REPLICACIÓN DEL ADN

Posibles modelos de replicación

2
Replicación del DNA
 Replicación del DNA
•Semiconservativa: una cadena sirve de molde para una nueva
cadena
•El experimento de M. Meselson y F. Stahl (1958)
demuestra que la replicación es semiconservativa

Mathew Meselson Frank Stahl

4
 Replicación del DNA
•Origen de replicación:
•Secuencia reconocida (Ori C en E. coli) por proteínas
iniciadoras. Varios orígenes en eucariotas
•La replicación es bidireccional

Horquilla
replicación
 Replicación del DNA
•Enzimas que sintetizan (replican) el DNA
•E. coli
•DNA polimerasa I (rellena huecos y repara)
•DNA polimerasa II y III (función principal en la síntesis)
•Añade bases en ambas cadenas en la dirección 5’
 3’
•Requiere un 3’ OH final
•Eucariotas
•5 polimerasas
• y  principal en replicación
•,  y  exonucleasas
•Corrección de pruebas: actividad 3’  5’ exonucleotídica.
Sustituye bases mal emparejadas (10-5) por correctas (10-7);
mecanismos de reparación adicionales la reducen hasta 10-10

6
 Replicación del DNA
•Replicación: continua (cadena adelantada, cebador sólo
inicio) y discontinua (cadena retrasada)

•Discontinua
•Cebador (pequeño RNA 2-60 nucleótidos añadido
por enzima primasa o RNA pol que provee 3’ OH.
•Fragmento de Okazaki por DNA pol III (1500 pb en
procariotas y 150 en eucariotas)
•Pol I elimina cebador 3’ -> 5’ y llena huecos (gap)
•Ligación (DNA ligasa, enlace fosfodiéster)

7
 Replicación del DNA
El replisoma: complejo enzimático de la
replicación que coordina la síntesis de las dos
cadenas, maquinaria molecular
•Dímero de la DNA pol III (núcleos catalíticos)
•Primosoma: formado por dos enzimas
•Primasa
•Helicasa (desenrolla el DNA)
•Proteína de unión a cadena sencilla, ssbp
(estabiliza el DNA de cadena sencilla)
•Topoisomerasas tipo I (rotura una cadena) y II
(rotura de dos cadenas) junto a DNA ligasa ->
Relajación del superenrollamiento

8
 1. Iniciación
La replicación del cromosoma de E. coli se inicia en una
secuencia de origen denominada oriC. Este origen
consta de 245 pb y contiene secuencias muy
conservadas entre los orígenes de replicación
bacterianos. Las secuencias clave son dos series de
repeticiones cortas: una de las series consta de tres
repeticiones de una secuencia de 13 pb, con una
cantidad abundante de A y T (puede desnaturalizarse
con facilidad) y la otra serie está formada por cuatro
repeticiones de una secuencia de 9 pb. (Figura. 10)
.
La iniciación es la única fase de la replicación que está regulada, de modo que sólo tenga lugar
una vez cada ciclo celular.
Incluso con el molde de ADN expuesto, no se puede sintetizar un nuevo ADN a menos que se
construya un cebador. Recordemos que todas las ADNp conocidas necesitan un cebador con un
grupo OH libre en el extremo 3´ para sintetizar ADN en dirección 5´  3´. Kornberg descubrió
que durante la replicación había sobre el ADN pequeñas cantidades de ARN. Este ARN, de entre
10 y 60 nucleótidos, es precisamente el que hace de cebador y es sintetizado por la enzima
primasa (proteína DnaG, que es una ARN polimerasa, las cuales, como veremos después, no
necesitan cebador) y sobre el que la ADNp III añade desoxirribonucleótidos en la fase de
elongación.
 Iniciación

iniciador
Síntesis de primers
de ARN
Iniciación de la
Unión de replicación
iniciador

Horquillas se mueven en
dirección opuesta

Formación de
dos hebras de
replicación

ADN circulares ADN lineales

(Procariotas) (Eucariotas)
Origen de replicación (oriC) Varios replicones
2. Elongación

La fase de elongación consiste en dos operaciones distintas pero

relacionadas: la síntesis de la hebra conductora y la síntesis de la hebra
rezagada.
La síntesis de la hebra conductora empieza con la síntesis del cebador de
ARN por la primasa en el origen de replicación. A continuación la ADNp
III adiciona desoxirribonucleótidos a este cebador. Una vez iniciada, la
síntesis de la hebra conductora transcurre de manera continua, al mismo
ritmo que el desenrollamiento del ADN en la horquilla de replicación.
La síntesis de la hebra rezagada se realiza a trozos. Primero, un cebador
de ARN es sintetizado por la primasa y, como en la síntesis de la hebra
conductora, la ADNp III se une al cebador de ARN y añade
desoxirribonucleótidos. A este nivel, la síntesis de los fragmentos de
Okazaki parece sencilla, pero es en realidad muy compleja. Esta
complejidad reside en la coordinación de la síntesis de las hebras
conductora y rezagada, puesto que ambas hebras son producidas por un
único dímero asimétrico de ADNp III. Para ello la hebra molde de la
cadena rezagada forma un bucle para aproximar los dos puntos de
polimerización y conseguir que las dos cadenas en síntesis tengan la
misma polaridad.
DNA polimerasa III (replicasa procariota)
La holoenzima es un complejo de 900 kD con varias subunidades:

Coro catalítico
Incluye a la subunidad  responsable de la actividad sintética.
La subunidad  responsable de la actividad de exonucleasa 3'  5'.
La subunidad q estabiliza la actividad de  y participa en el ensamblaje del coro.

