BIOTECNOLOGIA

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Guía de laboratorio Viabilidad celular Página 1 de 3

DOCUMENTO ACADEMICO

Facultad Facultad de Ciencias

Programa Química Farmacéutica
Nombre de la Asignatura Biotecnología
Código de la Asignatura 17660 Semestre VI Periodo Académico 20202
Área Curricular Profesional

Nombre estudiante
Código:

Grupo:

Resumen

El conteo celular o de células es necesario para la cuantificación de su número en laboratorio y se lleva a cabo con un
hematocímetro o cámara de Neubauer, la cual es una placa hecha de vidrio óptico con forma de portaobjetos con
dimensiones de 30x70 mm y un espesor de 4 mm. En su parte central está dividida en tres y es en medio donde se realiza
el conteo de células y está formada por 400 cuadrados pequeños. Mediante

Prelaboratorio
Cada estudiante para asistir al laboratorio mínimo deberá preparar los siguientes contenidos y
entender la guía propuesta a continuación

1. Cada estudiante debe generar el esquema básico donde se describan los pasos para realizar, cultivo
celular, tripsinización y recuento celular.
2. Identificar los reactivos para tinciones vitales que se utilizaran y tener claro para que se usan.
3. Como se calcula el número de células total, células vivas y células muertas.
4. Describir los principales métodos de evaluación celular

Laboratorio

Posterior a la cuantificación de proteínas, se debe realizar su evaluación mediante Western blot para
identificar la molécula blanco, una vez identificada la molécula se puede realizar todo el proceso Downstream
para garantizar la obtención de un producto puro. Posteriormente deberemos realizar el proceso de
evaluación celular, mediante recuentos y viabilidad celulares.

Cultivo celular.
Descongelar células para cultivo. **Se utilizarán fibroblastos gingivales humanos (HFG-1) de ATCC CRL-2014
o de cultivo primario. El descongelado de los fibroblastos es un proceso que hay que realizar cuidadosamente,
considerando que en gran parte, la viabilidad de los mismos depende de su correcta descongelación.

Procedimiento:
1. Tener listo el medio de cultivo adecuado.
2. Se introducen los crioviales donde se encuentran los fibroblastos (a -80 °C), en agua destilada que se
calienta a 37 °C y se introduce el criotubo hasta que se descongelen. Se vierten los fibroblastos en
una caja de Petri con una micropipeta y se agregan 10 mL de medio DMEM suplementado
permitiendo que todo el medio humedezca el fondo del plato de cultivo.
3. Colocar en la incubadora a 37 ºC, 5% de CO2 y una atmósfera de 95% de humedad.
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4. Según la confluencia celular observada bajo el microscopio, el cambio del medio de cultivo se hace al
segundo día y posteriormente cada tercer día.
Subcultivo de fibroblastos gingivales (HGF).
1 El siguiente paso es agregar 1 mL de tripsina-EDTA para despegar las células incubando a 37 °C con
5% de CO2 durante 5 minutos y comprobar con ayuda del microscopio el desprendimiento celular bajo
microscopio.
2 Para neutralizar la reacción provocada por la tripsina-EDTA una vez que las células ya estén
despegadas, se agrega medio de cultivo a 4 veces el volumen (4 mL) que se tiene de tripsina-EDTA, se
centrifugan las células, se descarta el sobrenadante y se resuspende el pellet agregando medio de cultivo
fresco.
3 Se procede al conteo de células, utilizando una cámara de Neubauer.

Colocación de la muestra en la cámara de Neubauer.

1 Se coloca un cubreobjetos en la superficie central de la cámara de Neubauer
2 Con una micropipeta se toman 10 µL de la muestra de los fibroblastos y se pipetea cuidadosamente en
uno de los extremos del cubreobjetos evitando vaciar exceso de muestra ya que esto ocasionaría que
éste quede levantado. También hay que evitar la presencia de burbujas, de ser así habrá que empezar de
nuevo el procedimiento. Una opción más específica es el conteo por exclusión de azul tripano. Método
que cuantifica el número de células que no se tiñen por el colorante y este se realiza al tomar 10 µL de la
muestra de los HGF y 10 µL de azul de tripano en un tubo de Eppendorf y posteriormente llevar 10 µL a
la cámara de Neubauer. Este método asegura un número real de células viables. Se debe tomar en
consideración que la acción de la tripsina puede inducir la muerte de algunas células.
3 Se coloca la cámara de Neubauer en el microscopio, se procede a enfocar utilizando el binocular y los
objetivos.
4 Una vez que las células ya estén enfocadas, esto es, que se vean nítidas, se procede a realizar el
conteo en cada uno de los cuadros que son en total: L1, L2, L3, y L4. Ver esquema 1.

Se añade una pequeña cantidad de la mezcla de células y azul de tripano sobre el portaobjetos y se
coloca un cubreobjetos sobre la muestra. Una vez enfocadas las cuadrículas se cuentan las células que
hay en los recuadros divididos en 16 cuadrículas (ver esquema: recuadros A, B, C y D).
La media aritmética de los 4 recuentos efectuados (A, B, C y D, multiplicada por el factor de la cámara
(10.000) y por el factor de dilución (100/90) arroja la concentración de células en la muestra (células / mL).

Análisis de resultados

1. Cada estudiante evaluara los resultados obtenidos contrastando con lo que por literatura debió
obtener.
2. Contrastara los resultados que debería esperar al usar su molécula del 3 módulo en evaluaciones de
viabilidad celular

Conclusiones
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Cada estudiante realizará la discusión critica de los resultados obtenido y propondrá las estrategias para
realizar el procedimiento de la forma más eficiente

Bibliografía

Ensayo de citotoxicidad con MTT: http://biomodel.uah.es/tecnicas/cel/MTT.htm

Viabilidad y conteo celular: https://es.slideshare.net/uscbio225/viabilidad-y-conteo-celular