UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA

MARIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS BIOQUIMICAS Y

BIOTECNOLOGICAS

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

INMUNOLOGIA

Practica N° 2

DOCENTE:

 Ing. ALVARADO QUIROZ, KENY DAVI

INTEGRANTES:

 Torres Bejar Valerie Stefanny

AÑO – 2022
 Practica N° 2

Separación y viabilidad celular

I. Objetivos

 Aislar la fracción linfomonocitaria de sangre.

 Hacer el recuento celular y el reconocimiento de las células viables mediante el
uso de Azul de tripan.

II. Introducción

Los linfocitos son los responsables de la respuesta inmune específica, estos de

acuerdo a su función se dividen en Linfocitos T, que son los encargados de las
reacciones inmunidad celular y Linfocitos B que son los mediadores de la respuesta
inmunitaria humoral.

Para poder analizar y estudiar a los linfocitos, estos primero deben ser aislados de
las otras células sanguíneas, la sangre periférica es la principal fuente de células
linfoides para realizar investigaciones del sistema inmune humano, el aislamiento
de estas células es el paso previo a otra serie de técnicas más complejas como por
ejemplo la inmunocitotoxicidad mediada por el complemento, con fines de
trasplantes de órganos, etc.

Uno de los métodos más usados es el de centrifugación en gradiente de densidad

de Ficoll – Hypaque (densidad 1,077 ± 0,001 g/ml), u
n método simple y rápido de purificación de células mononucleares, que incluyen
tanto a los linfocitos como a los monocitos, los primeros superan ampliamente en
número a los segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre periférica. Este
método de aislamiento se fundamenta en las diferentes densidades que presentan
cada uno de los tipos celulares de la sangre (Figura 1).

Al colocar una muestra de sangre con sobre el Ficoll – Hypaque y centrifugar, las
células mononucleares (linfocitos y monocitos) se separan de las demás quedando
bajo una capa de plasma y flotando sobre el Ficoll, esto debido a su menor densidad,
en contraste con los eritrocitos que se aglutinan y, pasa a través del Ficoll, formando
un sedimento al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño,
densidad y por su tendencia a formar agregados (figura 2).

Este procedimiento permite recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos

presentes en la muestra, con una viabilidad mayor del 90% (determinada mediante
exclusión del azul tripán)
Fig. 1- Distribución de las células sanguíneas de acuerdo a su densidad

Figura 2.- Centrifugación En Gradiente De Densidad De Ficoll – Hypaque

Determinación de Viabilidad por azul de tripán

La membrana plasmática de las células vivas no permite el paso de sustancias que

no sean electrolitos, mientras que las células muertas las dejan pasar y se colorean.
Este fenómeno se utiliza para distinguir células vivas de células muertas
(Viabilidad), con el fin de corregir los valores obtenidos en un simple recuento de
células, para su determinación se utiliza el colorante azul tripán (se puede utilizar
también azul de metileno).

El azul tripán es un colorante vital, que está cargado negativamente y no puede

interactuar con la célula a menos que la membrana este dañada, de esta forma
todas las células que excluyan el colorante, están viables y las que se tiñen están
muertas o muriendo.

III. Material

Biológico
Sangre

Soluciones y Reactivos
Buffer fosfato salino - PBS pH 7.4
Medio de separación de linfocitos Ficoll – Hypaque
Muestras de sangre
Azul de tripan

Equipos
Tubos falcon
Tubos eppendorf
Pipeta Pasteur
Pipetas de 10 mL
Micropipeta y puntas de 50uL
Centrífuga
Cámara de Neubauer
Cubreobjetos
Microscopio óptico

