TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS BÁSICAS

J Floreza, J Aponteb, A Possoc

a,,b,y c
Facultad de ciencias naturales, universidad ICESI
a
jhon.florez@correo.icesi.edu.co
b
juan.aponte@correo.icesi.edu.co
c
caldas1115@hotmail.com

Abstract
En la practica de laboratorio se realizaron 4 técnicas de micro biología básica con el fin
de familiarizarnos con estas técnicas realmente importante en procesos industriales. La
primera técnica utilizada fue la tinción de gran la cual no permitió ver y diferenciar
baterías gran positivas de las gran negativas , la segunda técnica utilizada fue el
recuento en el cual se contaron los microrganismo por cuadrante y cuales estaban vivos,
posteriormente se realizo la siempre en estría donde no hubo diferencias en el
crecimiento debido al largo tiempo de cultivo y finalmente se realizaron las diluciones
de una muestra de yogurt y se concluyó que si contenía probióticos. Estas 4 técnicas de
laboratorio utilizadas nos permitieron realizar un correcto cultivo, conteo y análisis de
diferentes tipos de microorganismos.

INTRODUCCIÓN
Para el estudio de los microorganismos se han diseñado cierto s tipos de técnicas o
méto- dos que permite su cultivo, recuento y análisis bajo condiciones artificiales. Si
bien es cierto que cada microorganismo es único en requerimientos nutricionales para
su crecimiento y cultivo existe muchas técnicas generales que nos permiten hacer un
recuento de ellos, elimi- nando casi que totalmente qué tipo de microorganismo sea.
Entre estas técnicas de conteo y visualización encontramos la coloración de Gram, el
recuento y viabilidad examinada al microscopio, técnicas de estría y las diluciones
decimales de la muestra.1
La coloración de Gram es la técnica más importante de tinción bacteriológica
desarrollada por el medico danés Hans Christian Gram en 1880. Esta técnica permite
diferenciar a las bacterias en dos grandes grupos. Por un lado, permite que las baterías
Gram negativas ( las cuales poseen una pared celular gruesa, rica en peptidoglucano ) se
tiñan de un color azul- violeta mientras que las bacterias gran negativas ( de una pared
celular mas delgada y con una delgada capa de peptidoglucano ) se tiñan de un color
más rosado-rojizo mediante un proceso de declaración. En pocas palabras, la diferencia de
concentración de peptidoglucanos entre ambos tipos de bacteria permite que la tinción en
una sea mas fuerte que en la otra y por t anto pueda ser diferenciadas.2
Otra técnica muy utilizada en la microscopia es el recuento y la viabilidad examinada
March 8,
2020
en el microscopio. Para esta técnica se utilizan las cámaras de Hawksley y la de Petroff-
Hausser generalmente. Esta técnica consiste en, literalmente, contar los
microorganismos

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 previamente tratados que se encuentran en unos cuadrantes observados al microscopio,
según sea la cámara se puede usar con aceite de inmersión (cámara de Hawksley ) o con
objetivos secos (cámara de Petroff-Hausser). La ventaja del recuento microscópico
radica en que es capaz de brindar información no solamente en cuanto a la cantidad de
microorganismos sino también su tamaño y su morfología.3
La técnica de siembre en estría es una técnica muy utilizada en microbiología para
aislar cepas puras en una placa Petri o para determinar el crecimiento microbiológico de
una cepa en particular. Esta técnica consiste en realizar una siembre con ayuda de un
asa previamente esterilizada, esta siempre son rayas en la superficie de cultivo de una
caja Petri con la intensión de que en cada pasada el número de células depositado sea
menor que el anterior. Finalmente la última pasada deberá depositar o cultivar un
numero de células tan pequeño que luego de su crecimiento se puedan formar colonias
totalmente puras.4
Finalmente, una técnica muy usada en microbiología para el estudio de alimentos
son las diluciones sucesivas de una muestra. Esta técnica consiste en tomar una muestra
de un ali- mento, generalmente líquido, y realizarle sucesivas diluciones en las cuales por
cada dilución se realiza un cultivo en caja Petri, la idea de esta técnica radica en lograr
un distribución uniforme de microorganismos contenidas en la muestra. De esta
manera, se pretende en- contrar el numero de microorganismos por unidad de
volumen, hasta que asegurarse que después de la incubación se obtenga un resultado
que sea cuantificable, para esto se realizas las diluciones serias que sean necesarias.4

Metodología.

PETRIS DISH, Dia 90 mm x 15 mm, PS material, claro, Superficie no tratada. Mi-

croscopio E100 Nikon. Camara de Neubauer 0,0025 mm 2 ISO LAB. Cabina de
seguridad biológica clase II, tipo A2, marca ESCO con norma NSF/ANSI 49:2008, fecha
de calificación 26 de septiembre 2019. Sistema de Autoclave Sterlof ® Modelo 60/
1PGRS.
Reactivos; Cristal Violeta, Fucsina, Lugol , Alcohol acetona, Agar Sabouraud
Fundido, Agar MSR, Solución de Azul de metileno al 0,1%, Cultivo líquido de levaduras,
Frascos lavadores con hipoclorito, Frascos lavadores con Agua Destilada, Etanol 70%,
agua peptona.
Tinción de Gram:
Se realizó el método de coloración de Gram para una muestra de Pseudomonas
aeruginosa. Para esto se flameo un aza para esterilizar, y se procedió a colocar una
muestra del microorganismo en una placa de vidrio. Para la coloración de gram se usó el
siguiente orden de reactivos: Cristal violeta, lugol, solución alcohol/acetona y por ultimo
fucsina. Después de aplicar cada reactivo se realizó un lavado. Por último, para visualizar
las colonias se usó el objetivo de 100X.
Recuento y viabilidad de levaduras.
Para este técnica se usó la levadura Pseudomonas aeruginosa, se realizo recuentos y
aislamiento por estrías para la purificación de las colonias. El recuento de se realizó por
 medio de una cámara de Neubauer , para esto, previamente se realizó una solución con
azul de metileno. Para sembrar se uso un medio solido de SD en el cual se inoculo la
levadura por el método de estrías.
Aislamiento y purificación:
Se toma una muestra de yogurt de yogurt comercial marca Alpina, a la cual se le aplicaron
5 diluciones decimales para realizar un recuento de la cantidad de bacterias que se encuentran
en el yogurt. Las diluciones se realizaron 1:9 en medio liquido de agua peptonada . Para el
recuento, se inocularon 1 mL de cada dilución en 2 tipos de medios sólidos, uno de MSR y
otro de agar Sabouraud.

