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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE MORELIA

“Técnico Superior Universitario en Química Área Biotecnología”


MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Asignatura: INMUNOLOGÍA Revisión: 03
Cuatrimestre: SEP-DIC Plan de estudios: 2015 Página 1 de 5

PRACTICA No. 3

MECANISMOS DE LA INMUNIDAD INNATA: FAGOCITOSIS

1. SECUENCIA DE APRENDIZAJE

Identificar los mecanismos de inmunidad innata

2. INTRODUCCIÓN

Uno de los principales componentes que forman parte de la inmunidad innata son las células, entre
ellas las fagocíticas, que en conjunto participan en dos mecanismos importantes: la fagocitosis y la
inflamación. Las células implicadas en estos procesos son: los granulocitos polimorfonucleares, los
monocitos/macrófagos, las DC y las NK, encargadas de llevar a cabo los mecanismos efectores de
la inmunidad innata como son: la quimiotaxis, la diapédesis y la opsonización.

Los fagocitos mas importantes para la inmunidad innata son los polimorfonucleares y los macrófagos.
Los neutrófilos forman la población mas abundante de leucocitos circulantes e intervienen en las
primeras fases de las respuestas inflamatorias.
El sistema monocito-macrófago esta compuesto por células cuya función principal es la fagocitosis
y ocupan un lugar central en la inmunidad innata. El primer tipo celular de este sistema son los
monocitos que se originan en la médula ósea, migran a la circulación y maduran en diversos tejidos
para quedar activados y convertirse en macrófagos. Dependiendo del tipo de tejido en donde se
encuentres se denominan microgliocitos, células de Kupffer, osteoclastos, macrófagos alveolares,
entre algunos. Los macrófagos responden tan rápidamente a los microbios como los neutrófilos, pero
a diferencia de éstos la supervivencia de los macrófagos en los focos inflamatorios es mucho mayor.
La fagocitosis llevada a cabo por estos dos tipos celulares es un proceso activo dependiente de
energía que permite envolver partículas grandes en vesículas especializadas donde tiene lugar la
eliminación de los microbios (Figura 1).
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Una vez que los


microbios Figura 1. Proceso de fagocitosis. han sido
fagocitados son destruidos por moléculas microbicidas en los fagolisosomas, como por ejemplo la
catepsina G y la elastasa de los neutrófilos. Así mismo, los macrófagos y los neutrófilos activados
convierten el oxígeno molecular en especies reactivas de oxígeno (ERO) que funcionan como
oxidantes con carácter reactivo para matar a los microbios. El sistema primordial que conduce a la
generación de radicales libres es el de la oxidasa fagocítica, una enzima presente en la membrana
del fagolisozoma. Esta enzima reduce el oxígeno molecular a ERO, como por ejemplo los radicales
superóxido.
Uno de los intereses primordiales en las células fagocíticas estriba en funciones como el
reconocimiento y procesamiento de antígeno las cuales incrementa la probabilidad del huésped al
rechazo de trasplantes (tejidos y órganos) alogénicos. Actualmente existe un interés particular en
suprimir el RES (sistema retículo endotelial) con la intención de lograr modularlo durante el trasplante
de órganos.
Mediante los procedimientos que a continuación se describen se intentará determinar la capacidad
fagocitica de los macrófagos mediante métodos cuantitativos y cualitativos.

3. REVISIÓN DE CONCEPTOS PREVIOS A LA ACTIVIDAD EXPRERIMENTAL


Concepto de inmunidad innata, fagocitosis, inflamación, macrofago, mecanismos dependientes e
independietes de oxigeno.