Componente de procesividad (Subunidad )

Cargador del Componente de procesividad (Clamp loader, Subunidad ).

Incluye a la subunidad ,
La subunidad ,
La subunidad 1,
La subunidad c,
La subunidad y,

Componente dimerizante (Subunidad t, responsable

de la dimerización de coros).
DNA polimerasa III
DNA polimerasa en la horquilla de replicación

Tres componentes esenciales en el replisoma de la figura:

1.- Helicasa (DnaB)
2.- Primasa (DnaG)
3.- Dímero de DNA polimerasa III

Helicasa avanza por delante de la horquilla de replicación

agarrada de una cadena de ssDNA abriendo el dúplex de
DNA localizado por delante de ella.

Girasa para aliviar super-embobinamiento por delante de

helicasa (no mostrada en esta figura).

La Helicasa “jala” a dímero de DNA polimerasa III en sentido

5'  3'.

En el sitio de origen, la primasa coloca el oligonucleótido

cebador sobre referencia líder, conforme avanza la horquilla
de replicación la DNA polimerasa de la cadena líder la
extiende sin problemas.
 “Proof-reading”
DNA polimerasa comete un error cada 108 – 1010 bases

Además de participar en la elongación, desempeñan una función

correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les
confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de
éste.
3. Terminación

Finalmente, las dos horquillas de replicación del cromosoma circular de

E. coli se encuentran en una región terminal que contiene múltiples
copias de una secuencia de 20 pb denominada Ter (por terminal). Las
secuencias Ter actúan en el cromosoma como una especie de trampa
donde una horquilla de replicación puede entrar pero no salir (Figura 16).
Las secuencias Ter son lugares de unión para una proteína denominada
Tus (por sustancia de utilización del terminal en inglés). El complejo Ter-
Tus puede detener la replicación desde una sola dirección. Sólo actúa un
complejo Ter-Tus por ciclo de replicación. Cuando una horquilla de
replicación topa con un complejo Ter-Tus se detiene; la otra horquilla se
detiene cuando encuentra a la primera ya detenida. Los pocos
centenares de pares de bases finales entre estos grandes complejos
proteicos son replicados a continuación mediante un mecanismo aún
desconocido. El resultado son dos cromosomas circulares ligados en el
espacio. Los círculos de ADN unidos de este modo se denominan
concatenados; su separación requiere, en E. coli, una topoisomerasa. Los
cromosomas separados son segregados en las células hijas en la división
celular.
 Replicón eucariota
En los eucariotas la replicación del DNA se restringe a la fase S del ciclo celular.

Velocidad de las horquillas de replicación procariotas: 800 b/seg (50,000 b/min).

Velocidad de las eucariotas es de 30 b/seg (2000 b/min).

3x109 bases/2000 = 1'500,000 minutos = 25,000 horas = 1,041 días = 2.8 años

Homo sapiens utiliza de 30,000 - 90,000 replicones lo que debería permitir lograr la
replicación total en menos de 45 minutos!

En realidad, solamente el 15% de los replicones están encendidos a la vez...con lo

cual la fase S ocupa un poco más de 6 horas (para disminuir entropia).

Existen entre 100 y 300 focos replicativos en los eucariotas, cada foco posee >300
horquillas de replicación.
Los replicones procariotas son grandes (entre 4 y 10 millones de bp).

Los eucariotas son más pequeños y variables (promedio de 40,000, van desde 4000 hasta
100,000 bp).

A diferencia de los replicones circulares procariotas los replicones eucariotas no tienen

secuencias ter, la DNA polimerasa simplemente extiende la cadena hasta toparse con una
DNA pol en la dirección opuesta, tras lo cual se desprende...

...o se “cae” del cromosoma una vez ha alcanzado su extremo terminal.

 OTROS SISTEMAS DE REPLICACIÓN
Plásmidos bacterianos

• Tamaño de 1 a 400Kb
• Cantidad variable de copias en una célula
Auto replicables (Replicón)
• Origen de replicación propio Cuando se integran al “Cromosoma bacteriano”: Episoma
• Pueden movilizarse a otros genomas
• Puede integrarse al cromosoma bacteriano
Las características portadas por los plásmidos son:
Resistencia a antibióticos, iones metálicos, y UV.
Degradación de productos del petróleo
FACTORES DE VIRULENCIA
- Toxinas: E coli enteropatogénica
- Factores de adherencia: pili en E coli
- Adhesinas
- Hemolisinas
- Bacteriocinas
- Pigmentos
- Coagulasa
Control del metabolismo de lactosa, rafinosa, citrato,
galactosa, xilosa.
Fijación del nitrógeno.
PUEDEN TRANSFERIRSE GENES ENTRE BACTERIAS

Más frecuencia (10-7) de la esperable

Bacterias por retromutación
recombinantes

Lederberg y Tatum (1946)

LA TRANSFERENCIA REQUIERE CONTACTO FÍSICO
EL FACTOR F
Genoma E. coli:
~ 4700 Kb
EL FACTOR F

F+ F- F+ F+

~ 2’

F-

F+
CONJUGACIÓN

Pero así no se transfiere

DNA genómico
de la bacteria
EFECTOS DE LA INTEGRACIÓN

Cepas Hfr: células con F integrado

Las células Hfr tienen pili pero ahora

transfieren DNA genómico: son las
responsables de los resultados de
Ledeberg y Tatum (1946)