a la célula.

15. De acuerdo con tu práctica, ¿cuál es el efecto del choque térmico?

Una vez se llevó a cabo el tratamiento químico (aclarando que éste se realizó
mientras se tenían temperaturas bajas), nos encontramos con una cuestión que
sigue siendo estudiada por la comunidad científica: un cambio en la temperatura del
medio en el que se encuentran las células es responsable de la formación de los
poros a través de los cuales ingresa el material genético externo.
Se cree que el choque térmico (pasar de temperaturas bajas a altas
rápidamente) provoca una disminución en la fluidez que fue causado por una
liberación de lípidos de la superficie celular al medio extracelular4.

16. ¿Qué criterios se consideran para elegir el adecuado entre los diferentes
métodos de transformación?
En primera instancia es necesario contemplar el tipo de célula con la que se está
trabajando.
En caso de tenerse células con pared celular, es necesario recurrir a métodos
más agresivos como puede ser el esferoblasto, los sistemas biobalísticos o la
electroporación. Por otro lado, se puede recurrir a métodos como la microinyección
si estamos trabajando con células de mamíferos.
Todas estas células presentan sus necesidades específicas que deben
acatarse para bien no dañarla o que el material genético pueda introducirse con
éxito en ésta.
17. ¿Qué es un marcador de selección?, ¿cuál se utilizó y qué otros existen?
Son genes que proporcionan resistencias ante antibióticos o producen un fenotipo
en específico que puede ser seleccionado en el organismo con el vector. Suelen ser
únicos en los vectores.
En el caso del vector pBI121trabajado en el laboratorio, consideramos los
marcadores de TetR (resistencia a la tetraciclina), NeoR y KanR (resistencia a la
kanamicina).
 Los más comunes son los marcadores de resistencia a antibióticos como la
ampicilina y la kanamicina. Existen también vectores con un segundo marcador de
selección, como es el caso del gen lacZ, explicado previamente en la pregunta 11.

18. ¿Por qué es importante la selección del vector y construcción génica

adecuados para cierta célula?
Es importante conocer que existen dos tipos de vectores: los de clonación, que
buscan obtener cantidades grandes de DNA insertado; y los de expresión, que
tienen como fin producir un metabolito o proteína resultante de la transcripción y
traducción del fragmento.
Con esto, debe tenerse en claro el fin que se busca con el vector a trabajar,
dependiendo de lo que se busca obtener. Por otro lado, podemos tener la variedad
siguiente de vectores:
a) Plásmidos: moléculas de DNA extracromosómico que se replican
independiente del cromosoma bacteriano. Pueden existir en múltiples copias
y en éstos se puede introducir material genético que la maquinaria celular es
capaz de replicar o traducir de perseguirse ese fin.

b) Bacteriófagos: naturalmente, son virus que infectan a bacterias y hacen uso

de sus enzimas para producir más copias de éstos y su material genético, de
manera que se pueden modificar al añadir sitios de restricción dados con
fragmentos de material genético más grande que en los plásmidos.

c) Cósmidos: son híbridos de DNA de un plásmido y de sitios cos de un

bacteriófago, con gran capacidad de inserción de fragmentos. Son capaces
de replicarse de forma independiente.

d) Cromosomas artificiales: son de cientos de kb de tamaño y tienen utilidad en

el estudio de bacterias o levaduras

19. ¿A qué se refiere la eficiencia de transformación? Coloca la fórmula para su

cálculo.
Conocida también como eficiencia de transformancia, es una medida de qué tan
bien se llevó a cabo el proceso de transformación bacteria. Esto es importante
puesto que, a pesar de tenerse procesos bien conocidos y definidos, no siempre se
llevará a cabo una transformación exitosa,
Para determinar la eficiencia de transformación es necesario conocer tres
valores principales:
 a) # de colonias contadas en la placa o el medio.
b) Cantidad de DNA transformado (μg)
c) Dilución total del DNA previo a emplatar.
De esta manera, tenemos que la expresión para determinar la eficiencia de
transformación es la siguiente:
# 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
𝜇𝑔
𝐸𝑇 =
𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Bibliografía:
- González, J., Bueno, M. (2013). Enzimas de restricción. Salazar Montes A, &
Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular.
Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. McGraw Hill.
Recuperado en marzo de 2022 de
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectioni
d=102743841

- Khan Academy. (2018). Las enzimas de restricción y la ADN ligasa. Khan

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- Kroemer, T, Gallego, A. (2022). ¿Cómo resolver problemas de

transformación bacteriana? Gold Biotechnology. Recuperado en marzo de
2022 de Cómo Resolver Problemas De Transformación Bacteriana? | GoldBio

- Pietrasanta, L., Bush, A. (2018). Tópicos de biofísica molecular. Universidad

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- Sandoval A., Mena, M., Márquez, A. (2013). Vectores de clonación y

expresión. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz
Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las
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- SnapGene. (2021). pBI121. SnapGene. Recuperado en marzo de 2022 de

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- Tecnológico de Costa Rica. (2017). Conceptos básicos de la tecnología de

ADN recombinante. TEC. Recuperado en marzo de 2022 de BIOTECNOLOGÍA
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- Invitrogen Life Technologies. (2022). T4 DNA Ligase Buffer. ThermoFisher

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Citas:
1. Gómez, M., Echenique, V. (2017). Biotecnología y mejoramiento vegetal.
Universidad Nacional de Quilmes. Recuperado en marzo de 2022 de II_3.pmd
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2. Dorado, G. (2016). Clonación de DNA amplificado mediante PCR. Campus

Universitario de Rabales. Recuperado en marzo de 2022 de Sesiones 1 y 2
(uco.es)

3. Thieman, W., Palladino, M. (2010). Introducción a la biotecnología. Pearson

Education, 2da Edición, 59.

4. Subrata Panja, Pulakesh Aich, Bimal Jana & Dr Tarakdas Basu (2008) How
does plasmid DNA penetrate cell membranes in artificial transformation
process of Escherichia coli?, Molecular Membrane Biology, 25:5, 411-422,
DOI: 10.1080/09687680802187765