TEMA 3. REPARACIÓN DEL DNA.

1. Causas y tipos de daños producidos en el DNA e implicaciones biológicas de los sistemas de reparación.
Puede ser dañado por agentes intrínsecos o extrínsecos, pero en su mayoría el origen del daño es endógeno.
Los agentes dañinos más comunes son:

• Rayos X, Agentes alquilantes, reacciones espontáneas (uracilo-citosina), ROS: las especies reactivas
de oxigeno que generan modificaciones de bases en el DNA como la oxidación de la desoxirribosa,
roturas de cadena simple o doble y enlaces cruzados de proteína-DNA. BER
• Errores en la replicación: Cuando se introducen desajustes de ADN como inserciones y deleciones (una
tasa de 10-4-10-6) al desaparearse las bases. MMR
• Rayos UV: Produce aductos voluminosos (dos moléculas unidas) y entrecruzamientos en el interior de las
hebras. NER
• Radiación ionizante, agentes antitumorales…: rotura de doble cadena y entrecruzamientos
intrahebra. NHEJ y HHR
Las mutaciones se pueden producir por:

→ Cambios en una sola base: no distorsiona mucho la estructura, solo la secuencia por lo que no suele
afectar a la replicación o transcripción.
→ Distorsiones estructurales: impedimentos en la replicación y transcripción (formación de dímeros,
metilación de bases…)
→ Roturas de DNA: en una cadena es como un Nick (fácil reparación) si es en las dos puede llegar a
perder el DNA si no se repara

2. Reparación directa
La luz UV provoca la formación de dímeros de timina, se forma un anillo de ciclobutano entre C5 y C6 de timina.
Esta radiación con una λ=100-400 nm es absorbida por las basas provocando la fusión.
Se van a reparar las bases de DNA dañadas con reacciones enzimáticas que van a restaurar la estructura
original. Se pueden eliminar los dímeros de timina por fotoreactivación (en humanos y otros mamíferos no existe
la fotoreactivación): la fotoliasa revierte el daño catalizando una reacción impulsada por la luz que rompe el
anillo.

Dealquilación: Estos agentes alquilantes son reactivos que pueden transferir metilos al DNA. Las enzimas O6-
metil-guanina DNA metil transferasa puede eliminar grupos metilos de la guanina transfiriéndolo a la cisteína
de su sitio activo. **La O6-metil-guanina es complementario con la timina (en vez de citosina)

3. Reparación por escisión de bases (BER) y nucleótidos (NER).

Características del mecanismo:

- Incisión: La estructura dañada por distorsión o desemparejamiento es reconocida por la endonucleasa

