MUTACIONES

MUTACION: una variación espontanea o inducida del genoma, un cambio permanente y

heredable en la secuencia del ADN, nucleótidos y es heredable. Un gen tiene n rango de mutación
normal: 1x10 -6 por locus de generación.

CLASIFICACION DE LAS MUTACIONES:

- MUTACION GERMINAL: (ovulo/esperma) este tipo de mutaciones se transmiten a la

siguiente generación si una celula mutada participa en la fecundación.
- MUTACION SOMTICA: (cualquier celula del cuerpo, menos las germinales) no se
transmiten a la descendencia, solo a las células que se originan a partir de esta. De
acuerdo a ello se clasifican en 3 tipos:
 MUTACION PUNTUAL (GENICA): ocurre en un par de bases o numero reducido de
bases adyacentes y se debe a modificaciones químicas del ADN que cambian una base
nitrogenada por otra. (frecuencia de mutacion1 x10 -10). Se dividen en 2 grupos
*transición: cambio de un nucleótidos por otro de la misma clase (purina-purina)
*transversal: cambio de un nucleótido por otro diferente (purina- pirimidina)
Otros tipos:
-MUTACION POR SUSTITUCION DE BASES: se cambia un nucleótido x otro (citosina x
timina).
-MUTACIÓN POR PERDIDA DE NUCLEOTIDOS O DELECION: se pierde un nucleótido y
no se sustituye por ningún otro ( por lo que se queda el marco de lectura abierto y a
partir de la mutación).
-MUTACION POR INSERCION DE NUCLEOTIDOS: se introducen uno o más nucleotuidis
que no pertenecen a la secuencia, modificando el marco de lectura abierto alterando
la secuencia de aminoácidos apartir del sitio de mutacion.
-MUTACION POR TRNASLOACION DE PARES DE NUCLEOTIDOS COMPLEMENTARIOS:
cambio de una purina x purina / purina x pirimidina.
De acuerdo al resultado en la secuencia de aminoacdos delas proteínas las mutaciones
pueden ser:
-MUTACIÓN NEUTRA: no tiene efecto sobre el fenotipo. El cambio en la secuencia de
nucleótidos genera tripletes que codifican para aminoácidos como: AAA- AGA (no hay
variación en las cargas).
-MUTACIÓN SILENCIOSA: alteración en la secuencia de nucleótidos, no provoca
cambios en el aminoacido que codifica. Existe mas de 1 codon, por lo que los cambios
de codones no modifican el resultado.
-MUTACIÓN SIN SENTIDO: cambia un codon que codifica para un aminoacido por uno
de terminación (UAG, UAAA, UGA). Propicia la terminación prematura de un
polipéptido y da como resultado una proteína trunca.
-MUTACIÓN POR DESPLAZAMINETO DE MARCO DE LECTURA: añaden o eliminan un
numero determinado de bases diferente a tres, por lo que el punto de mutacion, la
lactura del código se altera y propicia una adicion de aminoácidos diferentes.
 -MUTACIÓN DE SENTIDO EQUIVOCADO: el cambio de codon que codifica para un
aminoacido da como resultado uno de familia, grupo . El cambio del péptido si sera
evidente y drastico en su estructura, que es capas de inhabilitar la proteína.

 MUTACION CROMÓSOMICA: involucra el reordenamiento cromosomico, con

ganancia o perdida de segmentos.
-INVERSION DE UN FRAGMENTO CROMOSOMICO: gira 180° debido a una rotura
doble. (inversión del cromosoma 8)
-DELECION O PERDIDA DE UN FRAGMENTO CROMOSOMICO: perdida de un
fragmento en uno o varios tipos. (prader willi)
-DUPLICACIONES DEUN FRAGMENTO CROMOSOMICO: duplicación de un fragmento
cromosomico
-TRANSLOCACION DE UN FRAGMENTO CROMOSMICO: cambio de una posición de un
fragemento ( sx de down)

 MUTACIÓN GERMINAL: existe segregación cromosómica errónea.

-POLIPLOIDIA: aumento en el nuermo de brazos en cromosoma.
-HAPLOIDIA: disminución en el numero de brazo de cromosoma.
-ANEUPLOIDIA: hay >2 copias (trisomía, tetrasomia).

ORIGEN DE LAS MUTACIONES:

- ESPONTANEAS: producen condiciones naturales de crecimiento, influidas en el MA.

- INDUCIDAS: provocadas x mutágeno (agentes toxicos)
- MUTAGENO: agente que ocasiona que se incremente en frecuencia las mutaciones. Son
sustancias que tienen la capacidad de ocasionar cambios en el material genético de las
células vivas. (rayos Uv que forma dimeros de timina).
*agentes físicos: radiación que altera la estructura y secuencia del adn ( choque térmico)
*agentes químicos: reaccionan directamente con la estructura del ADN (colorantes,
benzopireno)
*agentes biológicos: alteran el material genético del hospedero. (bacterias).

- CARCINOGENO: serie de mutaciones en secuencia que se dirigen a la malignizacion de una

celula en división. Se desencadena como consecuencia de multiples mutaciones:
neoplasia.
Inica cuand se producen alteraciones irreversibles: protooncogén- oncogen.
- TERATOGENO: capacidad de causar daño al ser humano durante el periodo de vida
perinatal.
- POLIMORFIMOS: presencia de formas alélicas diferentes o polimorfismos sin ser
propiamente una mutacion.
*DE UN SOLO NUCLEOTIDO: sustitución de 1 solo nucleótido por otro (deleción, inserción)
*MICROSATELITES: regiones repetidas de secuencias debases (9-100pb) se conocen como
VNTR y se ocupan como marccadores moleculares.
 MECANISMOS DE REPARACION DEL DNA

Tipos de daño de ADN:

- Alquilantes: añade grupos alquilo (etilo o metilo). Sitios mas propenso de alquilación es
oxigeno del carbono 6 de la guanina formando O6 metilguanina.
- Intercalantes: intercalan nucleótidos y producen adiciones en un par de nucleótidos
( proflavina, acridina, etidio).
- Analogos de bases: presentan diferencia estructural con las bases convencionales, se
aparean de forma correcta o incorrecta.
- Energia ionizante: exposición a luz uv produce dimeros de pirimidinas, sobre todo en
timinas, cuando hay 2 timinas consecutivas. Tambien transiciones GC- AT, transversiones,
mutaciones con cambio en maco de lectura, duplicaciones o deleciones.

Sistema de reparación del DNA:

- Reparación directa:
*fotorreactivacion es el mecanismo de organismos procariontes mediante enzima fotoliasa
para conocer los dimeros de pirimidias producidos por luz uv. Se une a la timina y utiliza la
energía de la luz para romper los enlaces covalentes entre las pirimidias, logrando a
formar complementaridad.
*alquitransferasas: eliminan los grupos alquilos de la guanina y restauran la estructura
original.
- Reparación por escisión:
 Reparación por escisión de bases (BER): intervienen las enzimas: ADN GLUCOSILASAS
(8 tipos dif). Lo que hacen es que hidrozilan el enlace glucosídico entre la base
nitrogenada y el azucar, elimina la base dañada. Esta rotura genera sitios apurinicos o
apirimidinicos reconocidos por una AP endonucleasa ( APE I). Posterior la ADN
POLIMERASA B adiciona los nucleótidos para rellenar el hueco. Unido por la LIGASA.
 Reparación por escisión de nucleótidos(NER): reconoce cualquier lesión que
provoque una distoricion importante en la doble cadena del ADN. Pasos:
1.reconoce el daño
2.endonucleasa hidroliza los enlaces fosfodiéster de cada lado y elimina el fragmento
de adn de cadena sencilla
3. genera un hueco que se rellena con la ADN POLIMERASA i
4. la ligasa sella esta cadeba
(ej es la e. coli con 4 proteinas: uvra, uvrb, uvrc, uvrd)
 Sistema de 8-oxo guanina: la guanina es una base muy susceptible de oxidación por
especies reactivas de oxigeno, generando como consecuencia 8oxo guanina, en lugar
de unirsea la citosina se unirá a una adenina y producirá un error G- A.
*en los humanos: enzima ADN OGG1 reconoce la adenina unida con GO y elimina la
base incorrecta y la sistutitye x la correcta (citosina}9.
* en las procariontes esta el sistema de muTM- mutY.
- Reparación de emparejamiento erróneos: se basa en reparar las bases mal apareadas y la
corrección de los bucles que producen en la cadena de ADN como consecuencia del
deslizamiento la polimerasa durante la replicación.. EJ; MUTS, MULT, MUTH.
*muts reconoce las bases mal apareadas
* se une a mult y permite que se forme el complejo de reparación
*activara muth con actividad de endonucleasa, producuendi una rotura de cadena donde
se localiza la base mal apareada
*muth discrimina la cadena que se tiene que reparar por hemimetilacion.
*la enzima dam metilasa: se encarga de la metilacion de la secuencia 5GATC3 en las 2
cadenas.
*posterior ocurrirá la replicación de de adn, la única cadena metilada será la parenteal,
mientras que la cadena nueva no estará metiliaada y se reconocera como cadena que se
ha de reprarar.
*la polimerasa III añade la base correcta.
 sistema SOS: responde a la acumulación de adn de cadena sencilla cuando el proceso
de replicación se bloquea. Son activados por la proteína RecA en procariontes.
 los genes sos se encuentran unidos en su represor lexA.
 El adn de cadena sencilla es una señal de activación para proteína recA que se une
al adn con cadena sencilla(adnss) e interactua con el represor lexa: facilitando la
autoproteolisis: transcripción de la caja SOS.
 Aumenta los niveles de proteínas: lexa, reca, uvra, uvrb, uvrd.
 Se activa la respuesta SOS en la reparación de esicion de nucleótidos.
- Reparación de roturas de doble cadena:
*reparación por combinación homologa: (actúa durante la fase S) en la replicación este
sistema induce por la necesidad de tener una copia de adn correcta que sirva como molde
para restaurar la información perdida de la hebra dañada. Estan los genes: RAD52, RAD50,
RAD51, RAD55, RAD57, RAD59 y el complejo MRE11.
-la recombinación homologa implica gasto e hidrolisis de ATO para el intercambio de
cadena de ADN, pasos:
1- atm: recluta el complejo MRN que se une al adn y su actividad endonucleasa 5´3
´proccesa los extremos donde ocurruo el daño dejado expuesoto el lado 3´ en forma de
cadena sencilla.
2- proteína de replicación A (RPA) se une al adn e interactua con RAD52, desplazando
BRCA2 y atrae RAD51
3- RAD51 se une a la cadena sencilla y forma una nucleoproteína filamentosa de adn , con
ayuda de RAD54 restauran el fragmento dañado.
*unión de extremos no homólogos: participa cuando se producen roturas en la doble
cadena del ADN. El componente principal: proteína de cinasa dependiente ( ADN PKcs)
que tiene 3 subunidades: KU70, KU80, PKcs.
-estas subunidades reconocen los cortes de ADN y mantiene los extremos en proximidad
para su procesamiento y reunión
- se alineman los extremos ARTEMIS/ADN Pkcs, con actividad nucleasa del complejo
XPC4/ligando que se encarga del paso final de la liugacion.
 MECANISMOS DE CORRECION (VIDEO):
- PROOF READING(AUTOCORRECION DE ADN POLIMERASA): adn polimerasa que tiene
actividad exonucleasa, que si hay un error regresan y ponen otra base.

adn polimerasa

- CORRECCION TRAS LA ACCION DE LAS POLIMERASAS:

1.- REPARACION DIRECTA:
fotorreactivacion: mutacion del dinero de timina y enzima que repara es s la DNA
fotoliasa (reconoce y repara dimeros de timina).
desmetiacion de bases: la enzima es MGMT (metilguanina metiltransferasa). Regresa la
guanina a su estado basal, formando os 3 puentes de hidrogeno.
2.- REPARACION POR ESICION:
 1 BASE: introduce una base incorrecta, la enzima: glicosilasa la detecta y la retira. Otra
enzima que patrulla, detecta los sitios apurinicos-apiridimidicos: ENDONUCLEASA (detecta
los huecos). Detectada por ADN polimerasa I y la ADN ligasa une la cadena.
FRAGMENTOS: es cuando hay dimeros de timina, actúa la enzima eescinucleasa (corta
ambos lados del segmento erroneo y retira todo). Luego vinen ADN polimerasa y se une a
la ligasa
3.- REPARACION DEL SISTEMA SOS: acumulación de dna monocatenario, es eliminado por
la endonucleasa. Es reconocido por RECa (eucariotas) / RAC5 (procationatas) se unen al
dna monocatenario y se produce le hidrolisis de estas, con LEX A, que se tradujeran los
genes que permiten la sisntesis de las polimerasas de BYPASS: introducen nucleótido al
azar.
4.- REPARACION POR RECOMBINACION: cuando hay una rotura de doble cadena, siempre
hay una perdida de nucleotidos en ambas cadenas xq nunca son roturas limpias siempre
quedan colgajos. Para ese trozo no tenemos ninugna cadena molde, se recurre a una
cadena homologa- hermana periodo S o división y se empareja junto con la dañada y ese
espacio se rellena x recombinación.
 REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EN CELULAS PROCARIONTAS.
Material génico disperso.

