ESCUELA PROFESIONAL DE

INGENIERÍA DE ALIMENTOS
ANALISIS DE PROTEINAS
EN ALIMENTOS

CURSO: ANALISIS DE ALIMENTOS

DOCENTE: Ing. Ana Celina Lancho Ruiz

SEMESTRE
30 de noviembre del 2020 al 07 de diciembre del 2020 ACADÉMICO
2020B
PROTEINAS Y AMINOACIDOS

Ing. Ana Celina Lancho Ruiz

 RESUMEN DEL CURSO DE ANÁLISIS DE
ALIMENTOS
El contenido de la asignatura, comprende:

a. Introducción de Análisis Físico químico. Análisis por Instrumentación.

Estudio Métodos Espectroscópicos y No Espectroscópicos. Muestreo
para analizar alimentos. Validación Analítica en laboratorio para análisis
fisicoquímicos de alimentos.

b. Métodos de separación y extracción. Análisis Cromatográfico en

alimentos. Estudio de Vitaminas, Pigmentos y Colorantes. Análisis de
lípidos y su composición en alimentos.

c. Análisis de Humedad. Análisis de cenizas y de bioinorgánicos en

alimentos.

d. Determinación y análisis de proteínas, carbohidratos digeribles y fibra

en muestras de alimentos. Extracción y purificación de enzimas de
alimentos.
 PROTEINAS: DEFINICIONES

• Las proteínas son las macromoléculas biológicas más abundantes

estan presentes en todas las células y en todas las partes de las
mismas.
• El nombre proteína proviene de la palabra griega πρώτα ("prota"),
que significa "lo primero“.
• Son los instrumentos moléculares mediante los que se expresa la
información genética.
• Estan formadas por macropolímeros de aminoácidos, o
macropolipéptidos. Actúan como enzimas, hormonas y estructuras
contráctiles que atribuyen a los organismos sus propias
características.
• La proteína constituye un nutriente indispensable por sus funciones
de regeneración tisular, compensando las células destruidas con la
actividad metabólica normal.
 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

✓Analizar el contenido de proteínas

✓Métodos de Kjeldahl, Dumas, Biuret, y
otros

✓Analizar la calidad de proteínas

✓Amino grama
✓Valor biológico
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL
 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
METODO KJELDAHL

%Nitrógeno = mL HCl x N HCl x MiliEqNitrogeno x 100

Peso de Muestra(g)
%Proteína = Factor %N
Factor = 6.25
 PROTEINAS: VALOR BIOLOGICO

• Es la medida de la absorción y sintesis en el cuerpo de la proteína

procedente de la ingesta de alimentos. Las proteínas son la mayor
fuente de nitrógeno en el cuerpo.

• La metabolización de las proteínas forma parte de un equilibrio, el

cuerpo absorbe lo que necesita y el resto lo excreta.

• El valor biológico de una proteína es la fracción de nitrógeno

absorbido que es retenido por el organismo y esto representa la
capacidad máxima de utilización de una proteína.

• Una proteína tiene mayor valor biológico, o es de alta calidad,

cuando tiene mayor capacidad de brindar nitrógeno al organismo.
 PROTEINAS: VALOR BIOLOGICO

o No existe una forma directa de medir el valor biológico de una

proteína. Para una determinación precisa del valor biológico de una
proteína, es necesario mantener bajo control las variables que
afectan al metabolismo de las proteínas.
o El organismo a testear debe consumir la proteína o la mezcla de
proteínas a analizar (la dieta-test).
o La dieta-text no debe contener otras fuentes de nitrógeno.
o La dieta-test debe evitar que la proteína sea una fuente primaria de
energía.
o Las condiciones de prueba requieren que la dieta-test se
mantengan bajo estricto control al menos durante una semana. El
ayuno previo al test ayuda a la consistencia de los datos tomados
entre los diferentes sujetos.
 PROTEINAS: VALOR BIOLOGICO

El valor biológico se determina según esta FÓRMULA.

BV = ( Nr / Na ) * 100
Donde se tiene que:

Na = es el nitrógeno absorbido en las proteínas procedentes de la dieta-test

Nr = es el nitrógeno incorporado al cuerpo

• Como, sin embargo, la medida directa de Nr es prácticamente

imposible.
• Se realizan medidas de otras magnitudes de forma indirecta
mediante el análisis cuantitativo de nitrógeno excretado en la orina.
 PROTEINAS: VALOR BIOLOGICO

El nitrógeno excretado en las heces fecales se tiene también en

cuenta. En todos los casos la proteína excretada no ha sido
empleada por el cuerpo y por lo tanto no es incluida en el cálculo
del valor biológico.