Resultados y discusión.
Las técnicas realizadas en el laboratorio fueron bajo condiciones de asepsia y con las
precauciones necesarias para el crecimiento de los microorganismos.
Tinción de gram:
Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios
donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya
que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias
Gram negati- vas y bacterias Gram positivas, de las tinciones más utilizadas
universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta.5
Para este caso tenemos una tinción de color rosado, lo que nos indica que es una
gram negativa, lo que va acorde con la teoría, ya que se le hizo la tinción de gram a una
Pseu- domonas aeruginosa, y estas resultan positivas ante esta coloración. Lo que
indica que la coloración es válida y concuerda con la teoría.

Figura 1. Imagen de la Pseudomonas aeruginosa en la tinción de gram.

Se realizaron sembrados de una levadura, Saccharomyces cerevisiae en un medio de cultivo CB

comercial, en la cual se pudo observar un crecimiento exponencial en la formación de colonias
en este medio de cultivo, también se puede decir que debido al tiempo de incubación al cual
fue expuesto el microorganismo, no es posible divisar si la técnica empleada al momento de
sembrar estos cultivos fue de buena calidad o no. Cabe decir que no se encuentra material
fotográfico para corroborar esta información.
Al realizar el conteo en la cámara de Neubauer, se encontraron alrededor de 20
microorganismo en los cuales se puede distinguir si los microorganismos están vivos o no. La
tinción con azul de metileno es una metodología de tinción directa en la cual se puede
visualizar de forma directa los microorganismos. De esta tinción tampoco se encuentra
registro fotográfico.
Para finalizar, se realizó un recuento por diluciones de un yogurt de marca comercial, de los
cuales se obtuvieron los resultados obtenidos en la siguiente tabla:

Tabla 1. Recuento de las diluciones

1*10-1 1*10-2 1*10-3 1*10-4 1*10-5
Agar MSR - - - 18 0
Agar SD - - - 20 0

Dado los datos obtenidos se puede decir que la matriz fue afectada por la dilución lo cual se
estima que las unidades formadoras de colonias sean menores de 1x10 4 en ambos medios.
Figura 2. Medio de cultivo #3 con diluciones de 1x10-3 en agar MRS
 Figura 3. Medio de cultivo SD con dilución en 1x10-3

Conclusión
Basándonos en los objetivos propuestos de la guía y las metodologías se realizan las siguientes
conclusiones.
* Se conocieron diferentes técnicas de microbiología básica que nos permitió el estudio de
microorganismos de interés industrial. Estas técnicas nos permitieron realizar conteo
microbiológico, observar estructura y determinar número de microorganismos por unidad de
volumen en diferentes muestras.
* Entre las practicas utilizadas en el laboratorio una de las más destacables es la tinción de Gram
debido a su rápida y fácil aplicabilidad además de su gran eficiencia para diferenciar las baterías
Gram positivas y Gram negativas gracias a su principal componente estructural diferencial (su
diferencia de concentración de peptidoglucanos)
* Gracias a las técnicas utilizadas en el laboratorio se pudieron reconocer características micro y
macroscópicas como la formación de colonias, la forma externa de algunos microorganismos y la
estructura y composición interna de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
* Según los resultados experimentales, la técnica de diluciones decimales de una muestra, en este
caso un yogurt, demostró ser bastante eficiente para el cultivo de un microorganismo presente en
el mismo. Las diluciones sucesivas en agua peptonada de una muestra inicial del yogurt
permitieron la separación y crecimiento de un microorganismo desconocido el cual se tenía
conocimiento ya que el yogurt tiene probióticos.
Bibliografía:

1. Técnicas Bascias de la Microbiologia by karent garcia on Prezi. Available at:

https://prezi.com/gh34mpcdmuou/tecnicas-bascias-de-la-microbiologia/. (Accessed: 7th March
2020)
2. Rodríguez, P. A. & Arenas, R. Hans Christian Gram y su tinción. Dermatología Cosmética, Medica y
Quirúrgica 16, 166–167 (2018).
3. ‫ناريمان إسماعيل متولي‬. Weblet ‫مؤتمر االتحاد العربي للمكتبات والمعلومات الحادي‬
‫ والعشرون‬Importer. in –857 ‫مؤتمر االتحاد العربي للمكتبات والمعلومات الحادي والعشرون‬
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4. Garrido, A. C. Método de siembra en estríaMétodo de siembra en estríaStreaking method |
SERAMIX. SERAMIX (2013). Available at: https://seramix.blogs.uv.es/2013/05/02/metodo-de-
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5. Esaú López-Jácome, L. et al. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. 3, (2014).