La regulación de la producción de proteínas considerando el proceso en su conjunto,

puede llevarse a cabo en tres niveles:
- Replicación
- Transcripción
- Traducción

SISTEMAS CONSTITUTIVOS Y ADAPTATIVOS:

Se le conocen como genes que guardan la casa o genes constitutivos, que ser expresan
continuamente que su actividad no esta regulada, simplemente están sometidos a un tipo de
regulación deiferente que hace que se expresen siempre.

Los genes constitutivos codifican para sistemas enzimáticos constitutivos, que se necesitan
siempre para la actividad de la célula normal.

Los genes adaptativos: son las que se expresan solamente en determinadas situaciones y que
codifican para enzimas que solo necesitan en proceso concretos.

SISTEMAS INDUCIBLES Y REPRESIBLES:

 INDUCIBLES: cuando el sustrato sobre el que va actuar la enzima provoca la síntesis de

la enzima (denomina inducción positiva). EJ: procesos catabólicos de degradación:
operon lactosa, operon arabinosa, operon maltosa. (sistemas enzimáticos encargados
de degradar lactosa)
 REPRESIBLES: cuando el producto final de la reacción que cataliza la enzima impide la
sisntesis dela misma ( inducción negativa), al compuesto que impide la síntesis de la
enzima se denomina correpresor. EJ: proceso de síntesis o anabolismo, operon
triptófano, operon histina. (conducen a sisntesis de triptófano o histidina).

CONTROL:

 POSITIVO: un sistema esta abajo control positivo cuando el producto del gen
regulador activa la expresión de genes.
 NEGATIVO: cuando el producto del gen regulador reprime o impidela empresion de
los genes.

ELEMENTOS DEL OPERON:

OPERON: grupo de genes estructurales cuya expresión esta regulada por los mismos elementos de
control (promotor y operador) y genes reguladores.

Compuesto por:

- GENES ESTRUCTURALES: llevan polipéptidos, cuya expresión esta regulada.

- PROMOTOR: elemento control que es una región del ADN con una secuencia que es
reconocida por ARN polimerasa para comenzar la transcripción, esta antes delos genes
estructurales.
 - OPERADOR: elemento control que es una región del ADN con una secuencia que es
reconocida por la proteína reguladora (esta entre la región promotora y el gen estructiral)
- GEN REGULADOR: secuencia del ADN que codifica para la proteína reguladora que
reconoce la secuencia del operador.
- PROTEINA REGULADORA: proteína codificada por el gen regulador, se une al operador.
- INDUCTOR: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de genes.
- SITIO DE UNION CAP: sitio regulador positivo al que se une la proteína activadora de
catabolitos, cuando se une CAP promueve la transcripción para ayudar al ARN.

OPERON LAC

Es parte de la e. coli. LAC: es x lactosa.

- Si no hay lactosa no hay transcripción, aparece el represor.. y lo que esta después de el no

aparece.
- Hay lactosa: por lo tanto hay alolactosa(inductor dela transcripción) si se une al represor
lac, este ya no se une al operador.. se va a poder transcribir y es capaz de metabolizar la
lactosa: si hay transcripción.

Es un sistema inducible que esta bajo control negativo de manera que la proteína reguladora es un
represor que impide la expresión de los genes estructurales en ausencia del inductor. Esta
compuesto x 3 genes:

- Z: codifica b galactosidasa que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa + galactosa

- Y: codifica para galactosido permeasa que transporta b galactosido al interior de la cel
bacteriana (absorción de la lactosa en las membranas)
- A: tiogalactosido transacetilasa que cataliza la transferencia del grupo actil coenzima A al 6
OH.

 REPRESOR LAC:

Es una proteína que inhibe la transcrpcion del operon lac, lo hace al unirse al operador,
que se traslapa parcialmente con el promotor. Cuando esta unido bloquea el camino de la
ARN polimerasa y evita que transcriba el operon.
 Cuando la lactosa no esta disponible, el represor lac se une firmemente al operador y se
evita la transcripción.

En cambio al represor lac lo causa: ALOLACTOSA. (es un ejemplo de inductor).

Sin embargo cuando la RNA polimesara no se une bien al promotor del operon lac, se
tiene que ayudar ala proteína activadora de catabolitos (CAP):

ENTONCES…

- Glucosa presente, lactosa ausente: no hay transripcion del operon lac. Los niveles de
ampc son bajos xq los niveles de glucosa son altos, asi que CAP esta inactivada y no se
 puede unir.

- Glucosa presente, lactosa presente: hay transcripción (pero es menos xq están los dos y
no se unen al sito cap) del operaon lac a nivel bajo, el represor lac es liberad del operador
xq el inductor (alolactosa) esta presente, los niveles de ampc son bajos xq hay glucosa,
etnonce CAP permanece inactiva y no puede unirse al ADN, asi que la transcripción queda

nivel pobre.
- Glucosa ausente, lactosa ausente: no hay transcripción del operon lac. Los niveles de
ampc con altos xq los niveles de glucosa son bajos, CAP esta activada y estará unida
alADN. Sin embargo el preresor lac también estará unido al operador.

- Glucosa ausente, lactosa presente: ocurre una fuerte transcripción del operon lac, este esl
liberado xq la alolactosa esta presente, los niveles de ampc son atoos xq no hay glucosa,
 CAP esta activa y unida al ADN.

OPERON TRP

Triptófano: creación de polipéptidos.

Pero se habla de la E. coli.

Operon: combinación de genes y secuencias ordenadoras.

Codifican para enzimas en la síntesis de triptófano. Se transcriben arn m, después a proteínas.

Es un sistema de tipo represible, ya que el aminoacido triptófano (correpresor) impide la expresión

de los genes necesarios para su propia sintensis cuando hay niveles elevados de triptófano. Los
elementos del operon trp:
- Genes estructurales: existen 5 (trpE,D,C, B,A)
- Elementos de control: promotor y operador.
- Gen regulador (trpr): codifica la proteína reguladora, este gen se encuentra en otra región
del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del operon
- Correpresor: triptófano

ENCENDIDO Y APAGADO:

El represor trp no siempre se une al ADN, soo se une y bloquea la transcripción cuando el
triptófano esta presente.
Cuando el triptófano esta presente, se une a las moléculas del represor y cambia su forma
para que se active: se llama correpresor.
 Alto triptófano: actúa como correpresor al represor, este se une al operador y no se
continua la transcripion. (feed back)

Cuando hay poco triptófano en la celula, el represor tro esta inactivo, no se une, ni
bloquea la transcripción: permite que el ARN polimesara transcriba al operon trp.
 Bajo triptófano: ARN polimesasa se une al promotor y transcribe los 5 genes en arn m,
donde hay mas biositensis de triptófano.
Inhibición de retroalimentación de las proteínas:
 REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EN CELULAS EUCARIONTAS.

La regulación de la expresión génica en organismos eucariotas puede darse a distintos niveles:

- Cromatina
- Transcripcional
- Postranscripcional
- Traduccional
- Post traduccional

OJO: las proteínas de factores de generación de transcripción prefiere unirse en los surcos
menores.

 CAJA TATA (esta es el promotor) (rio arriba100-200pb): genes de expresión indusbible

(dependen de alguien) como los factores de transcripción (cuentan con estructuras
secundarias) + comunes: dominios hélice (2 alfa hélice), dedos de zinc, cremalleras de
leucina, hélice asa hélice. Necesitamos que estos se inhiban o activan para regulación.
 Carecen de promotor, tienen las islas cPG: genes que se transcriben demanera continua,
genes de expresión constitutiva (G3DP).

1. CONDENSACION DE LA CROMATINA: se llevara a cabo la selección de genes que se van a

transcribir y los que no.
- La cromatina esta constituida por adn enrollado alrededor de histonas.
- Algunas regiones están fuertemente condensadas en núcleo interfásico, formando
heterocromatina, transcripcionalmente.
- La remodelación de la cromatina implica un cambio en el adn y las histonas en los
nucloesomas.
- Las histonas pueden sufrir varios cambios: ACETILACION ( el agregado de los grupos
acetilos residuos conservados de lisinas en el extremo n terminal es mediado x las enzimas
histona acetiltransferasas.
- Esta modificación de histonas provoca: reducción en la afinidad delas histonas x el adn al
neutralizar la carga negativa del adn, lo que puede impedir su interacción con las cargas
positivas de las histonas.
- Dando como resultado la remodelación de la cromatina las secuencias promotoras
quedando libres de histonas y son accesibles a las proteínas que inician la transcripción,
regulando los genes correspondientes.

2. METILACION DEL ADN: son cambios químicos en el ADN, están asociados al silenciamiento
semipermanente de regiones del genoma,
-metilacion del ADN: tiene lugar en citosinas que son modificasas 5 metilcitosina por la
adicion de un grupo metilo que se encuentran en los dupletes o islas gpc (la mayoría de las
islas gpc están metiladas).
Tipos de metilacion:
  Metilacion de mantenimiento: responsable de agregar grupos metilos a la nueva
cadena sintentizada, luego de la reparación del genoma, tomando como referencia los
sitios metilados de la cadena original
 Metilacion de novo: agrega grupo metilo en posiciones completamente nuevas y
cambia de esta manera el patron de metilacion con una determinada región del
genoma.
3. NIVEL TRANSCRIPCIONAL: la transcripción deun gen estado activo esta controlada en el
inicio por la interacción de arn polimerasa con su promotor. Este es el punto de control
mas importante y sea el nivel mas común de regulación.
 Regulación CIS: es una secuencia contigua a un gen que tiene un efecto regulador
sobre la tasa de transcripción de ese gen. En eucariotas son necesarias para la
regulación dela transcripción que se encuentra en los promotores y regiones
amplificadas (enhaners). Estas regiones se encuentran en toda una serie de elementos
cis (como caja CAAT y CG).
 Regulación TRANS: son las proteínas que modifican la velocidad de la transcripción,
regulando este proceso.
-se fijan al adn (tanto a los intensificadores como el promotor)y pueden actuar de
forma independiente
-factores de transcripción tiene 2 dominios: fijación al ADN (permite una proteína
reconocer sus genes diana), dominio de acción sobre la transcripción (que provoca
efecto positivo, este se puede unir a la ARN POL II).

