PRÁCTICA 8
Práctica 8. Producción de biomasa en cultivo por lote
Producción de biomasa en
Cultivo por lote
INTRODUCCIÓN
Los procesos de bioconversión se clasifican de acuerdo con la entrada y salida de
la fase líquida en tres grupos: cerrados, abiertos y semicerrados. Al primer grupo
pertenece el cultivo por lote, en el que una vez iniciada la bioconversión ya no hay
entrada ni salida de la fase líquida, donde se realiza la bioconversión; si hay entrada
y salida de aire que suministra oxígeno para la respiración de los microorganismos.
La gran mayoría de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo en cultivo
por lote. Este consiste en agregar al biorreactor un medio de cultivo con los
nutrientes necesarios para crecer el microorganismo y obtener un producto. El
medio de cultivo después de ser esterilizado y enfriado a la temperatura óptima de
crecimiento del microorganismo se inocula con el microorganismo que produce el
producto de interés. Una regla heurística menciona que el volumen del inoculo debe
ser el 10% del volumen de operación del biorreactor.
La duración de un cultivo por lote depende del tipo de producto a obtener, sí es un
metabolito primario, también denominado producto asociado al crecimiento,
entonces el cultivo por lote termina cuando se agota el sustrato limitante; en cambio,
si se trata de un metabolito secundario o producto no asociado al crecimiento,
entonces el cultivo por lote tiene una duración mayor al tiempo de agotamiento del
sustrato limitante, puesto que la producción de dicho producto se lleva a cabo en la
fase estacionaria. Terminada la bioconversión se cosecha la totalidad del volumen
de medio de cultivo agotado para recuperar el producto. El biorreactor vacío se
limpia y lava para realizar la siguiente bioconversión.
La determinación de los parámetros cinéticos de un cultivo por lote pretende
conocer, predecir y controlar la bioconversión. El cultivo por lote es un proceso en
estado no estacionario, porque la concentración de biomasa, sustrato y producto
cambian durante el tiempo de duración del cultivo.
ACTIVIDADES PARA EL APRENDIZAJE AUTÓNOMO
Los estudiantes en trabajo colaborativo desarrollarán los temas enunciados a
continuación y los presentarán al grupo mediante una presentación digital, en un
tiempo de 40 minutos.
o Gráficas y descripción de las cinéticas en cultivo por lote, de crecimiento
microbiano, consumo de sustrato y formación de producto.
o Definición de constantes cinéticas y coeficientes de rendimiento, así como la
forma en la que se calculan.
o Fundamento de la técnica para determinar azúcares reductores por el
método del DNS.
o Fundamentos de espectrofotometría para la determinación de concentración
celular.
OBJETIVO
El alumno determinará los parámetros cinéticos de la levadura Sacharomyces
cerevisiae creciendo en cultivo por lote.
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipo:
Biorreactor de agitación mecánica de 0.5 L
Autoclave.
Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
Parrillas de calentamiento.
Espectrofotómetro.
Centrífuga clínica.
Balanza analítica.
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae
Medio de cultivo
Para la preparación de inóculo y para el cultivo por lote, en g/L:
Glucosa, 15; (NH4)2SO4, 2.73; NaH2PO4, 1.27; extracto de levadura, 1.
Las siguientes sales: FeSO4 7H2O, CuSO4 5H2O, ZnSO4 H2O, Na2MoO4 2H2O y
MnSO4 H2O, se agregan en una solución concentrada; el volumen a emplear se
calcula mediante la siguiente ecuación:
Volumen de solución concentrada (mL) = 0.05 x concentración de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Las técnicas para determinar la concentración celular y glucosa están descritas en
el Anexo de prácticas 8, 9 y 10.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Preparar el reactivo DNS de acuerdo con la técnica presentada en el anexo 1.
2. Preparar el inoculo: En dos matraces de 250 mL, preparar 30 mL de medio de
cultivo, esterilizar, enfriar e inocular con la cepa a emplear e incubar a 30 °C durante
24 horas.
3. Preparar 270 mL de medio de cultivo y agregarlo al biorreactor de 0.5 L provisto
con filtros absolutos y toma de muestra; esterilizar a 15 lb/in2 durante 15 min y
enfriar.
