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INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS

METODOS RAPIDOS
2019 II

Métodos rápidos en el análisis e identificación de los microorganismos de interés en los


alimentos. Petrifilm, Fluorogénico (MUG), API.

Introducción
Tradicionalmente se ha recurrido a la aplicación de métodos llamados “estándares” o
recomendados por agencias internacionales como la FDA, ICMSF, ISO etc para el análisis
microbiológico de las materias primas y producto terminado en la regulación comercial interna
o internacional. Los métodos de cultivo son relativamente muy laboriosos y requieren tiempo
para que tengan lugar el crecimiento. Uno de los factores que más preocupa a los fabricantes
exportadores/importadores y autoridades de salud o agricultores es la rapidez, es decir el tiempo
transcurrido desde la toma de la muestra y el conocimiento de los resultados obtenidos, Los
métodos tradicionales consumen mucho tiempo. Es por eso que los microbiólogos de alimentos
se han esforzado por desarrollar métodos rápidos y automatizados y con frecuencia han sido
denominados “Métodos rápidos”.

Objetivos
- Conocer los diferentes métodos rápidos de numeración que existe.
- Seleccionar el método más apropiados a utilizar según cada situación
- Identificar géneros y especies de bacterias

A. MÉTODOS PARA CONOCER EL CONTENIDO MICROBIANO TOTAL

1. Método de Petrifilm
El sistema de Petrifilm (fabricado por 3M) elimina el plaqueo. Utiliza un sistema constituido
por una mezcla deshidratada de nutrientes de un agente gelificante a la que le sirve de soporte
una película. La adición de un mililitro de muestra rehidrata el gel que facilita la formación de
colonias del microorganismo diana. El recuento de colonias se lleva acabo como en el método
de recuento estándar en placas. Se dispone de sistemas Petrifilm para recuento de aerobios,
coliformes y E.coli, Staphylococcus aureus coagulasa positiva y Enterobacteriaceae y mohos y
levaduras.

I Materiales y aparatos:
1- Los indicados para la preparación y dilución de las muestras.
2- Pipetas 1 mL
3- Estufa de incubación, 29-31 ºC y de 35  1 ºC
4- Contador de colonias Québec (campo oscuro)
5- Petrifilm para aerobios y Recuento rápido de coliformes.

II Procedimiento
1. Colocar la placa Petrifilm sobre una superficie plana y lisa
2. Levantar la lámina superior y con la pipeta perpendicular inocular 1 mL de la
muestra en el centro de la lámina.
3. Dejar caer la lámina hacia abajo sobre la muestra, evitar la formación de burbujas de aire.
4. Distribuir la muestra uniformemente ejerciendo una presión suave sobre el centro del difusor
plástico (el lado liso hacia arriba para aerobios y lado liso hacia abajo para coliformes) No
deslizar el difusor sobre el film. Quitar el difusor y dejar la placa en reposo durante un
minuto para permitir la solidificación del gel.
5. Incubar las placas horizontalmente con la superficie transparente hacia arriba y no más de 20
placas una sobre otras, de la siguiente manera;
a) Para aerobios: 30  1 ºC/48 h
b) Para Coliformes: 35  1 ºC/ 6 a 24 hs.
6. Recuento:
a) Aerobios. Tras la incubación las colonias aparecen de color rojo. Todos los puntos rojos
deben contarse como colonias aunque sean muy pequeños o pocos intensos. Se cuentan las
placas Petrifilm que contienen entre 30 y 300 colonias. El área circular de cultivo es
aproximadamente de 20 cm2. Se puede hacer estimaciones en las placas que contienen más
de 300 colonias contando el número de colonias en uno o más cuadrados representativos y
obteniendo el promedio. Multiplicar dicho número por 20 para obtener el recuento total por
placa.
b) Coliformes. Contar las placas que contiene no más de 150 colonias rojas asociadas a
burbujas de gas rodeado de una zona amarilla.
Se puede hacer estimaciones en las placas que contienen más de 150 colonias contando el
número de colonias en uno o más cuadrados representativos y obteniendo el promedio.
Multiplicar dicho número por 20 para obtener el recuento total por placa.

2. Método del NMP para Coliformes y E. coli usando medio LMX según Manafi

Uno de los métodos convencionales usado para determinar coliformes y E. coli en aguas y
alimentos es la Técnica del Número Más Probable (NMP) que esta basado en la formación
de gas por la fermentación de la lactosa seguidos por pruebas confirmativas. Esta técnica es
laboriosa y requiere hasta 96 horas para obtener resultados. Incorporando el sustrato MUG
en métodos convencionales para coliformes se mejora la habilidad para detectar E. coli y se
reduce la cantidad de tiempo y medios de cultivo.

I. EQUIPOS Y MATERIALES
1. Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de la muestra de alimentos.
2. Incubadora a 35-37ºC
3. Pipetas bacteriológicas de 1 mL
4. Caldo LMX según Manafi, volúmenes de 10 mL. En tubos de 150 x 15 mm
5. Lámpara u.v. de 360 nm y 6 watts.