4. NIVEL POST TRANSCRIPCIONAL: se subdivide en..

 CORTE Y EMPALME ALTERNATIVO DE EXOES ( SPLICING DIFERENCIAL): corte y
empalme ( donde se eliminan los intrones y los exones son unidos de manera
consecutiva), muchos genes se transcriben en un único ARNm maduro, pero los ARNs
de algunos genes tienen patrones de splicing diferencial, es decir: un solo gen da lugar
a mas de una secuencia de ARNm maduro.
Un transcrito primario se empala en mas de una forma y los exones internos pueden
sustituirse, añadirse o eliminarse. En otros casos se regula de tal manera que los
patrones muy específicos de splicing ocurren solo bajo determinadas condiciones.
 REGIONES REGULATORIAS DE LOS ARN M: cuentan con elementos específicos en su
secuencia que pueden regular su expresión, la localización de estos elementos son las
regiones no traducidas 5´ y 3´ (UTR).
 5´UTR: región regulatoria ya que controla la expresión de los genes a traves de
distintos elementos presentes en su secuencia: sitios internos de entrada de
ribosomas (IRES), sitios de unión a proteínas represoras o activadoras, codnodes
inicio no AUGs, entorno AUG, codones de inicio previo al marco de lectura (uAG) y
marcos de lectura previos al principal.
 3´UTR: posibilidad de obtener varios tipos de ARM apartir de un mismo
transcripto primario, lo que reside en la variabilidad de elección del sitio de
poliadenilacion ubicado en la región 3 UTR. Aquí los cambios del sitio de corte y
adicion de la cola poli A pueden modificar el extremo carboxilo- terminal de la
proteína.
  ESTABILIDAD Y ALMANCENAMIENTO DE LOS ARN M: varia la vida media de los
ARNm, los elementos estructurales se encuentran en los extremos 5´a 3´del arn , asi
como la secuencia especifica ubicada dentro del transcripto, que contriubye a la
estabilidad del mensaje. En este sentido, la presencia de l casquete o capuchon 5
´(CAP) dela cola polo- A confiere estabilidad del ARNm y lo protege de la degradación
prematura,
EJ: regulación por control de la estabilidad del mensajero esta dado x las histonas,
fuera de las divisiones celulares, la duración de la vida de los mensajes de histonas es
muy débil para poder estimarse. Durante la división su daracion es de 15-60min, si la
replicación del ADB esta bloqueada x inhibidores, la duración de vida delos mensajeros
de histonas se derrumba, por eso la síntesis de histonas esta estrechamente acoplada
a la reliacion del ADN, teniendo un efecto una perfecta adecuación entre la cantidad
de histonas fabricadas y la del ADN sintetizado.
La regulación de la estabilidad de los mensajeros dehistonas pine en juego la
estructura especial, la horquilla, siuada en extremo 3´de los arm. La deleción de esta
estructura conlleva a una estabilización de los mensajeos y su acomplamiento a un
mensajero que lo desestabiliza.
 SILENCIAMIENTO GENICO POR ARN S PEQUEÑOS: existe una clase de pequeños arns
cuya función es silenciar genes, ya sea x degradación o evitando la tradccion. Es una
regulación fina dela expresión y es muchi menos demandante que regular a
transcripción entre si.
*micro arn: el mecanismo inicia con la sintensis de un pri-miRNA en el núcleo celular,
que es procesado por una proteína llamada microprocessor y se forman los pre-
miARN. Estos son exportados al citoplasma donde la enzima DICER los corta en
pequeños fragmentos de doble cadena que se unen con proteínas pertenecientes a la
familia de argonaita. Estos fragmentos se acoplan con el complejo RISC y x medio de
una actividad similar a una helicasa asignada en el complejo, desenrolla la dible hélice
al ARN blanco produciendo el silenciamiento.

5. NIVEL TRADUCCIONAL: mecanismo de regulación del inicio de la traducción en eucarionas

involucra la unión de proteínas citoplasmáticas a sitios específicos de ARNm.
EJ: traducción de las proteínas ferritina y el receptor de transferrina
-la ferritina esta involucrada en el almacenamiento intraceular del hierro, mientras que el
receptor de transferrina se une a la proteína que es el responsable de llevar el metal.
-ambis ARNm oiseen 30 nucleotidos
-el ARN que codifica a la ferritina el IRE se ubica hacia el extremo 5´mientras que el arnm
que codica para el receptor de la transferrina esta en 3´ que impide el ensamblaje dela
maquinaria para la traducción impidiedo que se produzca mas proteína.
-la unión de aconitasa en el extremo 3´del arm del receptor de transferrina lo desetabiliza,
xq posee una secuencia desestaibilizadora rica en AU, favorece la traducción de esta
proteína. Liberando IRE.
 otro mecanismo de regulación de la traducción es la degradación mediada x
mutaciones sin sentido, donde se degradan ARNm en los que uno o mas exones ha sido
cortados y empalmados de manera incorrecta. En la mayoría de los arnm con corte y
 empalme de exones correcto, el codon de termiacion se encuentra en exón final. Cuando
el proceso de corte y empalme es defectuoso se modifica el marco de lectura y puede
generarse un codon de stop dentro del gen: desencadenand degradación del arn m debdio
a la presencia de uno o mas complejos de la unión.

6. NIVEL POST TRADUCCIONAL: puede sufrir alteraciones a este nivel de manera

cuantitavita-cualitativa.
-glicosilaciones, fosforilaciones, acetilaciones, sibosilaciones.
-las proteínas de las ceulas secretan suelen incorporarse a una serie de aminoácidos
hidrofóbicos en su extremo n- terminal llamado: péptido señal. Funciona como una señal
que envia a las proteínas hacia el RE durante la traducción. Cuando sale el ribososam el
complejo se llama SRP que lo reconoce y lo lleva al RE, facilitando la entrada de cadena de
aminoácidos hacia el interior.

DIFERENCIAS ENTRE PROCARIONTAS Y EUCARIONTAS EN CUANTO A MENCANISMOS DE

REGULACION GENICA

FORMAS DE REGULAR EN EUCARIONTAS (VIDEO):

- sintetiza los factores de transcripcinon

- la unión a un ligando: para que se active. EJ: t3
- activación o inhibacion de fosforilzacion: señal extra cel es capaz de activar el núcleo, se
activa las kinasas que van a fosforilar los factores, permitiendo la expresión de genes
- formación de complejos: no son capaces x si solos, necesitan otros factores como homo-
heterodimeros.
- -diversion de factores de transcripción: unidos, si estos se degradan el factor queda libre
y migra al promotor y expresa el gen.
Entre la región potenciadora y promotora, se llama la región reguladora. Pueden estar
separados por 100-1000 pb. Ejercen su acción en arn polimerasa, hace que tenga mas de 1
transcrito.

La transcripción: tiene una atenuacuion sobre ella o regular la maduracin del arn, o regular la
exportación al citoplasma. O regular el proceso de exportación.

Esta mediado por proteínas reguladoras, que van a mediar es eproceso de transcripción.
Regulacion del procesamiento: eliminar intrones, empamar exones: SPLICING. (interrumpe,
bloquea la expresión de dicho).

Regular el transporte del poro nuclear: evitar la maduración del arn (edición de la cola de
polier).
 ONCOGENETICA

El cáncer se caracteriza por ser una enfermedad multifactorial que afecta el crecimiento y la
proliferación normal de las células, además de producir alteraciones en el proceso de
diferenciación celular, lo que condiciona a diferenciación celular.

Para mejor comprensión: RELOJ BIOLOGICO.

- CEL EUCARIOTAS: el ciclo celular esta compuesto de las fases G1, S, G2, M. su regulación
es prioritaria y es controlada por la particionacion de ciclinas y cinasas dependientes de
ciclinas. Ambas cooperan donde las CDK fosforilan ciertas ciclinas en un momento
especifico y permiten que la celula contnue el ciclo celular. Ademas que entre fases
mencionar los checkpoints que involucran una maquinaria compleja de proteínas que
verigica si la cel dan condiciones adecuadas o no.
ONCOGENES:

Inestabilidad genómica del cáncer

 Protooncogen: antes de que el oncogen sufra la mutacion, tiene un papel en la

regulación de la división cel normal, crecimiento celular. genes que codifican
proteínas que regulan demanera normal y fisiológica la cascada de eventos que sirven
para mantener el control dela progresión del ciclo celular y el estado normal de
diferencioacion de la celula.
 Oncogen: sufrio una mutacion (ganancia de función). Es la forma estimulada
del protooncogen. Es un producto de de las oncoproteinas. Las cuales actual
pleiotropicamente provocando una serie de cambios tanto celulares como
moleculares, según el nivel molecular especifico donde actuen.
Tambien los genes supresores de tumor o antioncogenes: desempeñan un papel clave en la
tumorogensis, ya que operan restringiendo o suprimiendo la proliferacion ceular bajo ciertas
condiciones. Son importantes ya que para la formacion tumoral maligna es necesaria la activacion
o perdida,lo que les confiere una naturaleza recesiva.

-mutacion de sentido erróneo: cambio aminoacido

-oncogen: acelerador( solo necesitan 1 alelo mutado) / gen supresor: freno.
  Gen supresor de tumor: control celular (perdida de función lo genera el
cáncer). (++++frec).

GENES DRIVER:

Conductoras: genes clave, en el ciclo celular en cuanto a la proliferación que le dan a la

celula la capacidad para proliferar mas que las otras.

Pasajeras: tienen cierto numero de mutaciones no son indispensables y se desaparecen. 

PROTOONCOGENES Y GENES SUPRESIONES DE TUMOR DE INTERES MEDICO :

- Proteinas factores de crecimiento: proporcionan un estimulo externo a la celula,

que se unen a su receptor en la membrana celular, onteriorizan la seña
acutoactivandose como una enzima con capacidad de tiroisina cinasa o atraves de
segundos mensajros como proteinas de G, que inician despues de una cascada de
fosforiliaciones en proteinas citoplasmaticas. Finalmente migrando al nucleo,
uniendose al DNA y activando su expresion.
CASCADA:
 FACTORES DE CRECMIENTO: se unen a dominions extraceulares de receptores
enclavados en la membrana plasmatica, donde disparan una señal de transduccion. El
primer onco gen: factor de crecimiento V- sis (procedente del sarcoma de los simios).
RECEPTOR CON ACTIVIDAD DE TIROSINA CINASA: el factor de crecimiento epidermico
(EGF) es una proteina transmembranal con actividad de tiroisna que activa cuando se une
un factor de crecimiento en el dominio extraceular, en consencuencia la proteina v-erb. B
se activa inespecificamente, perdiendo su funcion.
 PROTEINA G ASOCIADA A MEMBRANA: son los genes RAS, que incluye 3
protooncogenes: Ha ras, Ki ras, N ras. Los que codifican para proteinas de 21kda y su
funcion es unir GTP/GDP a traves de su actividad de GTPasa, participando en vias de
transduccion de senañales que regulan el crecimiento ceular.
*las mutaciones se encuentran casi exclusivas en los codones 12,13,61..
*entre las vias que activan las proteinas Ras: via de señalizacion de cinasas MAP. ( se
manifiesten en etapas mas tempranas).
---> genes promotores del crecimiento:
1. Perdida del control del crecimiento: altas tasas de apoptosis, fracción de células
proliferativas varian de un tumor a otro y pueden determinar la sensibilidad del
tumor a otro. La dependencia de glicolisis
2. Inestabilidad genética: los tumores se original de células que sufren un daño no
leal, este puede ser naturaleza ambientao o estocacioco, las mutaciones
oncogénicas pueden ser 4 clases: genes promotores del
crecimiento(protooncogenes), genes supresores de tumores, genes involucrados
en la reparación del ADN y genes pro apoptóticos.
 CINASAS CITOPLASMATICAS: lleva acabo la fosforilación de residuos de
serina/treonina, son proteínas solubles citoplasmáticas y miembrso de la cascada de
senañizacion que fosforilan una proteína activandola. El onco gen v-raf es una versión
truncada de la proteína celular.
 FACTORES TRANSCRIPCIONALES: la cascada de señales culmina en la activación de
genes relacionados con la división celular, fenómeno que ocurrea través de la
activación/inactivación de factores transcripcionales. El gen c-myc se ha asociado con
divesos neoplasmas en un numoer amplio de especies, actuando por amplificación, es
decir que la proteína es normal pero la expresión se encuentra aumentada, en tumores
primarios se reportan8-10 x cel.