BV = ( ( Ni - Ne(f) - Ne(u) - Nb ) / Ni - Ne(f) ) * 100

Donde:
Ni = es el nitrógeno ingerido en las proteínas procedentes de la dieta-
test
Ne(f) = nitrógeno excretado en heces
Ne(u) = nitrógeno excretado en orina
Nb = nitrógeno excretado en una dieta libre de proteína
 PROTEINAS: VALOR BIOLOGICO

Es de notar que:

Nr = Ni - Ne(f) - Ne(u) - Nb
Na = Ni - Ne(f)

Esto hace que el valor biológico sea un número entre 0 y 100,

pudiendo incluir los números negativos. Por ejemplo, un valor de VB
igual a 100% indica una completa utilización de la proteína dietética,
es decir 100% de la proteína ingerida es empleada en el cuerpo.
Los valores negativos son posibles e indican que se excreta más
proteína de la que se ingiere, todas las dietas no-nitrogenadas
poseen un valor biológico negativo. El valor de 100% es un máximo
absoluto ya que no puede ser empleada más proteína de la digerida
(en la ecuación susodicha Ne(u), Ne(f) y Nb no puede ser negativo
si se ha fijado el 100% como el máximo valor de VB).
 PROTEINAS: Clasificación según su Forma

Fibrosas: presentan cadenas polipeptídicas largas y una

estructura secundaria atípica. Son insolubles en agua y en
disoluciones acuosas. Algunos ejemplos de estas son
queratina, colágeno y fibrina.

Globulares: se caracterizan por doblar sus cadenas en una

forma esférica apretada o compacta dejando grupos
hidrófobos hacia adentro de la proteína y grupos hidrófilos
hacia afuera, lo que hace que sean solubles en disolventes
polares como el agua. La mayoría de las enzimas,
anticuerpos, algunas hormonas y proteínas de transporte,
son ejemplos de proteínas globulares.

Mixtas: posee una parte fibrilar (comúnmente en el centro de la

proteína) y otra parte globular (en los extremos).
.
PROTEINAS: Clasificación según su Composición
Química

• Simples: su hidrólisis sólo produce aminoácidos.

Ejemplos de estas son la insulina y el colágeno
(globulares y fibrosas).

• Conjugadas o heteroproteínas: su hidrólisis

produce aminoácidos y otras sustancias no
proteicas llamadas grupo prostético.
 PROTEINAS: Funciones

SON PROTEÍNAS

❖ Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en

organismos vivientes;
❖ Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares;
❖ La hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la
sangre;
❖ Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra
infecciones o agentes extraños;
❖ Los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas
capaces de desencadenar una respuesta determinada;
❖ La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del
músculo durante la contracción;
❖ El colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de
sostén.
 PROTEINAS: Estructura

• Es la manera como se organiza una proteína para

adquirir cierta forma. Presentan una disposición
característica en condiciones fisiológicas, pero si se
cambian estas condiciones como temperatura, pH, etc.
pierde la conformación y su función, proceso
denominado desnaturalización.

• La función depende de la conformación y ésta viene

determinada por la secuencia de aminoácidos.

• Para el estudio de la estructura es frecuente considerar

una división en cuatro niveles de organización, aunque
el cuarto no siempre está presente.
PROTEINAS: Estructura
 PROTEINAS: Desnaturalización

• Si en una disolución de proteínas se producen cambios de pH,

alteraciones en la concentración, agitación molecular o variaciones
bruscas de temperatura, la solubilidad de las proteínas puede verse
reducida hasta el punto de producirse su precipitación.

• Los enlaces que mantienen la conformación globular se rompen y la

proteína adopta la conformación filamentosa.

• De este modo, la capa de moléculas de agua no recubre

completamente a las moléculas proteicas, las cuales tienden a
unirse entre sí dando lugar a grandes partículas que precipitan.

• Sus propiedades biocatalizadores desaparecen al alterarse el

centro activo.
 PROTEINAS: Reacciones de Reconocimiento

REACCION DE BIURET El reactivo de Biuret está formado por una

disolución de sulfato de cobre en medio alcalino, este reconoce el
enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un
complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos, lo que produce una coloración rojo-violeta.