4. El biorreactor se coloca en su gabinete, se conecta el suministro de aire a 1 vvm
y se agita a 200 rpm.
5. Tomar una muestra del medio de cultivo, ponerla en una celda de
espectrofotómetro de 1 mL y cubrirla con Parafilm; ésta es el blanco para medir la
absorbancia a 590 nm de las muestras obtenidas durante todo el cultivo.
6. El biorreactor en condiciones asépticas inocularlo con el contenido de uno de los
matraces de inoculo. Esperar 3 minutos y tomar la primera muestra de 1.5 mL,
previamente tomar 1 mL de muestra para purgar el medio de cultivo estancado en
el tubo de toma de muestra. Las purgas vaciarlas en un recipiente destinado para
ello. La toma de muestra es cada hora.
7. La muestra ponerla en una cubeta de espectrofotómetro de 1 mL para medir la
Absorbancia a 590 nm. Si la Absorbancia es mayor a 1, hacer la dilución
correspondiente para que la Absorbancia sea menor a 1.
8. La muestra sin diluir, en un tubo Eppendorf centrifugarla a 5000 rpm durante 5
min. El sobrenadante ponerlo en otro tubo Eppendorf, etiquetarlo y refrigerar. Los
sólidos vaciarlos al recipiente de purgas y lavar el tubo Eppendorf.
9. Con la curva tipo de Absorbancia vs concentración celular, calcular la
concentración celular en el biorreactor, tomar en cuenta si se realizó dilución.
10. Con la curva tipo de Absorbancia vs concentración de glucosa, calcular la
concentración de glucosa en el biorreactor, tomar en cuenta si se realizó dilución.
TRATAMIENTO DE DATOS EXPERIMENTALES
1. Las cinéticas de crecimiento y consumo de sustrato presentarlas en una sola
gráfica.
2. Hacer una gráfica del Ln (x/x0) vs tiempo y otra donde eliminando puntos iniciales
y finales (si es necesario) se obtenga una línea recta con un coeficiente de
correlación cercano a 1.
3. Ajustar los datos experimentales de crecimiento y consumo de sustrato a un
modelo matemático exponencial o polinomial, que tengan un coeficiente de
correlación cercano a 1. El modelo matemático derivarlo con respecto al tiempo para
calcular dx/dt y ds/dt. Llenar la Tabla 1 que tiene el encabezado siguiente:
Tabla 1. Datos experimentales y parámetros cinéticos del cultivo por lote de
Saccharomyces cerevisiae
Tiempo x s 1/x dx/dt ds/dt µ qs Yx/s
(h) (g/L) (g/L) (L/g) (g/Lh) (g/Lh) (g/gh) (g/gh) (g/g)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los estudiantes en equipos de trabajo elaborarán una presentación digital de los
resultados obtenidos y en plenaria la mostrarán al grupo. La información para
presentar es: gráfica de las cinéticas de crecimiento y consumo de sustrato, con los
modelos matemáticos que se ajusten a los datos experimentales; gráfica de Ln (x/x0)
vs tiempo y otra donde eliminando puntos iniciales y finales se obtenga una línea
recta; y, la Tabla 1. Los estudiantes presentarán cada una de las gráficas y la Tabla
1, las describirán, las analizarán y concluirán.
La discusión versará sobre los siguientes aspectos:
o Etapas de crecimiento observadas en la práctica.
o El valor de las constantes cinéticas y coeficiente de rendimiento encontrados
en la práctica, específicamente que información útil se puede obtener para
tomar decisiones.
o El tiempo del cultivo según el producto obtenido y el tipo de microorganismo
empleado.
o El tamaño del biorreactor requerido para satisfacer una demanda anual del
producto.
BIBLIOGRAFÍA
Blanch, H. W., & Clark, D. S. (1997). Biochemical Engineering. CRC Press.
Shigeo, K., Jun-ichi, H., & Fumitake, Y. (2015). Biochemical Engineering. A texbook
for engineers, chemists and biologists. Wiley-VCH; 2nd edition.
Shuler, M. L., Kargi, F., & DeLisa, M.-. (2017). Bioprocess Engineering. Basic
Concepts. Pearson.
Vogel, H. C., & Todaro, C. M. (2014). Fermentation and Biochemical Engineering
Handbook. William Andrew.