GENES SUPRESORES DE TUMOR

Los mecanismos por los cuales ambos alelos se pueden inactivar pueden ser por el mismo
tipo de mutacion o por diferente.
 Perdida de heterocigosidad de alelos: cambio de 2 alelos mutados, lo que
favorece el desarrollo del tumor, condición inicial para el desarrollo del cancer.
Esta relacionada con la teoría de los dos golpes: una celula al inicio de una
proliferación descontrolada da origen a mas ceulas con esta característica.

CARACTERISTICAS DE LAS CEULAS CANCERIGENAS:

1. Proliferación aumentada (perdida del control del crecimiento)

2. Inestabilidad genómica (capacidad de incrementar el numero de mutaciones)
3. Potencial replicativo limitado
4. Capacidad de migrar (capacidad indefinida)
5. No conducen polaridad

CONVERSION DE UN PROTONCOGEN A ONCOGEN

- Delecion o mutacion puntual: da una proteína que se expresa en cantidad

regulada, pero tiene alta alteración.
- Mutacion regulatoria: es una proteína normal y hay sobrecrecimiento
- Rearreglo cromosomico: translocación 9,22
 FUNDAMENTOS DE TECNICAS MOLECULARES

PCR
- QUE ES: técnica rápida, sensible, especifica para amplificar regiones particulares de acidos
nucleidos.
- Objetivo: amplificar el dna propiamente dicha, detección para poderlo detectar en
muestras con pequeñas cantidades del dna diana-
- Principio: es una replicación enzimática in vitro delos acidos nucleicos específicos, durante
el cual se aprovechan 3 caracteristicas de los acidos nucleicos: complementaridad de
bases, naturaleza de doble hebra del adn, capacidad de desnaturalaizacion y
renaturalización dependiente de la temperatura.
- Componentes:
 ADNc / ADNg: es el molde, o sea la región o fragmento de adn que se va
amplifiicar.
 Primes (cebadores): determinan el principio y final de la región que se va a
amplificar. Son secuencia de oligonucleótidos que se unen de forma
complementaria especifica a una cade de acido nucleico e inicia la síntesis de esa
cadena.
 Taq plimerasa: es la que copia la región a amplificar ( es termoestable)
 Nucleótidos(dNTPs): apartir de los cuales la adn polimerasa construye el nuevo
adn ( desoxiadenosina, desoxiguanosina,desoxitimina, desoxitidina).
 Buffer(cofactor): solución amortiguadora en torno quimico. (pueden ser los iones
metalicos, moléculas organicas o conezimas)
- Pasos para la pcr:
1. Desnaturalización: se separan las cadenas a los 60-95° (inicia con la mezcla de
partida: dna de doble hebra, dntp, mg2, cebadores, dna polimerasa). Depende del
contenido de GC (mayor es la temperatura). Mayor sea el largo (mayor el tiempo).
Promedio 94° a 30 ciclos de 30-45seg.
2. Alinamiento (hibridación): los oligonucleótidos en la molecula monocatenaria
dependiente a temperatura. 50-55° (se añaden los cebadores). La temperatura se
reduce, los primes se aparean con el dna molde. La temperatura critica: alta
(impide apareamiento), baja (amplificación inespecífica). Depende el contenido
CG- primedio temp 50-55°
3. Extension/elongación: es donde la molecula se replica mediante la tac polimerasa
72° ( durante la elongación cada molecula de dna puede ser replciada en distintas
medidas, si no llega al primer cebador no se replica). La adn polimerasa sintentiza
de cada fragmento, va de 68-72°C se calcula 1 min x cada 1000pb de bases.

VIDEO:

-se requiere sintetizar 2 fragmento cortos de adn complementario al comienzo y al final de la

secuencia especifica que se quiera amplificar llamados cebadores o primers.
- se coloca en solución con: adn polimerasa, nucleótidos, primes.

- se lleva acabo la reacción de los 3 pasos

- al tercer ciclo ya se duplico el material

- factores que afecta aeficiencia y esoecificidad: es el diseño de los primes (xq son típicamente
sintetizados como 15-20 bases). ADN polimerasa o taq polimerasa (debe de ser termoestable)que
va 5 ´o 3´exonucleasa o inversa, requiere de cationes(magensio). Los DNTPs interatual con el mg,
lo que su osmolaridad tiene que ser mayor. (1.5mm de mg sugerido). Las reacciones dNTPs
factores deben de ser guardadas a 20° para evitar ciclos de congelado o no.

- uso: clonado de genes, dx de enfermedades infecciosas, determinación de paternidad.

INHIBIDORES Y REDUCTORES ED LA EFICACIA DE LA REACCION:

1. Interacción delos a nucleicos con la superficie en la que esta contenida la muestr

2. Degradación o captura de los a. nucleicos
3. Durante la transcripción reversa
4. Degradación o modificación del adn molde
5. Interferencias durante la hibridación de primes
6. Degradación de adn polimerasa
7. Intereferencia con la unión de sondas o de algunos fluoroforos.

VARIANTES DEL METODO:

- PCR ANIDAD: emplea 2 parejas de primes, una externa y una interna, tras 20 ciclos el
producto se doluye, elimnando los inhibidores presentes. EJ: histoplasma.
- PCR ASIMETRICA: añaden diferentes concentraciones de ambos iniciadores, de modo que
los primeros ciclos de pcr uno de ellos se agota y el otro se queda disponible. Solo 1 de las
hebras sigue amplificando gracias al iniciador mas abundante en blanco.
- PCR INVERSA: se emplea para clonar regiones desconocidas en un adn, situadas en
posición vecinal a secuencias diana conocidas. Es decir en lgar de amplificacir la región
interna, flanqueada x 2 iniciadores, que se re´lican en la región externa. Para ello es
necesario cortar ambos lados de la región diana con una enzima de restricción, de tal
forma que los extremos cohesivos resulta y puedan hibridar entre si.
- PCR ALELO ESPECIFICA: se basa en el diseño de oligonucleótidos que contengan las bases
especificas para cada alelo, lo que permite que solo haya amplifiacion cuando se
encuentren las bases complementarias de interés.
- PCR DE ARRANQUE EN CALIENTE (HOT START): algunos de los reactivos se mantienen
separados hasta que la mezcla se calienta a la temperatura de hibridación especifica. Esto
reduce el tiempo de hibridación lo que reduce la probabilidad de extensión inespecífica
del adn y la influencia de la unión del cebador inespecífico antes de la desnaturalización.
Puede ocurrir cuando la polimerasa TAQ se inhibe/inactiva o su adicion se retrasa hasta
temperaturas optimas de hibridación, mediante modiciaciones secundarias.
 - RT- PCR (pcr con trnascripcion reversa): se usa una enzima llamada retrotranscriptasa que
convierte un trozo especifico de arn en un tronzo de adn compatible. Luego la otra enzima
llamad ADN polimerasa amplifica ese trozo de adn.
- QPCR( pcr cuantitativa): se utiliza para detectar, caracterizar y cuantificar acidos nucleicos
para numerosas aplicaciones. Aquí se marca con compuestos fluorescentes permitiendo la
recopilación de datos mediante pcr avanzada.
- RT- Q PCR: se transcribe primero el adn complementario (adnc) mediante transcriptasa
inversa a partir de arn total o arnm.

VIDEO:

- PCR convencional o punto final: parte demuestra de dna.

- RP PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA CON TRANSCRIPCION INVERSA): RT
quiere decir retro transcripción, inicia apartir de una muestra de ARN, se necesita un paso
previo, para pasar de ARN- ADN complementario.
la enzima mas utilizada para obtener ADNc apartir de ARN es la retrotranscriptasa viral
MMLV- RT.
la técnica sigue con la convencional.
USOS: dx molecular e investigación.
Ya se hizo la
- RT PCR ( PCR CUANTITATIVA O qPCR o en tiempo real): mínimas variaciones en cada ciclo
puede llevar a diferencias del material simplificado en toda la reacción, pero si es
cuantificar el material ahí si se ve perjudicado. Ocupa el fluoroforo para contar.
Factores que afectan:
 Diferente concentración: fenol,alcohol
 Diferencias cantidad: polimerasa, dntp, primer

Nos permite saber el producto acumulado a lo largo de toda la pcr, permite inferir
cantidad de adn templado inicia había en cada muestra hasta el ciclo que se considera
conveniente: CURVA DE AMPLIFICACION, solo en la fase exponencial. En la meseta ya
no sirve.

 Intercalarte: fluorescencia (fluoroforo) que puede estar en el mismo primer o

fragmento separado.
 Necesita molde, orimers, dnts, buffer de reacción, taq polimerasa + fluororofo que
permite medir la taza de estos mismos. Dicha medición se saca después de cada ciclo x
eso se llama pcr en tiempo real.
 Al finalizar la aplicación: se puede hacer una electroforesis o curva de melting
(calentamiento gradual de la muestra, a medida que aumente la temperatura la
fliorescencia dsominuye, se relaciona con el tamaño y la secuencia).
 Uso: enfermedades infecciosas, enfermedades geneticas. El molde que se ocupa al
inicio es de DNAcomplementario (originario de RNA). Como cambia la expresión de un
gen con otro. Farmacos, etc.
- RT QPCR ( PCR CUANTITATIVA CON TRANSCRIPCION REVERSA): parte de muestras de
arn, se necesita la retrotranscripcion para pasar al ADNc.
EXTRACCION DE A. NUCLEUCOS /
CUANTIFICACION Y EVALUACION DEL ADN-
ARN/ ELECTROFORESIS / ESPECTOMETRIA .

Extracción:
Consideraciones: el adn de doble cadena se comporta como una estructura rigida
enrollada de forma aleatoria, regida por las repulsiones electrostáticas de las pares de
bases y el esqueleto. Para obtener fragmentos de ADN genomico es fácil, pero confrome
se requieran tamaños moleculares elevados >150kb.
ELECCION DEL METODO DE EXTRACCION:
Se realiza con los siguientes criterios:
 Tipo de a. nucleico que se va a extraer
 Organismo del origen del a. nucleici
 Técnica que se utilizara
En la técnica medica el adn genomico suele extraerse para uso en procesos como una pcr
cualitativa o southern blot, para el dx de determinación de variantes alélicas o clonación
de vectores.
1.- muestra: sangre, saliva, bacterias, restos de cuerpo.. etc:
- dentro de las cel: eucariotas(dentro del núcleo) / procariotas (disperso en el citoplasma)
- contenido celular( proteínas, enzimas, compuestos organicos).
2.- extracción de adn:
PASOS:
1. LISIS: romper las membranas para liberar el adn.
Métodos físicos: romper la pared celular, distrupcion mecánica, membranas
celulares vegetales, mortero, triturar.
Métodos químicos: romper la pared celular, romper la membrana nuclear,
detergentes: DSD. Enzimas: romper enlaces entre aminoácidos para digerir las
proteínas.
2. PRECIPITACION: separar el ADN libre de os residuos celulares. El extracto ceular: el
ADN se encuentra mezcado con residuos y contaminantes (proteínas, detergentes,
 reactivos). Se usa iones de Na+ para neutralizar las cargas negativas. Alcohol,
etanol, isopropanolol:ya que el adn es insoluble en alcohol. Proteasas y filtración.
se mezcla el adn en la solución acuosa, se añade fenol y se mezcla, después se
separa por centrifugación. Se remueven los restos celulares y particulas no
deseadas, posterior se re suspenden por conveniencia para el almacenamiento y
manejo.
3. PURIFICACION: si no se purifica una muestra: hay interferencia en el análisis,
reduce la calidad del adn, se conserva menos tiempo.