que corta a ambos lados de la base donde esta la lesión
- Escisión: La exonucleasa o helicasa elimina el DNA dañado entre nicks. (la helicasa puede desplazar el DNA y luego se
degrada)
- Síntesis: La polimerasa sintetiza el remplazamiento del DNA gracias a que usa de molde la cadena de
ssDNA. Luego, la ligasa sella el Nick.
BER: Actúan corrigiendo lesiones de las bases que no causan una distorsión en la doble hélice, no afecta ni a la
replicación ni transcripción ni provoca grandes cambios en la estructura del DNA. Son aquellos daños como
desaminación, depurinacion, metilación… Y consta de varios pasos enzimáticos.
Ej: E.coli
o Eliminación de la base: mediante unas DNA glicosilasas específicas, que al
actuar dejan un sitio AP (apirimidinico). La uracil DNA glicosilasa elimina los
uracilos del DNA, esta elimina la base al romper el enlace azúcar-base (no
azúcar-P)
o Escisión: la AP endonucleasa y la fosfodiesterasa eliminan el azúcar-P, van
a romper la cadena nucleotídica en el sitio abásico.
o Rellenado y unión: La DNA polimerasa I va a rellenar el hueco con
nucleótidos tomando como molde la cadena complementaria y la ligasa va
a sellar el nick.
En eucariotas hay dos rutas:
o Short-patch pathway: se reemplaza solo un nucleótido, no requiere de
proteínas. Eficiente en proliferación (pol δ) y quiescencia1 (pol β)
Las glicosilasas eliminan la base dañada, se reemplaza el nucleótido mediante la
DNA pol β y la AP endonucleasa APE1 y luego la DNA ligasa sella el nick. (ligasa 3)
o Long-patch pathway: se elimina un mayor número de nucleótidos, solo en células en proliferación porque
necesita la maquinaria de replicación.
La glicosilasa elimina la base, se produce una incisión donde la APE 1 corta a ambos lados de la base y se
produce una translación de nick y la Polδε rellenan, la endonucleasa FEN1 termina de rellenar y luego ya la
DNA ligasa sella el espacio. (ligasa 1)
NER: repara distorsiones de la doble hélice, se elimina un DNA que contiene el daño quedando un ssDNA que
va a ser usado como molde por polimerasas. Va a eliminar todas aquellas lesiones que causen distorsión de la
doble hélice (como ROS). Va a afectar a la replicación y transcripción.
La nucleasa corta en la hebra donde se encuentra el dinero de pirimidina, la helicasa se encarga de desplazar
ese ADN cortado y la DNA polimerasa con una ligasa lo rellenan y sellan el nick.
→ Ej. E.coli
Un dímero de UvrAB va a rastrear el DNA y con aporte energético se unen a la distorsión de la
doble hélice gracias a A. UvrA se disocia y UvrB abre el DNA y se crea una burbuja alrededor de
la lesión. Se recluta a C, esta se une y corta a ambos lados de la lesión asimétricamente (8 nucleótidos
antes y 4 después), se va C con el trozo cortado y se va a unir una helicasa UvrD que desplaza el ssDNA
cortado. Finalmente, la DNA pol I y la ligasa rellenan el gap y cierran el nick.

→ En eucariotas
Podemos encontrar dos tipos de reparaciones: la reparación global del genoma (GG-NER) donde
la proteína XPC en complejo con otras proteínas (CETN2, RAD23B) reconoce daño en cualquier lugar
del genoma y la reparación pareja transcripción (TC-NER) el cual se activa cuando la RNA
polimerasa II se bloquea durante la transcripción al encontrarse una lesión (proteína CSA).
En los dos sistemas se recluta el TFIIH (factor de iniciación de la transcripción complex IIH) que está
compuesto por varias subunidades, dos de ellas helicasas (XPB, XPD)
XPG y XPF son endonucleasas que cortan el DNA a ambos lados de la lesión, las helicasas desplazan
el DNA cortado y queda un gap de 22-30 nucleótidos.

Se une el PCNA que recluta a una DNA polimerasa (Pol δ, pol ε, pol k) para llenar gap y después
la ligasa se encarga de cerrar el nick.
Enfermedad: Xeroderma Pigmentosa (XP) → es debida a mutaciones en proteínas NER. Los enfermos no pueden
reparar las lesiones producidas por los rayos UV. Se han identificado mutaciones en genes del sistema XP (CPA-
XPG). Es un síndrome recesivo autosómico.

1 Estar quieto cuando podría estar moviéndose

Esta enfermedad es muy poco común, aquellos que lo padezcan tienen mas probabilidades de padecer Cáncer de
piel. Sus células son defectuosas en la capacidad de reparar el daño del ADN causado por UV. Este proceso es
responsable de la eliminación de los fotodímeros inducidos por UV que distorsionan la hélice de ADN lo que
explica la predisposición altamente específica al cáncer de piel de los pacientes con XP.