4. OBJETIVOS (INFERIDOS POR EL ALUMNO)

5. HIPÓTESIS (INFERIDA POR EL ALUMNO)

6. MATERIAL Y REACTIVOS POR EQUIPO

 SOLUCIONES Y REACTIVOS
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Sol salina*, alcohol etílico al 70%, colorante de Wright, solución tampon ph7

 CEPAS Y MATERIAL BIOLOGICO


Cultivo de S. aureus y E.coli. 2 ratones de 14 a 16 semanas de edad.*

 EQUIPO
Autoclave, campana, termobaño 65ºC, microscopio óptico, centrífuga clínica, balanza, incubadora
a 37ºC, vortex

 MATERIAL
Matraz, probeta, espátula, algodón, 2 tubos ensaye de 10 ml estériles, 3 tubos ensaye para
centrífuga, estuche de disección, pipetas pasteur, perillas de goma, tabla de disección*, guantes*,
cubreobjetos y portobjetos*, cámara de Newbauer, recipiente con solución de cloro para
desechos*, algodón*, papal secante*, picetas con alcohol, picetas con agua destilada, gradilla,

*Material aportado por el alumno


PREPARAR MEDIOS DE CULTIVO E INOCULOS, SOLUCIONES Y MUESTRAS CON 16 a 24
HRS DE ANTICIPACION.

REVISAR PREVIAMENTE LA TECNICA DE TINCIÓN DE WRIGHT

7. SECUENCIA EXPERIMENTAL

a) Matar a un ratón de 10-12 semanas de edad por dislocación cervical


b) Colocar al ratón sobre la charola de disección en decúbito dorsal
c) Extraer el bazo y macerarlo de acuerdo a la practica anterior
d) Preparar una disolución de células de bazo de ratón en solución salina y dejar reposar a
37ºC
e) Paralelamente, preparar una suspensión celular de bacterias (S. aures o E. coli muertas
por calor). *
f) En tres tubos colocar
- 200 ul de la suspensión de bacterias (tubo 1)
- 200 ul de la suspención celular
- 200 ul de la suspensión de bacterias y 200 ul de la suspensión celular de
bazo.
g) Agitar suavemente para que se distribuyan las células.
h) Incubar los tubos a 37ºC por 30 min
i) Tomar 100ul de cada tubo y hacer tres frotis diferentes tiñendo con la técnica de Wright
j) Revisar los frotis en el microscopio. Contar los macrófagos en cada frotis y examinar las
bacterias intracelulares.

* Preparación de la suspensión celular de bacterias


En un tubo de ensaye estéril cultivar un inóculo de S. aureus o E. coli en medio líquido, durante 18
hrs a 37 ºC.
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Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min, decantar el sobrenadante y lavar con 5 ml de SS.
Matar las células por calentamiento en termobaño por 15 min.

8. RESULTADOS

Realiza esquemas de lo observado

Determina el índice de fagocitosis y porcentaje de lisis

A partir del total de leucocitos contados (100 a 200 células) anotar el número total de bacterias
fagocitadas

IF= No. total de bacterias fagocitadas

No. de leucocitos contados

9. CONCLUSIONES

10. LISTA DE COTEJO

a. Menciona dos experimentos distintos a los realizados para observar fagocitosis in vitro o in
vivo
b. Describe la técnica del nitroazul de tetrazolio (NBT) y para qué se emplea
c. Investiga cuál es el número aproximado de bacterias que es capaz de fagocitar un fagocito
por unidad de tiempo
d. Menciona las etapas de la fagocitosis
e. Describe los mecanismos dependientes de oxígeno de la fagocitosis y cuáles son aquellos
independientes de oxígeno.
f. Investiga cuál es la causa de la enfermedad conocida como granulomaotosa crónicaç

11. BIBLIORGRAFÍA

Abbas, L., et al. Cellular and molecular immunology. 4ª ed. USA. Elsevier Science. . 2000. 562
páginas.

Mendoza, A. Prácticas de inmunología general aplicada y veterinaria. 1ª ed. México. Ed. El manual
Moderno, 2001. 279 páginas.

Liu, B., et al. 1999. Low Phagocytic Activity of Resident Peritoneal Macrophages in Diabetic Mice.
DIABETES, VOL. 48: 2074-2082

Castro-Eguiluz. D., et al. 2009. B cell precursors are targets for Salmonella infection. Microbial
Pathogenesis. Volume 47, Issue 1: 52–56.
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