Métodos de extracción:
 Métodos químicos:
- Organicos: fenol, cloroformo.
- Inorganicis: saltin out, proteinasa K, gel de silica.

 Métodos físicos: cama magnética, papel filtro.

 Metodos de intercambio de aniones: fase solida, cromatografía de
intercambio de aniones. Ofrece ADN ultrapuro de grado de transfección
para resultados optimos en aplicaciones sensibles.
 Membrana de silice: adsocrcion selectiva de la membrana. Proporciona
acidos nucleicos de alta pureza para su uso en la mayoría de aplicaciones
posteriores, rápido y barato.
 Partículas magnéticas: unión a particulas de silice magnéticas en
condiciones ionicas controladas. Proporciona acidos nucleicos de alta
pureza para su uso en la mayoría delas aplicaciones posteriores Facil
automatización.

SALTING OUT:
La principal diferencia en esta metodolofia radica en el empleo de una solución
concentrada de salesen lugar de solventes organicos para la lisis celular y extracción de
proteínas.
 Extracción del ARN: de cel eucariotas existen 2 posibilidades: extracción de arn
total (arn m, arnr, rnr de transferencia, arnt). Es menos complejo y mas barato.
PASOS:
1. FASE LIQUICA
2. FASE SOLIDA
3. MEZCLA
 4. UNION DE LOS AN A LA RESINA
5. LAVAR-ELUDIR

CROMATOGRAFIA:
PASOS:
1. FASE LIQUIDA
2. FASE SOLIDA
3. MEZCLA
4. UNION DE LOS AN A LA RESINA
5. LAVAR/ ELUDIR

CROMATOGRAFIA POR AFINIDAD:

- EXCLUSION DE TAMAÑO: separación de los ácidos nucleicos de acuerdo al peso
molecular, empleando una columna empaquetada con una amtriz de gel
conformada por particulas poliméricas organicas o de silice. Las moléculas de gran
tamaño no penetran los poros del polímero, por lo que migran mas rápido las de
menor tamaño. Esta técnica es el fundamento de la purificacion en el gel de
agarosa de un acido nucleiuco determinado tamaño.
- INTERCAMBIO IONICO: empleada para separar proteínas, es el método alternativo
que permite la concentración y purificacion del adn de calidad. Los acidos
nucleicos con la resina de carga positiva de las columnas de intercambio ionico por
lo que el acido nucleótido cargado negativamente se retiene yy permite que otras
moléculas como proteínas o lípidos.
- ABSORCION: los acidos nucleicos en solución se fijan de forma selectiva en silice o
vidreo, en presencia de sales caotrpicias, meintras que proteínas, metabolitos y
otros contamintantes se eliminan mediante lavados, posterior los acidos nucleicos
se recuperan con una solución hiposalina.
ESPECTROFOTOMETRIA:
Es una técnica analítica que se utiliza en el ensayo cualitativo y cuantitativo de una
sustancia química. Se puede usar para la evaluación espectroscópica de una sustancia de
muestra para investigar la composición de esa muestra en particular.
La concentración de ADN se puede determinar mmidiendo la absorbancia a 260nm. Para
mayor precisión las lecturas deben e sstar 0.1-1- Una absorbancia de 1 unidad de 260nm
corresponde a 50ug de adn genomico por ml (A260= 1 para 50ug/ml).
La pureza del ADN:
- La relacion de las lecturas a 260nm y 280nm(A260/A280) proporciona una
estimación de la pureza del adn con respecto a los contamintantes que absorben la
luz UV como las proteínas.
- La relacion A260/A280 esta influenciada por el PH
- El ADN puro tiene una relacion A260/A280 de 1.7 a 1.9
-
Tipos:
- Espectrometro de fluorescencia de rayos x de energía dispersiva: funciona como
un tubo de rayos X que dispara fotones a la muestra. Detecta la fluorescencia.
- Espectometro de plasma acoplado inductivamente: se utiliza como fuente de
exicitacion atómica/ionización. El plasma puede generarse calentando gases
nobles como el argon o el helio a temperaturas intensamente altas, derivadas de
una chispa obtenida de bobinas calentadas. Sirve también para el analisi de no
metales.
- Espectometro de ruptura inducido por laser: es un método portátil para convertir
el material de muestra en una mezcla de plasma que contiene atomos, iones y
electrones de alta energía.

ELECTROFORESIS:
Principio: migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz
porosa, según su peso molecular o tamaño, movimiento generado x el cambio eléctrico.
Elementos: cámara de electroforesis
- Geles: la muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con la finalidad de
evitar perturbaciones mecánicas durante la separación.
 GELES DE AGAROSA: es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la
propiedad de mantenerse en estado solido a temperatura ambiente, que se
disuelve fácilmente en temp 50-60° se torna liquida y se solidifica cuando se
enfría formando un gel altamente poroso. Para elaborar el gel se pesa la
cantidad de la agarosa requerida, se disuelve en una solución amortiguadora
adecuada de la misma composición y concentración que el buffer de
corrimeitno y se calienta hasta formar una solución. Sin dejar enfriar se vierte
en uno de los extremos en forma de peine con la afinidad de generar los
pocillos u orificios donde se colocaran las muestras. No es toxico y permite
realizar el análisis de acidos nucleicos con pesos moleculares variados. Sin
embargo la resolución es menor. El tamaño de los poros depende de la
concentración de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es
 inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido, a mayor
concentración, menor tamaño de poros y visceversa. Durante la electroforesis
los acidos nucleicos lineales con un peso molecular alto migral al anodo mas
lentamente que los de menor peso molecular, esto se debe a que los acidos
nucleicos de peso elevado tardan mas tiempo en atravesar los poros de
agarosa. La concentración de agarosa mas utilizada para electroforesis de a.
nucleico es de 0.5-2%.
 GELES DE ACRILAMIDA: es un polímero sintetico, termo estable, incoloro y
químicamente inerte, con el que se pueden generar geles de amplio intervalo
de tamaño de poros. El tañao del poro del gel esta determinado x la
concnentracion total de acrilamida presente que generalmente se maneja en
proporción de 19:1 y se consiguen distinasa porosidades, siempre menores que
la de los geles de agarosa. La acrilamida es una neurotoxina por lo que se debe
de manejar con precaución. La electroforesis con geles de acrilamida siempre
se realiza en camaras verticales. Cuando es de 2 capas de geles son de
diferente concentración y uno va arriba y otro abajo.
- BUFFER DE CORRIMIENTO: es de la misma composición de ph que el buffer. Este
proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantien el ph
sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. Em caso de los an, pueden
emplearse TB! O TAE como buffer de corrimiento.
- MARCADOR DE PESO MOLECULAR: son moléculas de adn o de proteínas que
permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de acidos
nucleicos o proteínas contenidos en muestras. Los marcadores de proteínas
suelen ser de peso molecular ya conocido desde 110-300kda) las cuales pueden ser
teñidas o coloreadas.
- BUFFER DE CARGA: tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo
que facilita su deposito en el posillo y evita su salida del gel, permite además
monitorear el corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relacion 1:3 para
acidos nucleicos o 1:6 para protrinas. Contiene tris, azul de bromofenol, azul de
xileno, glicero. Mientras que el de proteínas: tris hcl, ph 6.8, ditiotritio, SDS,
glicerol, azul de bromofenol.
- TRANSILUMINADOR UV: es el sistema mas empleado con +frecuencia por ser
simple y efectivo. Emite energía a una longitud de onda de 302nm aunque también
existe para 254-365nm y suelen encontrar un botón para baja o alta intensidad.
Los epitransiluminadores generan emisión visible por fluorescencia igual que el
transilumonador pero a diferencia, la fiente de energía se encuentra y no pasa
atraves de la muestra.
ELECTROFORESIS HORIZONTAL
Se lleva a cabo con el gel de agarosa para acidos nucleicos. Para corrimiento del buffer
debe curbir el gel, con la finalidad de evitar que se seque por el calentamiento inducido
por el paso de la corriente eléctrica.
- Se cargan las muestras: puede hacersce en seco o en liquido.
- Se corre por unos minutos en bajo voltaje
Otra técnica:
- Electroforesis submarina: la totalidad del gel se cubre con buffer de corrimiento
desde el momento de cargar las muestras de los posillos. (el buffer cubre el gel y
se llama submarina xq se sumerge)

ELECTROFORESIS VERTICAL
Empleada exclusivamente con gel de poliacrilamida, se utiliza para proteínas o a. nucleicos
de pequeño tamaño. El gel debe de estar contenido en 2placas rectangulares, de vudrio
donde la corriente eléctrica se genera gracias al buffer en el que se encuentra embebido el
gel y llena las cubetas o compartimientos del anodo y el catodo.
ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
Es el método mas común para electroforesis de ADN es elaborar un gel horizontal de
agarsa con una concentración de 0.5-2%. La carga elecritca de la molecula de adn la
otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa y cuyo numero es igual al doble del numero
de pares de bases. La movilidad de la electroforesis dependerá únicamente de la longitud
del ADN y se representara en bandas. El corrimiento se realiza a voltajes entre 25-100V a
mayor voltaje mayor velocidad de corrimiento. El avance electroforético se monitorea
atraves de los colorantes. Si los fragmentos de ADN son pequeñs <50pb o bien se requiere
discernir entre fragmentos de acidos nucleicos con una diferencia de longitud de 1-20pb.
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
Se realiza en un gel formado por 2 geles de policralidamida. Están unidos pero limitados
por una fase de separación visible a contra liz, para lograrlo deben prepararese x separado
esperando la polimerización total del primero, para continuar con la del segundo. El gel de
acrilamida se forma entre dos vidrios y el sistema completo se sumerge en buffer de
corrimeitno dentro de la cámara vertical de electroforesis. Es común en los geles de
acrilamida realziar un preocrrimiento de unos 10-30min a voltajes bajos con el cual se
asegura que los pocillos se iluminen antes de cargar la muestra.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE UNA ELECTROFORESIS

 1. Preparar un gel de agarosa/acrilamida a la concentración requerida
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado
3. Cargar las muestras en el gel
4. Realizar la corrida electrofoerica al voltaje pertinente
5. Visualizar los acidos nucleicos

ELECTROFORESIS CAPILAR
Es una herramienta de separación de biomoléculas.
Principio: es una técnica analítica de separación que se basa en la diferente velocidad de
desplazamiento que tienen las distintas proteínas en el seno de un medio loquido,
contenido en un tubo capilar, al someterlas a la acción de un campo eléctrico.

BUSQUEDA DE MUTACIONES PUNTUALES

1. POLIMORFISMO DE CONFORMACION DE CADENA SIMPLE(PCR
SSCP)
Se refiere a la identificación de segmentos de ADN monocatenario con migración
anormal en la electroforesis de gel. Es capaz de identificar la variación de 1 solo
nucleótido en un segmento de ADN típico 150-200nucleotidos.
 Técnica de rastreo de mutuaciones basadas en el distinto comportamiento
electroforético que presentan las moléculas monocatenarias del ADN según su
secuencia en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante.
 Una molecula de dna monocatenaria tiende siempre a formar estructuras
secundarias debido a aparemiento interno sobre sus bases, puesto que
prefiereestar en forma de doble cadena que como cadena simple. Estos
apareamientos forman cadenas tridimensional, llamados conformers.
Dependiendo de la forma adquirida es como va a migrar en la electroforess.
Se basa en condiciones no desnaturalizantes una hebra individual de ADN adopta
una conformación espacial que es especifica de la composición de la secuencia de
nucleótidos. Esta información depende de la hibridación entre diferentes regiones
de un segmento de ADN replegado sobre si mismo. La configuración diferente es
provocada por el cambio de una sola base, entonces podría ser detectada en
algunas condiciones de migración electrofoertica en una matriz de prolacrilamida.