REACCION DE MILLON Reconoce residuos fenólicos, o sea aquellas

proteínas que contengan tirosina. Las proteínas se precipitan por
acción de los ácidos inorgánicos fuertes del reactivo, dando un
precipitado blanco que se vuelve gradualmente rojo al calentar.

REACCION XANTOPROTEICA Reconoce grupos aromáticos, o sea

aquellas proteínas que contengan tirosina o fenilalanina, con las
cuales el ácido nítrico forma compuestos nitrados amarillos.
 PROTEINAS: Reacción de Biuret

• El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de

proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más
enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.

• Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4),

junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo,
de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a
rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El
Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona
el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

• Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método

colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas
de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-visible a una
longitud de onda de 560 nm (para detectar el ión Cu2+).
 PROTEINAS: Reacción de Millon

• La reacción del Millón se debe a la presencia del grupo hidroxifenilo

en la molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico que no esté
sustituido en la posición 3,5 como la tirosina, el fenol y el timol
producen resultados positivos en esta reacción. De estos
compuestos, sólo la tirosina está presente en las proteínas, de manera
que sólo las proteínas que tienen este aminoácido ofrecen resultados
positivos.
• En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente
ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico
formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no es
satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgánicas en gran
cantidad, ya que el mercurio del reactivo del Millón es precipitado y se
vuelve negativo, razón por la cual este reactivo no se usa para medir
albúmina en orina.
• Debe tomarse en cuenta que en el caso de que la solución a examinar
sea muy alcalina, debe ser previamente neutralizada, ya que el álcali
precipitaría al ion mercurio en forma de óxidos amarillos. Además,
proteínas como la ovoalbúmina producen un precipitado blanco que
progresivamente por acción del calor se torna rojo; pero, las
peptonas, dan solamente una solución de color rojo.
 PROTEINAS: Reacción de Millon

Realización de la Prueba:

• Se toman y rotulan tres tubos de ensayo Pyrex diferentes (1, 2 y 3).

Y en cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución de
ovoalbúmina 10%, solución de glicina 0.1 M y agua destilada,
respectivamente.

• Se añaden 3 ó 4 gotas del reactivo de millón y se colocan los tubos

en un baño de María a 100° C por 1-2 minutos. Se observan los
cambios.

• Si no llega a desarrollarse color, pueden añadirse 2 ó 3 gotas más

del reactivo de Millón y calentar nuevamente por igual período de
tiempo. ¡CUIDADO! Evite el exceso de reactivo ya que puede
producir un color amarillo que no es indicativo de positividad.
 PROTEINAS: Reacción Xantoproteica

• Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos. Esta reacción

se debe la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica.

• Los complejos de la molécula proteica que son de importancia en esta

reacción son la tirosina y el triptófano.

• La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en el

laboratorio.

• Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente

en los aminoácidos obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo,
que se vuelven anaranjados en medio fuertemente alcalino (formación
de ácido picrámico o trinitrofenol).

• No puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina,

por el color anaranjado de la reacción final.
 PROTEINAS: Reacción Xantoproteica

• Realización de la prueba: se toman y rotulan tres tubos de ensayo Pyrex

diferentes (1, 2 y 3).

• En cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución de ovoalbúmina 10%,

solución de glicina 0.1 M y agua destilada, respectivamente.

• Se añade 1mL de HNO3 concentrado.

• ¡CUIDADO AL AGREGAR EL ÁCIDO! Se colocan los tubos en un baño de María

a 100° C por 1 minuto.

• Se observan los cambios.

• Deje enfriar.

• Añada cuidadosamente solución de hidróxido de amonio concentrado

(hidróxido de sodio concentrado) en exceso.

• Observe la coloración nuevamente.

 AMINOACIDOS: Definición

• Los aminoácidos son ácidos carboxílicos que contienen un

grupo amino. Existen unos cien en la naturaleza.