4. Reparación de bases mal apareadas (MMR)

Repara desapareamientos, inserciones y deleciones que se detectan tras la replicación.
Actividades de las DNA polimerasas:
- Polimerasa 5’-3’, actividad de síntesis de DNA
- Exonucleasa 3’-5’ degradación de DNA o proofreading.
La polimerasa comete errores, la tasa de mutación de la síntesis es de 10-5, sin embargo, la exonucleasa permite
disminuir la tasa de mutación a 10-7. Esto se deja a una tasa de mutación de replicación del genoma es alrededor
de 1010, esta diferencia es por la acción de los mecanismos de reparación.
Ej. E.coli.
La proteína Dam metilasa transfiere grupos metilo de moléculas de S-adenosin
metionina a las adeninas de la secuencia GATC. La Dam metilasa incorpora el metilo
dos minutos después de que el nucleótido ha sido incorporado. Como resultado hace
que tras la replicación, el DNA está temporalmente hemimetilado. La bacteria
aprovecha ese estado para diferencial la cadena parental de la de nueva síntesis.
Otro método, la proteína MutS escanea el DNA uniéndose al mismatch y recluta a MutL.
Este complejo activa a MutH que produce un nick cerca del mismatch. Una helicasa con
aporte enrgético va a desenrollar el DNA hacia el sitio del error y una exonucleasa
degrasa el DNA desplazado. El gap se va a reparar mediante la ligasa y una DNA
polimerasa III.
En eucariotas.
MutH está presente solo en E.coli y algunas Gram (-). Podemos encontrar homólogos a
MutS y MutL:

- hMutSα (MSH2-MSH6) que escanea el DNA y localiza las bases mal apareadas
- hMutLα (MLH1-PMS2) que se une al PCNA que lo activa y hace que corte la hebra del DNA.
Enfermedad: HNPCC: cáncer colorrectal hereditario no polipósico; Se conoce como el síndrome Lynch, el patrón
familiar se caracteriza por la inestabilidad de repetición de microsatélites. Se
encontró que portaba mutaciones en los homólogos humanos de las proteínas
bacterianas: MMR: MutS y MutL (en concreto MSH2 y MLH1).
**Curiosidad: MSH2 da tumores linfáticos, de piel y otros, pero no afecta a
la fertilidad, en cambio, ML1 causa los mismos tumores y también dejas de
ser fértil.
La inestabilidad de microsatélites es cuando el numero de bases repetidas
del DNA en un microsatélite (que es la secuencia de DNA corta y repetida)
es diferente al numero que se heredó provocando una fragilidad
cromosómica.

5. Reparación de roturas de doble cadena (HHR y NHEJ)

Los DBS en el DNA son los mas peligrosos para la célula, si no llegan a
repararse, esa porción del cromosoma sin centrómero no se segregará en la
siguiente división celular.
Estos daños se pueden generar por radiación ionizante, radicales libres,
endonucleasas o durante la replicación. El encuentro de una horquilla de
replicación con una lesión en una de las cadenas del DNA puede dar lugar
a un DSB.
HHR: Homology-directed-recombination, esta solo tiene lugar después de la replicación, justo al final de la fase
S y en la G2 del ciclo celular porque necesita la cromátida hermana para que actúe como molde. También
ayuda en procesos fisiológicos como la recombinación meiótica o el mantenimiento de los telómeros.
El complejo MRN-CtIP comienza la resección en las roturas para generar ADN monocatenario (ssDNA). El ssDNA
primero se recubre con RPA para eliminar la estructura secundaria, que luego se reemplaza por Rad51 con la
ayuda de BRCA2. Los filamentos de nucleoproteína Rad51 buscan la secuencia homologa de la cromátida
hermana invadiendo la cadena, tras esto, el extremo del ADN se extiende utilizando la secuencia intacta como
molde.
NHEJ: Nonhomologous end-joining. Aquí no se utiliza el
molde por tanto introduce muchos errores (error-prone) y
es independiente del ciclo celular.
Su mecanismo comienza con el reconocimiento de los
extremos del DNA por el heterodímero Ku70/80, este
recluta a la DNA-PKcs. Si los extremos no son compatibles
las nucleasas como Artemis pueden recortar los extremos o
rellenarlos con la DNA polimerasa para crear extremos
compatibles. Para sellarlo se usa un complejo ligasa
llamado: XRCC4-DNA Ligasa IV-XLF.
En eucariotas tenemos: NHEJ, que funciona cuando no hay
homología o la hay de 1-4 nucleótidos, SSA, otro
mecanismo de error prone que funciona con secuencias
repetidas y requiere homología de 20 nucleótidos y MMEJ,
sigue siendo error-prone, pero solo necesita pequeñas
microhomologías de 1-16 nucleótidos para alinearlos y
repararlos.
MMEJ y SSA son altamente mutagénicos debido a la
pérdida de una repetición y la secuencia intermedia.