PASOS:
 1.Los fragmentos de dna tiene que tener un tamaño de 400pb, de tal manera el
primer paso es amplificar la región del gen que se va a estudiar x PCR
2. el producto de la pcr se desnaturaliza calentando a 94°C y se enfría en hielo
3. se someten a electroforesis no desnaturalizante en el gel de acrilamida (se tiñe
con tinción de plata)

RESULTADO:

 Si no existe mutacion solo se detectaran las líneas del homoduplex

(formado x las 2hebras de adn complementaria que se han vuelto a unir
en la electroforesis)
 Si hay una mutacion: aparecen nuevas bandas debido al plegamiento
de cadenas mutadas

Usos:

- Screening de enfermedades para mutaciones

- Mapeo genético en ratas
- microbiologia
2. ANALISIS DE HETERODUPLEX
Es una molecula de DNA de doble cadena con uno o mas pares de nucleótidos
desapareados. Entonces una molecula de DNA sin bases desapareadas es un homo
dúplex.

El desaparamiento de un solo par de bases cambia la conformación de la molecula

y retarda su movilidad electroforética. En este análisis las muestras del control y
del px enfermo se hace pcr. Si hay alguna diferencia en la secuenciación de
nucleótidos se formara un heteroduplex.
 Las inserciones o deleciones >3pb generan heteroduplex estables. Las
mutaciones puntuales son menos estables y sensibles a cambios del
medio ambiente.

PASOS:
1. PCR (para amplificar la cadena de interés)
2. Desnaturalización de doble cadena 95°
3. Rehibridacion a temperatura ambiente
4. Se forman los hetero/homoduplex
5. Electroforesis en gel o capilar
Usos:
- Dx de anemia drepanocítica
- Fq
- Hemoctromatosis
- Factor V de leydin

3. CROMATOGRAFIA LIQUIDA DESNATURALIZANTE DE ALTO

RENDIMIENTO
Es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos
fases inmiscebles, una fija o estacionaria y otra móvil.
 La fase móvil: es un liquido que fluye a través de la columna fija
 La fase fija: se inserta en la inerte física y químicamente, puede ser un solido de
diferentes tipos de cromatografía,
El tamaño de las particulas de la fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual
genero la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil.
Se afirma que detecta mutaciones según los diferentes homoduplex y heteroduplex originados apartir de un
fragmento de gen estudiado. Los heteroduplex son mas termolabules que sus correspondeintes homodiplex,
se separan x cromatografía liquida de fase eversa que trabaja un rango 50-70.
PASOS:
1. PCR
2. Desnaturalización parcial de doble cadena 50-65°C
3. Enfriamento lento para permiir la rehibridacion
4. Se forma moléculas heteroduplex y homoduplex
5. La doble cadena se unea a la columna hidrofóbica(fase estacionaria) con ayuda de ion intermediario
(TEAA)
6. Gradiente de un solvente orgánico (ACN) (fase móvil) se añade a la columa
7. Se aumenta la temperatura
8. Elimina el TEAA: elución del adn unido a la columna se detecta por absorción UV
Usos:

- Microbiología
- Tamiz de variantes
- Mapeo
- Clonación de genes de levadura, mosca
- Expresión de genes
 4. ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DESNATURALIZANTE
Es un tipo de electroforesis que permite la separación de fragmentos de ADN del mismo tamaño pero con
diferentes secuencias de nucleótidos. Para ello un gradiente lineal creciente de agentes químicos
desnaturalizantes del adn( mezcla de urea y formamida) se incorpora a lo largo de un gel de policilamida.
Durante la electroforesis, se mantiene una temperatura constante de 50-60°C y los fragmentos de AND de
doble cadena migran hasta el gel hasta encontrar una determinada concentración de urea y formamida a las
cuales las cadenas se separan localmente y desplazamiento de las moléculas.
Para asegurar las moléculas se detengan en su punto de desnaturalización se necesita una cola pli GC que
se incorpora al extremo 5´de uno de los cebadores. Esta cola esta formada 40-60 guaninas y citosinas y
proporciona a los fragmentos amplificados una elevada temperatura de desnaturalización que evita que las
moléculas de ADN se desnaturalizan por completo conseguir una resolución optima en el gel.
La electroforesis en el gel de gradiente desnaturalizante funcina aplicando una pequeña muestra de ADN a un
gel de electroforesis que contiene un agente desnaturalizante. Como componentes individuales, incluso los
pequeños 200-700pb.
  Permite separar fragmentos de ADN del mismo tamaño pero con diferente secuencia
de nucleótidos.
 Agentes químicos: mezcla de ure ay formamida.
Fragmentos de ADN

- Ricos en G y C: desnaturalización a altas concentraciones de urea y formamida. Migracion se

interrumpe lentamente: posiciones inferiores del gel
- Pobres en G y C: desnaturalización a bajas concentraciones de urea y formamida. Migracion se
interrumpe rápido: superiores del gel.
PASOS:
1. Amplificacion por PCR
2. Gradiente lineal creciente de agentes químicos desnaturalizantes (urea y formamida) se incorporan a
un gel de policralimida
3. Durante la electroforesis, se mantiene una temperatura de 50-65°C
4. Los fragments migran hasta encontrar determinada (desnaturalizante)
5. Las cadenas se separan y el desplazamiento se interrumple
Usos:

- Detección de mutaciones puntuales para: FQ, hipercolesterolemia, hemofilia, alzheimer.

- Mutaciones somaticas en genes asociados a oncogénesis.
- Estudios de comunidades microbianas
- Estudios de genética de poblaciones y evolución

5. TEST DE PROTEINA TRUNCA

Es un método solido para evaluar mutaciones de ADN que resultan en una proteína truncada in vitro. Una
mutación sin sentido da lugar a un codon de terminación prematura. Eso supone que la proteína resultante se
termine antes de lo esperado y pueda detectarse mediante un test de proteína trunca.
 Es un método de rastreo de mutaciones sin sentido o de cambio de fase de las cuales
provocan estructuras proteicas defectuosas, que no desempeñan adecuadamente su
función y pueden originar ciertas enfermedades.
Se basa ciertamente en el empleo de un análisis a nivel de ARN (en forma de DNAc o ADNgenomico), y a
nivel de proteína apartir de ADN genomico o ARNm estudiándose las proteínas resultantes de la traducción
de estos acidos nucleicos y desvelándose variantes proteicas truncadas, que es un fragmento de su
estructura causa la existencia de un codon de terminación de la traducción antes de lo debido.
Permite analizar regiones de ADN de 3.5kb en un solo análisis.
PASOS:
1. Aislamiento del dna
2. Amplificación por pcr
 3. Enasyo in vivo de transcripción y traducción
4. Electroforesis de policrilamida

Usos:

- Esclerosis tuberosa
- Distrofia muscular de duchene
- Ca de mama, ovario, brca1

6. SECUENCIACION DE SANGER
La secuenciación de ADN: es un proceso que determina la secuencia de bases de los nucleótidos de un
fragmento de ADN.
Se ocupa para determinar las secuencias de muchos fragmentos relativamente pequeños de ADN humano.
Los fragmentos se alinearon con base en porciones que se traslapaban para ensamblar la secuencia de
regiones mas grandes de ADN y al final cromosomas completos.
Se utiliza didesoxinucleotidos por PCR, si el 3 OH esta ausente, no se puede continuar la polimerización: se
detiene.
Para la secuencacion de sanger se requiere:

- Primers
- Adn molde
- Dntps (A,T;C,G)
- Adn polimerasa termoestable
- Ddntps marcados

PASOS:
1. Obtener el fragmento que se desea secuenciar (templado/molde)
2. Purificacion del templado
3. PCR de secuenciación
4. Purificacion de PCR de secuenciación con séphadex
5. Deshidratación de la muestra
6. Desnaturalización con formamida
7. Electroforesis de secuenciación
8. Análisis

Usos:

- Pequeñas regiones genómicas

- Validación de NGS
- Tipificación HLA
- Genotipificación de marcadores microsatélite
- Indentificacion de variantes causantes de enfermedad
 7. PIROSECUENCIACION
Es la primera alternativa al método de sanger convencional y se basa en la detección de pirofosfato durante la
síntesis de ADN. Cuenta con ventajas de precisión, flexibilidad, procesamiento en paralelo y fácil
automatización. Esta técnica permite ecuenciar de forma paralela y masiva muchos fragmentos de and a la
vez.
Fundamento: basado en el método enzimatico de secuenciación, aprovecha la liberación de pirofosfato
cuando un nucleótido se incorpora en la hebra de ADN en crecimiento, mediante bioluminiscencia.
Se requiere: adn polimerasa, ATP sulfurilasa, enzima luciferasa, dNTP, enzima apirasa.
PASOS:
1. Fragmentar ADN de doble cadena a secuenciar mediante un proceso conocido como nebulización
para asi marcar los extremos de los primers. Uno de ellos se adhiere a las microesferas y el otro se
 usara para comenzar la amplificación. Finalmente se separan los fragmentos de ADN de doble
cadena en forma monocatenaria.
2. Mediante la emulsion de aceite se generan microesferas, donde se unira a un unicofragmento de adn
monocatenario. Luego se añade la emulsion que contiene microarreglos (debe de tener
oligonucleótidos, dntps, polimerasa y adn molde)
3. Se amplifica x pcr
4. Se liberan las cuentas de la emulsion y se colocan en placas donde ocurrirá la secuenciación.
(primero se vierte la emlulsion en fase solida y después se añaden las enzimas sulforilasa y
luciferasa)
5. En cada celda sucede la pirosecuenciacion. Se lleva a termino cuando se añade uno de los 4
nucleotidos que se iluminara. Después se lava y se añade otro .. hasta completar la secuencia
6. Los resultados se comparan con el genoma.

8. PCR CUANTITATIVA DE FUSION DE ALTA RESOLUCION

Se basa en el estudio y comparación de curvas de fusión de las cadenas de adn, en que la doble cadena se
va a desnaturalizar con aumento de la temperatura dependiendo de la cantidad de C-G. el monitoreo de
cambio de fluorescencia al liberarse un tinte intercalante de ADN dúplex mientras se desnaturaliza. (se
añaden colorantes fluorescentes con el fin que se intercalen con el ADN).
Conforme la temperatura va aumentando, el ADN bicatenario se va desnaturalizado, de manera que la doble
cadena se separa y la fluorescencia va disminuyendo.
De esta forma se puede estudiar la presencia de SNPs, homo/heterocigoto en una muestra como marcas
epigeneticas, respecto a este ultimo se añade bisulfito. Las citocinas no metlaas las transforma en uracilos,
cambiando de esta forma la temperatura de desnaturalización y generando curvas de melting diferentes, por
lo que atraves del estuduo por comparación se detecta las bases de citosina metiladas.
PASOS:
1. Amplifica por pcr
2. Añaden los intercalantes (SYBRR green, SYTO, Chromofy)
3. Amplicon que resulta se calienta gradualmente en termocicladosr (55-95°)
4. Desnaturalización de doble hebra: disminución de la fluorescencia
5. Grafica de nivel de fluoresencia y temperatura (curva melting)

9. ENZIMAS DE RESTRICCION
Son una herramienta para ensayos de investigación clínica, desdela determinación de
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP) asi como en la construccion de
vectores con adn recombinante y clonación de secuencisa de ADN provenientes de humano, virus,
bacterias.