II. PROCEDIMIENTO
1. Preparar la muestra de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado en la
sección sobre Preparación y Dilución de las muestras de alimentos.
2. Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones del homogenizado de alimento en tubos
con Caldo LM X, utilizando tres tubos por dilución.
3. Incubar los tubos a 35-37ºC, por 24 horas.
4. Después de 24 horas, anotar los tubos que presenten turbidez y color verde esmeralda y luego
llevar a la luz uv y observar fluorescencia, considerar como:
- Coliformes los que presentan color verde.
- E. coli los que presentan fluorescencia y formación de indol al agregar reactivo de Kovacs.
5. Anotar el número de tubos positivo y referirse a la tabla del NMP para expresar el resultado.

B. MÉTODOS RÁPIDOS PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS


O ESPECIES DE BACTERIAS

Todos los “kits” o dispositivos comerciales son fáciles de usar. Los “kits” normalmente se
diseñan para se utilizados con un grupo concreto de microorganismos, por ejemplo, para
Enterobacteriaceae (API 20E), para bacterias gram negativas no fermentadoras,
Lactobacillus, Listeria, etc.

API 20E
API 20E es un sistema estandarizado que permite la identificación de Enterobacteriaceae y
otros bacilos Gram negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicos
miniaturizados, así como una base de datos.
La galería del sistema API 20E se compone de 20 microtubos que contienen los sustratos
deshidratados
I EQUIPOS Y MATERIALES
1. Una cepa aislada de 24 horas (Enteobabteriaceae).
2. Una galería API 20E y su respectiva cámara de incubación
3. Suero fisiológico (0.85% NaCl)
4. Reactivo para TDA
5. Reactivo de Kovacs
6. Reactivo para VP
7. Reactivo para nitrato
8. Reactivo para oxidasa
9. Aceite de parafina
10. Catálogo analítico API 20E o software de identificación apiwebTM
II PROCEDIMIENTO
1. Repartir aproximadamente 5 mL de agua destilada en los alvéolos de la cámara de
incubación.
2. Anotar la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara.
3. Retirar la galería de su envase y colocar en la cámara de incubación.
4. Realizar una suspensión bacteriana homogeneizando cuidadosamente las bacterias con el
suero fisiológico. Usar inmediatamente la suspensión.
5. Colocar la punta de la pipeta sobre la pared de la cúpula e inocular la suspensión
bacteriana en los tubos de la galería (evitar la formación de burbuja de aire)
6. Para las pruebas CIT, VP y GEL llenar el tubo y la cúpula
7. Para las otras pruebas llenar únicamente los tubos (no la cúpula)
8. Para las pruebas: ADH, LDC, ODC, H2S, URE, llenar la cúpula con aceite de parafina.
9. Cerrar la cámara de incubación e incubar a 36 ºC  2 ºC/ 18-24 horas.
10. Lectura e interpretación. Después de la incubación, la lectura de la galería debe hacerse
remitiéndose a la tabla de lectura. Anotar en la hoja de resultados todas las reacciones
espontáneas y después revelar los ensayos que necesitan la adición de reactivos. La prueba
de indol se realizará en último lugar para evitar alteración de la interpretación de las otras
pruebas de la galería.
La identificación se obtiene a partir del perfil numérico. El perfil numérico se obtiene
sumando al interior de cada grupo (los tests están separados en grupos de tres y se indica
para cada uno un valor de 1, 2, ó 4) los valores que corresponden a reacciones positivas, se
obtiene un perfil numérico de 7 cifras (la reacción de la oxidasa que constituye el test Nº 21
se le asigna el valor 4 cuando resulta positivo). Con la ayuda del catálogo analítico se
localiza el perfil numérico en la lista de los perfiles. En caso de que el perfil de 7 cifras
resulta insuficientemente discriminante es necesario realizar pruebas complementarias.

INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS


INFORME DE LA PRÁCTICA Nº 6

Métodos Rápidos

Método: Petrifilm, Fluorogénico (MUG), API.

Muestra:…………………………………………………………………………………..
Diluyente:…………………………………………………………………………………

Prueba:

 Temperatura y tiempo de incubación:…………………………………………….


 Características de las colonias en petrifilm, API20, NMP para Coliformes y E.
coli usando medio LMX según Manafi y fundamento de las reacciones:

 Lecturas:

 Cálculos:

EXPRESIÓN DE RESULTADO:

DISCUSIÓN:

CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO

GRUPO A

1. ¿Qué son métodos rápidos y automatizados?


2. Cuál es el fundamento de las reacciones de coLiformes y E. coli en la placa Petrifilm?

GRUPO B

1. Ventajas y limitaciones de los métodos rápidos.


2. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones de coliformes y E. coli en el Caldo LMX?

GRUPO C

1. ¿A que se debe la especificad de un medio cromogénico? Dé algunos ejemplos


2. ¿En qué consiste el Sistema API?

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