6. Síntesis translesiva o bypass (TLS).

Se realiza por polimerasas bypass o TLS, permite a las células seguir funcionando en presencia de lesiones que
normalmente bloquearían la replicación. Las TLS atraviesan la lesión
Un ejemplo de polimerasas procariotas TLS son IV (DinB) y V (UmuD2`2C). Son DNA polimerasas de emergencia
que replican zonas dañadas.
Ej: El dímero de timina no lo puede meter un molde malo, la
polimerasa III se para, provocando una rotura. Si se nota el fallo,
este da señal para que se desamble la polimerasa III. Con esto
entran las polimerasas IV y V que no son muy fiables (les da
igual lo que meter en su centro activo, la timina dañada), se caen
porque no son muy procesivas y entra la I.

- No se para la reparación porque el DNA no está roto, pero

meten mutaciones
En eucariotas el PCNA se modifica químicamente cuando se
encuentra una lesión, se ubiquitina, lo que es una señal para que
entren las polimerasas TLS (IV y V).
Si hay un daño (un dímero entre 3-4), entraría la polimerasa y
sintetizaría el DNA (en la imagen de color azul) pero dejaría
errores. El bypass se caería y entraría una polimerasa con
sistemas de reparación. Sin embargo, si no existiera TLS la
horquilla de replicación donde se cae el DNA podría provocar
roturas de doble cadena y esto produce inestabilidad
cromosómica.
**La pol IV también ayuda a la reparación del DNA.
 7. Reparación inducida (SOS y DDR)
Al producirse un daño en la célula, reparar la lesión es solo parte de la respuesta al daño, también se activa
una respuesta multigénica.
Procariotas:

- Bloquea división celular

- SOS (activando la transcripción de varios genes y algunas proteínas de reparación)
- Se activan profagos lisogénicos
La repuesta SOS activa RecA que esta bloquea la división celular y activa proteínas de reparación y otras.
Eucariotas:
- Se activan los checkpoints del ciclo celular (no paran hasta ser reparado el daño)
- Cambios transcripcionales que ayudan a la reparación (síntesis de proteínas de reparación).
Vías de señalización eucariotas: La respuesta al daño activa a dos quinasas: ATR (ataxia telangiectasia y RAD3-
related) y ATM (ataxia telangiectasia mutada), estas activan otras quinasas: CHK1 y CHK2 que activan proteínas
como la p53 que se encarga de la activación de la transcripción, otras proteínas de reparación y regulación
del ciclo celular.
La respuesta SOS: se van a inducir mas de 40 genes en E.coli,
relacionados con reparación (uvrA, uvrB y uvrD), recombinación (recA),
polimerasas (bypass y de reparación), paradas de la división celular y
aquellas implicadas en la inducción de lisógenos.