IV. Procedimiento

1. Extraer 3mL de sangre por veno punción y depositarlos en un tubo

conteniendo anticoagulante, agitar para homogenizar.
2. Diluir la muestra de sangreheparinizada con suero fisiológico o PBS (pH 7.4)
a una proporción 1:1 y reservar.
3. En un tubo de centrifuga colocar 3mL del medio de Ficoll – Hypaque.
4. Añadir la sangre diluida (6mL) dejándola resbalar suavemente por las
 paredes del tubo conteniendo el Ficoll – Hypaque.Ficoll (no mezclar).
5. Centrifugar a 2000rpm durante 30min a temperatura ambiente.
6. Tras la centrifugación se observaran capas, la superior correspondiente al
suero, segundo las células mononucleares (formando un anillo blanquecino),
tercero el Ficoll-Hypaque y finalmente los globulos rojos y polinucleares.
7. Con cuidado de no mezclar las capas, sacar el tubo de la centrífuga y aspirar
el plasma (capa superior) con una pipeta, delicadamente, dejando intacto el
anillo blanquecino de células mononucleares.
8. Aspirar el anillo blanquecino de células mononucleares, haciendo un
movimiento circular dentro del mismo, sin recoger plasma o ficoll. Depositar
las células en un tubo limpio.
9. Lavar las células con 3 ml de suero fisiológico o PBS y centrifugar 10min a
1500rpm.
10. Decantar o aspirar el sobrenadante y repetir el paso 9.
11. Resuspender el pellet en 1mL de PBS o medio de cultivo posteriormente
realizar el contaje y viabilidad de celular.
12. Preparar una dilución 1/10 (90 µl de azul tripán en un tubo eppendorf y 10 µl
de suspensión celular previamente agitada)
13. Coger con la micropipeta 10 ul de esta dilución y ponerla en la cámara de
Neubauer.
14. Llevar la cámara al microscopio para el conteo, enfocar con aumento 10X y
luego contar con 40X.
15. Observar cada cuadrado (A, B, C y D), anotando el número total de células y
el número de células teñidas de azul (Debe realizarse en menos de 5 min,
pues pasado este tiempo la mortalidad aumenta por el propio colorante.)
16. Calcular número de células totales/ml y el porcentaje de viabilidad.

% de viabilidad = Células vivas x 100

Células totales

Nota: Normalmente la suspensión celular se mezcla con el azul tripán en una

dilución 1:10. Si se cuentan más de 200 células se puede hacer otra dilución 1:100
y si se cuentan muy pocas se puede hacer una dilución menor (1:2, 1:5). Se hace
un recuento de células totales y de células teñidas (células muertas) y se calcula el
porcentaje de viabilidad.
 V. Resultados

Hacer un esquema de los pasos seguidos para desarrollar la práctica y sacar sus
conclusiones de los resultados obtenidos

Separacion y
1 viabilidad celular

2 3

4 5

6
7

8 Observar cada cuadrado (A, B, C y D),

anotando el número total de células y el
número de células teñidas de azul (Debe
realizarse en menos de 5 min, pues pasado
este tiempo la mortalidad aumenta por el
propio colorante.)
VI. Cuestionario

1. ¿Cuál es la composición del Ficoll-Hypaque y cual la función de cada

uno de sus componentes?

 20 ml de hypaque sodico 50% PlY: Medios de contraste para diagnóstico por

exploración radiológica
 6,34 g de ficoll (PM 400.000): se puede utilizar para la preparación de
fracciones celulares que incluyen células mononucleares humanas de mayor
densidad y para separar células sanguíneas de ratones o ratas
 todo disuelto en agua destilada, hasta un volumen de 100 ml.

2. ¿Existen otros métodos de separación de linfocitos además del método

de centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll – Hypaque?
Mencione cuáles.

 aislamiento con amortiguador de amonio-cloruro-potasio (ACK) y selección

positiva con anti-CD3
 aislamiento con Ficoll y selección positiva con antiCD3
 aislamiento y selección negativa con microesferas magnéticas (kit comercial)

3. ¿Por qué es necesario diluir la sangre antes de realizar el procedimiento

de separación con Ficoll-Hypaque?