Son las nucleasas son capaces de cortar los enlaces fosfofodiester que unen los nucleótidos de una
cadena de acidos nucleicos. Las nucleasas se denominan endonucleasas si son capaces de cortar el
enlace fosfodiéster en nucleótidos lcalizados dentro dela cadena del acido nucleico y reciben el
nombre de exonucleasas si cortan los enlaces fosfodiéster de los nucleótidos en los extremos de
las cadenas.

Presentan actividad endonucleasa, cuando son de origen bacteriano y cortan los enlaces
fosfodiéster del adn en unas secuencia especifica denominada secuencia diana. El empleo de las
enzimas de restricción y otras enzimas que modifican acidos nucleicos, como la ligasa, permitió
desarrollar la metodología del adn recombinante.

Estas endonucleasas se denominan enzimas de estriccionxq restringen la permanencia de un adn

exgeno en la celula bacteriana que produce dicha enzima.

CLASIFICACION:

TIPO I: reconocen una secuencia especifica de nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble
cadena en cualquier secuencia del adn y a una distancia de 1000pb del sitio de corte, además
tienen la función de metilar su propio genoma. Necesitan ATP para moversea lo largo de la
molecula de ADN desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte.

TIPO II: reconocen secuencias especificas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en el mismo
sitio de reconocimiento. Tienen actividad de restricción no de metilacion y son utilizadas en
ingeniería genética ya que cortan el ADN en secuencias especificas. Requiere como mg+ como
cofacrtor y no requieren adn. Las secuencias de reconocmiento son palindromicas: que se leen
igual las 2 cadenas.

TIPO III: reconocen una secuencia especifica y cortan el adn de doble cadena fuera de la secuencia
diana. Tienen actividad de metilasa y requieren ATP para desplazarse a lo largo de la molecula del
aDN.

TIPOS DE CORTE:

- COHESIVAS: también llamado pegajosos que se generan xq la enzima corta en cada

cadena de adn entre nucleótidos liocalziados en posiciones diferentes respecto al eje de
simetría de la secuencia diana. Estos cortes generan extremos monocatenarios en un
segmento de 3-5pb por lo que la fracción le falta a la cadena complementaria facilita su
interacción con otro fragmento en monocadena.

- ISOESQUIZOMEROS: son obtenidos de una especie bacteriana pero reconoce la misma

secuencia diana de ADN y cortan entre diferentes nucleótidos de dicha secuencia.

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION

- Pureza del adn

- Contaminantes como detergentes y estabilizadores
- Grado de metilacion del adn

10. FRAGMENTOS DE LONGITUD POLIMORFICA (PCR RFLP)

Los fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLPS) son un tipo de polimorfismo que resulta de la
variación en la secuenciación de ADN reconocida por enzimas de restricción. (por lo general se necesita
electroforesis en gel para verlos)
Reconocen secuencias específicas de nucleótidos de ADN de diferentes longitudes, ya que los polimorfismos
específicos de cada alelo modificara el reconocimiento por parte de la enzima y su capacidad de corte.
 Diferencia de secuencias homólogos de ADN que pueden detectarse por la presencia
de fragmentos de diferente tamaño. Despues x digestion por endonucleasas de
restricción.

PASOS:
1. Digestion de ADN genomico total con 2 enzimas de restricción, una de corte raro y otra con corte
frecuente
2. Unión de secuencias especificas (adaptadores) a los bordes de los fragmentos generados por
restricción (se generan los extremos con una secuencia conocida que permitirá que el fragmento sea
amplificado x PCR)
3. Dos reacciones de PCR, la primera conocida como amplificación preselectiva, se lleva acabo con
inicadores que corresponden a la secuencia especifica del adaptador que se unió a los bordes
diferidos mas un nucleótidos extra (permite discriminar los fragment9s). se hace una segunda pcr
conocida como amplificación selectiva, uno de los iniciadores tiene el fluoroforo y detecta el
fragmento.
DX MOLECULAR
EXPANSIÓN DE REPETIDOS
Existen enfermededades asociadas a secuencias repetitivas ya sea minisatelites o microsatélites. Se han
descrito enfermedades asociadas a minisatelies.
 Tripletes repetidos: en px no afectados, los microsatélites formados por trinucleotidos o
tripletes repetidos son altamente polimórficos en el numer de repeticiones, siendo
estables de generación en generación. 4 tipos de tripletes de repetidos: CGG, CAG,
CTG, GAA.
En personas afectadas el microsatelite contiene un número de tripletes repetidos que ha superado el rango
normal. En este microsatelite durante la división celular el triplete se vuelve inestable en el número de
repeticiones de una generación a otra, tanto en células somáticas como sexuales. Estos microsatélites se
encuentran tanto en cromosomas autosómicos como en el cromosoma X y son de localización variable en el
gen, encontrándose en las regiones no traducibles 5-UTR y 3-UTR, regiones promotoras, regiones exónicas e
intrónicas (Figura II). Algunos tripletes repetidos están interrumpidos internamente por nucleótidos llamados
interrupciones, estas son diferentes a la secuencia repetida y en estudios realizados en este tipo de
interrupciones se ha encontrado que estarían involucradas en la regulación de la producción del transcripto
(23). Muchas de las enfermedades por tripletes repetidos tienden a incrementarlos de tamaño de generación
en generación con fenotipos más severos de la enfermedad y menor edad de inicio, a este fenómeno se le
conoce como anticipación génica.
De acuerdo al tamaño de la expansión del triplete las mutaciones por tripletes repetidos se clasifican en: a)
Las mutaciones completas se caracterizan por presentar muchas unidades de repeticiones. El término de
mutación completa se refiere aquellos tipos de mutaciones donde la manifestación clínica de la enfermedad
es severa, motivo por el cual el punto de corte donde empieza una mutación completa varía para cada
enfermedad de este tipo. Estas mutaciones generan trastornos multisistémicos, ya que involucran la
disfunción y/o degeneración de diferentes tejidos b) Las mutaciones intermedias o premutaciones son
aquellas donde la cantidad de la unidad repetitiva es inferior a la cantidad existente en una mutación
completa, el punto de corte para empezar a clasificarlas varía para cada enfermedad de este tipo: estas
mutaciones se caracterizan por ser clínicamente silentes pero con una marcada tendencia a expandirse a
mutaciones completas durante la transmisión por una línea germinal (14).Como dato adicional se sabe que
las mutaciones de tripletes repetidos.
de regiones no codificantes tienen un mayor número de repeticiones que aquellas ubicadas en regiones
codificantes (24). De acuerdo a la función del triplete las mutaciones por tripletes repetidos se clasifican en: a)
Mutaciones que generan ausencia de traducción del DNA: Este tipo de mutación genera la ausencia,
disminución o aumento de la cantidad o tamaño del transcripto, más no llegan a la etapa de traducción y por
ende no forman proteína. Tenemos mutaciones completas ubicadas en las regiones no traducibles, intrones y
promotores. Como ejemplo, tenemos el síndrome X frágil, en el que la mutación completa del triplete CGG,
ubicada en la región no traducible del gen, produce metilación de la región promotora del gen FMR1 y su
consecuente inactivación; la ataxia tipo 12 (SCA12), donde la expansión del triplete CAG está ubicada en la
región promotora (24) y finalmente, la ataxia de Friedreich en la que la expansión del triplete ocurre en la
región intrónica, que adquiere una estructura de DNA ‘pegajoso’ que interfiere con la transcripción del gen
frataxina (14). También tenemos mutaciones intermedias, como en el síndrome de temblor/ataxia (FXTAS)
donde hay un aumento de la cantidad del transcripto del gen FMR1(25), sin encontrarse una traducción
completa. Una de las características a resaltar en este tipo de mutaciones es que en aquellas ubicadas en
cromosomas autosómicos, se puede dar el fenómeno de haploinsuficiencia, fenómeno en el cual la proteína
producida por una sola copia de un gen normal no es suficiente para garantizar una función normal en la
célula.
b) Mutaciones que generan ganancia de función: Causadas por mutaciones completas e intermedias, debidas
a expansiones de tripletes localizadas en las regiones codificantes donde se transcriben y posteriormente se
traducen a un segmento expandido de poliaminoácido. Existe evidencia de que estas secuencias
aminoacídicas adoptan una conformación diferente, que en algunas vías contribuyen a su toxicidad neuronal;
como ejemplo tenemos la enfermedad de Huntington y muchas de las ataxias espinocerebelosas (26).
ESTRUCTURAS ALTERNATIVAS DE LOS MICROSATÉLITES INESTABLES Estudios realizados por Sinden
y Wells en el año 2002, sugieren que la expansión masiva de los tripletes puede originar un truncamiento de
la replicación del DNA debido a un bloqueo físico. El bloqueo físico de la replicación puede ser por una
estructura conformacional alternativa del DNA, formada a partir de las repeticiones del triplete (27). Se ha
observado que los tripletes repetidos generan un bloqueo en la replicación en E. coli (28). Se describen
estructuras alternativas al DNA convencional como el DNA flexible, DNA paralelo, DNA triplex, DNA
cuádruplex, hairpins, estructuras cruciformes, lefthanded Z DNA y DNA de cadena deslizada (29). No toda la
secuencia de DNA forma estructuras alternativas, se requiere de elementos de simetría para su formación,
entre las cuales destacan:
a) Repeticiones directas: Son dos secuencias nucleotídica idénticas (o casi idénticas), a veces
separados por una secuencia de DNA no repetitivo. Por ejemplo, 3'-TAGT. . . TAGT -5', 5'-ATCA...
ATCA- 3' b) Repeticiones inversas: Es una secuencia de nucleótidos cuya secuencia complementaria
inversa se encuentra dentro de la misma cadena corriente abajo y que tiene la capacidad de auto
aparearse. Por ejemplo, 5'- GACTGC... GCAGTC - 3'. c) Cuasi palindrómicas: A diferencia de un
DNA palindrómico donde ambas secuencias se leen igual por ambas direcciones, en la secuencia
cuasi palindrómica ambas secuencias no se leen igual en ambas direcciones, por alguna diferencia
de algunos pares de bases, que dan lugar a pequeños bucles. Estas estructuras tienen funciones
similares a los palíndromos perfectos en el proceso de mutación y expresión de genes. d) DNA
mirror (repeticiones en espejo): Es un segmento de secuencia delimitado por una base, que genera
un centro de simetría en una sola cadena y donde los nucleótidos terminales son idénticos. Por
ejemplo: la secuencia TACACG es la imagen especular de GCACAT (30). Los tripletes repetidos
poseen motivos de secuencia y elementos de simetría que dan mayor flexibilidad a la doble hélice y
promueven la formación de varias estructuras alternativas de DNA (Tabla A). Entre ellas tenemos
hairpins de cadena simple, triple y cuádruple, y deslizamiento de la cadena de DNA (Ver anexo 1).
Estas estructuras se han podido visualizar y generan un patrón de migración característico en geles
de poliacrilamida, atribuido al aumento de la flexibilidad de (CAG) n · (CTG) n y (CGG) n · (CCG) n
(31).

METILACIONES NUCLEOTÍDICAS
Se estima que el 41 % del genoma está formado por citosinas y guaninas (CG), ubicadas principalmente en
las regiones promotoras de algunos genes y conocidas como islas de CpG; algunas de éstas están
relacionadas con el silenciamiento génico por metilación (32). Las islas CpG conforman aproximadamente un
40% de promotores de los genes de mamíferos y son regiones donde existe una gran concentración de pares
de citosina y guanina enlazados por fosfato; la "p" en CpG.