- La luz ultravioleta provoca un daño que aparece en ssDNA, la

proteína RecA se une a este y rompe a LexA (inhibidora de
transcripción) la degrada en todos los genes y se empiezan a
expresar un montón de cosas para la reparación.
- Si hay muchas mutaciones en RecA, se una a una ssDNA y
estimula la proteólisis de LexA (actúa como co-proteasa para
activar la actividad proteasa del C-terminal de LexA), esto
permite la expresión del operón.
- RecA también estimula la proteólisis de UmuD (precursor inactivo de UmuD’)
** Los genes umuC y umuD codifica para la DNA polimerasa V. y din B para IV.
DDR en eucariotas: Encontrar un obstáculo puede provocar el estancamiento de la horquilla de replicación, lo
que da como resultado el desacoplamiento de la síntesis de la hebra principal y la rezagada, generando roturas
de doble hebra (DSB) y/o brechas de ADN monocatenario (ssDNA). Para combatir las amenazas de este daño,
las células han desarrollado mecanismos que en conjunto se llaman DNA-damage response (respuesta al daño
del DNA) para detectar lesiones en el ADN, señalar su presencia y promover su reparación.
Varias proteínas sensores reconocen la presencia de un daño en el ADN, esto puede conducir a un estancamiento
de la replicación por eso que los sensores inician
vías de señalización que impactan en procesos
celulares.
En conclusión, DDR es una ruta de señalización
que detecta la lesión del DNA y el estrés
replicativo y dispara una respuesta para
proteger la célula y mitigar el daño.

- En presencia de daño celular en p53 se

estabiliza (porque MDM2 se fosforila y ya no
puede degradar p53)
- Aumentan los niveles de p53.
- P53 es un factor de transcripción que active
unos genes y reprime otros.
La vía del daño del DNA: la p53 se activa y esta detiene el ciclo celular a través de Rb y estimula la reparación
del DNA. La p53 está regulada por un conjunto complejo de activadores e inhibidores.
- La p21 es una proteína que inhibe los complejos CDK/ciclina y bloquea el ciclo en G1 (o promueve
apoptosis si el daño es muy grande)
- Cdc25 es una proteína necesaria para activar las CDKs.
Una descripción general de las vías de transducción de señales de mamíferos que activan la detención del punto
de control del ciclo celular después de IR. Dos proteínas relacionadas y conservadas como ATM y ATR son
componentes centrales de la respuesta al daño del ADN.
ATM y ATR son proteínas quinasas. Las células de pacientes con AT tienen mutaciones en ATM y son defectuosas
en varias respuestas a IR, incluida la detención de G1, la reducción de la síntesis de ADN y la detención de G2.
ATM juega un papel protagonista en este tipo de respuesta, controla la fosforilación inicial de varias proteínas
clave como: p53, Mdm2, BRCA1, Chk2 y Nbs1 en respuesta al daño del ADN.
La reparación DNA en eucariotas y cromatina.
La cromatina es un obstáculo para la reparación del DNA porque no puede entrar parte del sistema de
reparación, por lo que debe ser modificada y remodelada antes o durante la reparación, y después volver a
modificarse para volver al estado original. Para una reparación eficaz se hace uso de histonas.
Las histonas tienen colas que se pueden modificar, la fosforilación
(circulo amarillo), la acetilación (rombo rojo), la metilación
(cuadrado azul) y la ubiquitinación (hexágono púrpura). La
reparación de roturas de doble cadena se agrupa como una sola
vía, pero ciertas modificaciones pueden ser específicas de
diferentes procesos de DSBR.

**γH2AX
Resumen de modificaciones de histonas conocidas en una ruptura de
doble hebra inducida por HO. El tiempo aproximado de los eventos
se indica a la izquierda. Las tasas de reparación para la
recombinación homóloga y la unión de extremos no homólogos
difieren en este sistema experimental, por lo que el momento
preciso de los diferentes eventos de modificación entre sí no siempre
es directamente comparable entre las vías. Las distancias relativas
desde el punto de ruptura se indican en la parte superior derecha
(no a escala). Los triángulos y arcos sombreados muestran
distribuciones y niveles relativos de las modificaciones indicadas.