Por que la separación se consigue haciendo sedimentar las células en un gradiente

de densidad, es decir, en un medio cuya densidad aumenta con la profundidad del
tubo.

4. ¿Qué factores podrían alterar la separación linfocitos con Ficoll-

Hypaque?

 Normalmente los frenos del rotor tienen que estar totalmente desactivados
para evitar, eficazmente, la mezcla de fases.
 también es muy importante cumplir estrictamente las temperaturas
especificadas porque las diferencias de temperatura cambiarán las tasas de
densidad de los líquidos y podrán tener un impacto negativo en los resultados
de la separación.
 5. Explique alguna técnica para la separación de Linfocitos T.

 aislamiento con amortiguador de amonio-cloruro-potasio (ACK) y selección positiva

con anti-CD3

Selección con solución amortiguadora de amonio-cloruro-potasio (ACK) y

adherencia empleando anticuerpos anti-CD3 (anti-CD3): Se resuspendió el
precipitado celular obtenido en 10 mL de solución amortiguadora ACK (1.5 M NH4
Cl, 100 mM KHCO3 , 10 mM EDTA), y luego se centrifugó a 100 g durante 10
minutos. Se descartó el sobrenadante, y se sembró en una placa de 6 pozos con 3
mL de medio de cultivo RPMI-1640 + 10% SFB con activadores para proliferación
linfocitaria (250 µg/mL ionomicina y 5 µg/mL forbol 12-miristato 14-acetato (PMA por
sus siglas en inglés)) por pozo, y se incubaron durante toda la noche a 37°C.
Posteriormente, se inoculó 100 µL de suspensión celular por pozo, con
aproximadamente 7 x 104 células/pozo en la placa sensibilizada con anti-CD3, y se
incubaron por 2 h a 37°C. Luego de ello, se realizó un conteo de las células en
suspensión en el sobrenadante, y se contabilizó la cantidad de células adheridas
por exclusión.

6. Mencione diferentes técnicas que necesiten del aislamiento de

linfocitos como paso previo a su desarrollo.

PRUEBAS PARA LA EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNE:

 Aislamiento de linfocitos mediante centrifugación en gradiente de densidad
 Cuantificación de linfocitos T mediante formación de rosetas
 Cuantificación de poblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo
 Evaluación de la respuesta mitogénica de linfocitos in vitro
 Cuantificación de inmunoglobulinas séricas
 Determinación de la actividad hemolítica del complemento (CH50)
 Prueba de reducción del NBT en fagocitos ...

7. ¿Por qué se usa el azul de Tripán para la determinación de la viabilidad?

Porque nos permite distinguir las células no viables de las viables expresado en
función del porcentaje de estas últimas su viabilidad.

8. ¿Qué otros colorantes pueden ser usados para determinar la

viabilidad?

El azul de metileno y, recientemente, la eritrosina, son ampliamente empleados

para estudiar la viabilidad celular por la facilidad y rapidez del análisis.
 9. ¿Qué es un cultivo celular primario?

Son conjuntos de células del mismo tipo que son aisladas de un tejido animal o
vegetal; para progresar requieren factores de crecimiento como aminoácidos, sales,
vitaminas y algunos otros nutrientes específicos para cada tipo.

VII. Referencias

CARCIERO, R.; VALERI, C. R. Isolation of Mononuclear Leukocytes in a Plastic Bag System Using
Ficoll‐Hypaque 1. Vox sanguinis, 1985, vol. 49, no 6, p. 373-380.

VISSERS, Margret CM; JESTER, Sherry A.; FANTONE, Joseph C. Rapid purification of human
peripheral blood monocytes by centrifugation through Ficoll-Hypaque and Sepracell-MN. Journal of
immunological methods, 1988, vol. 110, no 2, p. 203-207.

STROBER, Warren. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology,
2015, vol. 111, no 1, p. A3. B. 1-A3. B. 3.