Representa que están enlazados por un fosfato. En la mayoría de casos, los genes que presentan en sus
islas CpG los dinucleótidos CG desmetilados, se expresan. Esta observación sugiere que la metilación de los
sitios CpG en los promotores de los genes puede inhibir la expresión del mismo gen (33). Existen islas CpG
que se
encuentran en los promotores de los genes de mantenimiento de la célula (genes housekeeping) que no se
encuentran metilados, ya que existe un factor protector que evita esta metilación, lo que origina que estos
genes tengan un expresión constante (34). Se conoce dos tipos de metilación:

a) El primero, causado por la expansión nucleotídica de tripletes que ocurre en la regiones promotoras que
contienen citosinas y guaninas, ocasionando como primer efecto que las islas CpG que contienen estas
regiones promotoras, se metilen. Además, ocurre una metilación de las regiones repetitivas de citosinas a lo
largo de la expansión trinucleotidica. Estos fenómenos se presentan en diversos trastornos como el
Síndrome del X Frágil (FraxA, FraxE, FraxF) y síndrome de Jacobsen (FRA11B) (35). Además, hay evidencia
que sugiere que existe metilación de regiones no promotoras en las expansiones nucleotidicas para las
mutaciones de Distrofia Miotónica tipo I y Ataxias Espinocerebelosas.
b) El segundo se basa en la metilación de la isla CpG sin que exista un cambio en la secuencia primaria
(Epimutación). Este fenómeno se ha observado en la metilación aberrante de genes supresores de tumores
(36).
En vertebrados, la metilación de citosina parece constituir un mecanismo importante para distinguir genes
activos de los que no lo son; por ejemplo la inactivación cromosómica de los mamíferos es un proceso que
ocurre en uno de los dos cromosoma X que se encuentra presente en la células somáticas de sexo. femenino.
La función biológica de esta inactivación es la compensación de dosis
génica que existe entre los cromosomas XX de una célula femenina y los cromosomas XY de una célula
masculina, lo que hace posible que tanto la célula masculina como femenina tengan la misma cantidad de
proteínas codificadas por sus cromosomas X (37) .

 SX DE HUNTINGTON
1. PCR: amplifica el repetido CAG, el producto se resuleve en geles de acrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes.
2. PCR modificada y secuenciación de long fragmentos: la desventaja es que no delimita el numero de
repetidos exacto
3. Secuenciación de sanger: método ideal, pero se debe usar polimerasa para regiones ricas de CG

 X FRAGIL
1. PCR (solo cuenta el numero de repetidos), Oligonucleotidos que hibriden a la repeticon CGG (RT
PCR)
2. PCR de metilacion: técnica de modificación del dna por bisulfito
3. Souther blot: reconoce premutaciones, mutaciones completas, mosaicos y el estado de metilacion de
los repeticod CGG.

MITOCONDRIALES
El dx de estos se hace:

- Sanger: secuencia especifica de un gen

- Panel_ grupo de genes de cierto grupo de enfermedades, donde se identifica 10-20 variantes
- Genoma/exoma: analizando mas variantes codificantes y no codificantes
- Secuenciación de ARN: cuales se expresan

PERO PARA EL DX:

  Se aisla dna mitocondrial de musculo esqueñetico (biseps, cuádriceps) el método de
fenol con cloroformo, se realiza PCR FLP con fragmentos de restricción de longitud,
para identificar una mutacion puntual
 Secuenciación de sanger xq se ve el electroferograma

CIENCIAS GENOMICAS ( FARMACOGENOMICA)

FARMACOGENOMICA:
Es una rama de la farmacología que se encarga de utilizar los datos de secuencias de aminoácidos y DNa
para guiar el desarrollo y prueba de fármacos. Estudio del papel de varios componentes del genoma en la
respuesta a un fármaco.
GENERALIDADES:

- 50% subdosificados o sobredosificados

- Multifactorial- interacción entre factores ambientales y características geneticas del sujeto.

FARMACOCINETICA: ¿Cómo se mueve el medicamento en el cuerpo?- Absorcion, distribución, metabolismo

y eliminación.
FARMACODINAMIA: ¿Cómo es la respuesta terapéutica en el cuerpo?. Afinidad y actividad del fármaco en
su sitio de acción.
FARMACOGENETICA: subcategoria de la farmacogenómica. Papel de la variación genética en la respuesta a
un fármaco: polimorifsmo
 Influencia de factores genéticos en la respuesta terapéutica
Son 4 categorias:

- Efectos sobre la farmacocinética

- Efectos sobre la farmacodinamia
- Efectos sobre reacciones idiosincrásicas
- Efectos sobre la patogenia y/o gravedad de la enfermedad y la respuesta a terapias especificas

1.- ALTERACION DELA FARMACOCINETICA: ENZIMAS METABOLIZADORAS

- metabolismo de fase 1 (modificación): adicion de grupos polares a moléculas lipofílicas. Superfamilia
citocromo p450.
- metabolismo de fase 2( conjugación): formación sustancias no toxicas fácilmente excretable. Tiopurina5
metil transferasa

1.1 ALTERACION DEL METABOLISMO:

FASE I: CYP450
Es una superfamilia de enzimas oxidativas, 58 genes CYP con un gran numero de polimorfismos.
Tiene 3 fenotipos metabólicos:
 - Ultrarapido
- Extensos
- Lentos

Los responsables un 70% del metabolismo de la fase 1: CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4.
1.2 ALTERACION EN EL METABOLISMO
FASE 2:
- TPMT: hay >24 variantes, debido a la disminución o inactivación.
- NAT2: N- acetiltransferasa 2 (hidralazina, procainamida, isoniazida). Polimorfismo 50% de
caucásicos y 90% afroamericanos. Hay 2 fenotipos:
Acetiladores rapidos: concentraciones dosminuidas
Acetiladores lentos: concentraciones altas
2.ALTERACION DE LA FARMACOCINETICA: TRANSPORTE DE FARMACOS
Difererencias hereditarias en proteínas de memebrana de transporte de fármacos
 ABCB1 / MDR1: codifica para la p- glicoproteina. Aumenta la salida dependiente de
ATP (bilirrubina, antirretrovirales)
 SLCOB1: codifica para polipetido transportador de aniones organicos 1B1. Media la
captación de sustratos de la sangre sinusoidal para excreción biral. (metrotexate)
3.ALTERACION DE LA FARMACODINAMIA:
Diferencias interindividuales en la respuesta terapéutica a pesar de la presencia de concentraciones
adecuadas del fármaco en su sitio objetivo.
 ALOX5: codifica para 5-lipoxigenasa. Silvestre: promotor con VTNRs con elementos 5
repetidos. Inhibidores de 5 lipoxigensasa: variantes en VNTRs del promotor del gen:
disminuye la traducción.
 EGFR: codifica para receptor de factor de crecimiento epidérmico ( geftinib: mutaciones
en el dna tumoral que afecta el sitio de unión a ATP del dominio torison quinasa)
 VKORC1: codifica para complejo de vitamina k epocido reductasa: conversión de
vitamia K (Warfarina: polimorfismos 25% de la variabilidad fenotípica en la dosificación).
4.EFECTOS EN REACCIONES IDIOSINCRATICAS
Reacción idiosincrásica a un fármaco que puede variar según factores genéticos

- HLA B 5701: abacavir

- TCL1A-, inhibidores de la aromatasa
- HLA B 5801: alopurinl
- HLA A 3101/ B 1502: CARBAMAZEPINA

5.PATOGENESIS DE LA ENFERMEDAD:
Las variantes geneticas que influyen en la patogénesis de la enfermedad, su gravedad subyacente y la
respuesta a terapias especificas.
 Fibrosis quística:
- Ivacator: clase III
 - Lumacaftor, tezacftor, elxacaftor: clase II

USO DE BIOMARCADORES GENOMICOS PARA GUIA TERAPEUTICA:

- PHARMGKB
- CPIC

AJUSTE DE DOSIS: es la exposición al fármaco mas uniforme. Metabolizadores rapidos y ultra

rapidos( expo baja al fármaco), metabolizadores medios(expo estándar), met lentos (expo alta al fármaco).

NUTRIGENOMICA:
Estudio de los efectos de los alimentos y los componentes de los alimentos en la expresión génica y como las
variantes génicas afectan el entorno nutricional. Interaccion entre los nutrientes y otros bioractivos dietéticos
con el genoma a nivel molecular, para comprender como los nutrientes específicos o los regimes dietéticos
pueden afectar la salud humana.
ENFOQUES:
Estudio de las modificaciones de vitaminas y bioactivos de los alimentos en la transcripción y traducción edl
DNA.

- Patrones de expresión génica: transcriptoma

- Actividad de la cromatina: epigenoma
- Patrones de expresión de proteínas, incluidas modificaciones postraduccionales: proteoma

NUTRUGENETICA: ciencia que analiza los afectos de ciertas variaciones alélicas de genes asociados al
metabolismo de la nutrición sobre la salud humana.
NUTRIGENOMICA: ciencia genómica moderna qu estudia el impacto de las moléculas de los alimentos en la
epxresion génica.
 ASOCIACION DE NUTRICION: DNA
- Modificación de la expresión génica
- Rara vez modifica secuencia
- Cromatina y DNA funciona como sensores metabólicos a nilve celular
 VIAS METABOLICAS RELACIONADAS
- Unión de miro y macromoléculas a sus sensores
- 48 receptores intranuecleares / formación de complejos heterodímeros
 INTERFERENCIA CON LOS NUTRIENTES DEL GENOMA:
- Acción biológica de los nutrientes: eliminación de radicales, moléculas de señalización, componentes
básicos, fuentes de energía.
- Composición génica determina la respuesta al alimento: 90% de la composicon geninca no ha
cambiado desde la edad de piedra.
 INTERACCIONES DE LA DIETA CON VARIANTES DEL GENOMA:
- PKU: ausencia de fenilalanina hidroxilasa
- Intolerancia a la lactosa: lactasa florizina hidrolasa.
EPIGENOMICA
Perfiles y análisis de marcas epigeneticas en todo el genoma. No hay modificaciones en la secuencia del
ADN. Explora el impacto de los factores ambientales en la expresión génica.
Generalidades:

- Antes de HPG se esperaba que el humano tuviera >100 000 genes, genes identificados, 20 338:
regulación clave para ser humanos: 2 genomas + cientos de epigenoma,
- Es tejido y depende de las señales externas
 Regulación a corto plazo: respuesta a fluctuaciones en el medio ambiente
 Largo a corto plazo: de la identidad especifica permanente del tejido y son estables
atraves de la mitoss. Puede ser transgeneracional.
Cambios en epigenoma:

 Adaptación al medio ambiente

 Presión de selección natural en los habitas locales + deriva génica aleatoria: adaptaciones geneticas
especificas de la población durante los últimos 50 000 años de migración.
 GWAS: 88% de variantes asociadas a rasgos están fuera de regiones codificantes.
OBJETIVOS:

- Identificación y estudio funcional de elementos reguladores en el genoma

- Comprender de la dinámica de la regulación de la expresión génica en varios contextos fisiológicos
- Comprender la heterogeneidad celula-celula y la especificidad celular
- Caracterizar el desarrollo, herencia de la expresión génica y determinación del linaje.
- Descubrimientos de fármacos o biomarcadores para condiciones humanas.

MECANISMOS:

- Red de sistemas que interactúan:

-accesibilidad a la cromatina
-modificaciones de histonas
-proteinas de unión al ADN
-metilacion del ADN
-promotores y potenciadores
BASES EN EPIGENOMICA:
ENCODE: proyecto sistematico para catalogar los elemtnos funcionales del genoma humano, la mayoría
funcionan en la regulación génica.
FUNDAMENTOS Y APLICACIONES DE TECNICAS
GENOMICAS.