LABORATORIO DE MICROBIOLOGA GENERAL Dra. Keiko Shirai Prctica No.

6 "Curva de crecimiento de Escherichia coli: cuantificacin de microorganismos INTRODUCCIN Los mtodos directos de cuantificacin de microorganismos permiten establecer la poblacin total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rpidos aunque no es posible diferenciar a las clulas vivas de las muertas. Entre estos mtodos tenemos la turbidimetra y el conteo de clulas. Turbidimetra En una suspensin microbiana la cantidad de microorganismos esta directamente relacionada con la turbiedad o densidad ptica. La metodologa es til con suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde los microorganismos son unicelulares y con un tamao de unos cuantos micrmetros, caractersticas que les permiten mantenerse suspendidos y homogneamente distribuidos; en tanto que con microorganismos de mayor tamao y con aquellos productores de polisacridos esta metodologa no es adecuada. Recuento microscpico Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta (hemacitmetros, cmaras de Petroff-Hauser, Neubauer o de Helber; estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen. Con la cuantificacin de microorganismos a travs del tiempo es posible el representar grficamente el crecimiento microbiano. La curva presenta distintas fases: Fase de latencia lag: perodo de adaptacin de un microorganismo a un nuevo medio de cultivo. Fase exponencial o logartmica: aumento regular de la poblacin que se duplica a intervalos regulares de tiempo (td). Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulacin de productos txicos, etc. Fase de declinacin o muerte: el nmero de clulas que mueren es mayor que el nmero de clulas que se dividen.

Las propiedades de un microorganismo dependern de la fase de la curva en que se encuentren (por ejemplo la produccin de antibiticos se lleva a cabo en la fase estacionaria). OBJETIVOS Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de clulas y turbidimetra para obtener la curva de crecimiento.

MATERIAL REACTIVOS Por equipo: Caldo nutritivo Sesin extraclase 15 Tubos de rosca agua 1 Gradilla 5 Pipetas de 1 ml 5 Pipetas de 10 ml 1Cilindro para esterilizar pipetas 1 Parrilla Agitadores magnticos 1 probeta de 100 ml 1 Vaso de precipitados 1000 ml 1 Matraz erlenmeyer de 125 ml 1 probeta de 100 ml Balanza analtica Gasa Algodn Papel de estraza Sesin prctica Celdas para espectrofotmetro Espectrofotmetro Microscopio ptico Portaobjetos Cmara de Neubauer Cubreobjetos 2 Mecheros fisher 1 tubo t de vidrio METODOLOGA 1.- Se preparar 250 ml de caldo nutritivo por equipo se disolver por calentamiento y se distribuir de la siguiente manera: 10 ml de medio en tubo con tapn de rosca (15 tubos por equipo) 50 ml en un matraz erlenmeyer de 125 ml con tapn de algodn 2.- Esterilizar las pipetas en un cilindro, los tubos y el matraz erlenmeyer con medio de cultivo en el autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos. 3.- Inocular con Escherichia coli el matraz erlenmeyer el da anterior a la sesin prctica e incubar a 37C (tabla 1). 4.-Al da siguiente medir densidad ptica del cultivo del matraz erlenmeyer utilizando como blanco medio estril para calibrar el espectrofotmetro. 5.- Inocular con el cultivo del matraz 4 tubos con caldo nutritivo (serie 1) e incubar a 37C tres horas antes de que de inicio la sesin prctica. 6.- Inocular con el cultivo del matraz 8 tubos con caldo nutritivo (serie 2) e incubar a 37C 7.- Realizar el muestreo de acuerdo a la tabla 1, determinando la densidad ptica de acuerdo al paso 4 y contando clulas siguiendo el procedimiento que se explica a continuacin.

Tabla 1. Horario de inoculacin de E. coli a tubos con medio de cultivo y muestreo para cuantificar microorganismos Hora Serie 1 Serie 2 (min) (min) 16 a 18 horas antes del da de la sesin prctica Inocular medio de cultivo en matraz Da de sesin prctica 12:30 0 15:30 0 16:00 210 30 16:30 240 60 17:00 90 17:30 300 120 18:00 150 18:30 180 Conteo de clulas 1. Hacer frotis y tincin de Gram a la muestra a cultivar. 2. Bajo condiciones de asepsia colocar en el rea hundida de la cmara de Neubauer una gota de los cultivos (muestras series 1 y 2) y extenderla rpidamente. Evitar escurrimientos. 3. Colocar el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X 4. Contar las clulas en cuadros individuales. Para evitar el conteo de las mismas clulas dos veces, omitir aquellas ubicados en las lneas de la parte superior e izquierda de cada cuadro. Los microorganismos omitidos son considerados en los cuadros superior y derecho adyacentes: ejemplo: Cuadro 1=5 bacterias Cuadro 2=6 bacterias Cuadro 3=5 bacterias Cuadro 4=5 bacterias

2 1 3 4

5. Contar cuando menos 10 campos 6. Aplicar la siguiente frmula y calcular el nmero de microorganismos por mililitro o gramo de la muestra original

1 Pr omedionmerom.o.contados factordedilucin = Microorganismosporml volumendelcuadro

RESULTADOS Graficar la curva de crecimiento (nmero de clulas y densidad ptica) Determinar la tasa especfica de crecimiento () en la grfica y con la ecuacin de la curva de crecimiento Determinar el tiempo de duplicacin. de colonias y microscpica. CUESTIONARIO 1. Explica en que consisten los mtodos directos e indirectos de cuantificacin de microorganismos 2. Cules son las ventajas y desventajas de los mtodos de cuantificacin de microorganismos empleados en la prctica? 3. Explica en qu consiste la curva decrecimiento y que pasa en cada etapa