• En el hidrolizado total de las proteínas existen veinte

aminoácidos que tienen, con algunas excepciones, la fórmula
general siguiente:

R-CH-COOH
NH2

• En el caso más sencillo, el radical R es un átomo de Hidrógeno

(ácido aminoacético o glicina), en los demás aminoácidos R es
un resto alifático, aromático o heterocíclico, que puede ser
portador de otros grupos funcionales.
 AMINOACIDOS ESENCIALES PARA EL SER HUMANO

• fenilalanina
• Existen diez (10) aminoácidos, denominados • isoleucina
aminoácidos esenciales, a causa que el
organismo no los puede sintetizar por que • leucina
carece del mecanismo necesario para elaborar
los cetoácidos correspondientes. • lisina
• metionina
• Se ha comprobado que si se le suministran
éstos y sales de amonio es capaz de
• treonina
elaborarlos.
• triptófano
• valina
• arginina
• histidina
 AMINOACIDOS CONSTITUYENTES DE
PROTEINAS

• Alanina • Leucina
• Arginina • Lisina
• Asparagina • Metionina
• ácido aspártico • Fenilalanina
• Cisteína • Prolina
• ácido glutámico • Serina
• Glutamina • Treonina
• Glicina • Triptófano
• Histidina • tirosina
• Isoleucina • valina.
 AMINOACIDOS: Características
• Todos ellos son aminoácidos
excepto dos, que son
iminoácidos, la prolina y la
hidroxiprolina, pueden
considerarse como aminoácidos
por su similitud estructural. Un
iminoácido es cualquier molécula
que contenga tanto un grupo
funcional imino (>C=NH) como un
carboxilo (-C(=O)-OH).
• Se les llama aminoácidos porque
el grupo amino está unido al
carbono de la cadena que es, por
convenio, el átomo de carbono
adyacente al grupo carboxilo.
• Los aminoácidos contienen tantos
grupos ácidos como básicos, por
lo que tienen propiedades ácidas
y básicas débiles y se les llama
anfolitos.
• Se comportan como anfipróticos
porque pueden aceptar o donar
electrones.
• Las moléculas de aminoácidos
transportan una carga negativa y
otra positiva, lo que da como
resultado una carga total nula,
esta forma se conoce como
"zwitterion" del aminoácido.
 AMINOACIDOS:Características

• La carga total transportada por un aminoácido depende del pH de la

solución y de los valores de la constante de acidez de los grupos
ionizables presentes.

• Si el pH es mucho mayor que el valor de la constante de un grupo, se

libera un protón y la molécula tendrá una carga negativa, pero si el pH
es menor, tendrá carga positiva.

• El hecho de que a diferentes valores de pH el aminoácido tenga

distintas formas y lleve distintas cargas netas se utiliza en muchos
métodos analíticos, como en la electroforesis y en la cromatografía de
intercambio iónico.
 AMINOACIDOS: Características

• El punto iso-iónico de una molécula es el pH en el que el

número de cargas negativas debidas a los protones perdidos
es igual al número de cargas positivas debidas a los protones
ganados, entonces predomina la forma zwitteriónica.

• El punto isoeléctrico es el pH en el que las moléculas no

presentan migración en un campo eléctrico y puede
determinarse experimentalmente por electroforesis; en los
aminoácidos es igual que el punto iso-iónico
 AMINOACIDOS: Derivatización

• Un aspecto importante en el análisis de los aminoácidos es el

hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV.

• Existen varios reactivos que reaccionan con los aminoácidos

dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por
tanto, pueden utilizarse para análisis cualitativos o
cuantitativos.

• Esto es lo que se denomina derivatización de los aminoácidos.

• Los métodos fluorimétricos tienen muchas ventajas respecto a

la espectrofotometría para el análisis de aminoácidos.
 AMINOACIDOS: Aminoácido Limitante

En la calidad de las proteínas influye el contenido en aminoácidos

esenciales, y es importante la presencia de "limitantes".

AMINOACIDO LIMITANTE

se llama así al aminoácido esencial que en una proteína se encuentra

en cantidad relativa más baja con respecto a la proteína patrón
porque limita el aprovechamiento de esa proteína a los fines
biológicos.
 AMINOACIDOS: Aminograma

• Es importante determinar el contenido en aminoácidos, en

conjunto, para estimar el grado de proteólisis enzimática que
ha sufrido una proteina, así como la proporción de cada uno de
ellos, como sus componentes, cuando se desea establecer su
valor biológico.

• La determinación de aminoácidos en alimentos permite extraer

algunas conclusiones acerca de su composición; por ejemplo,
la gelatina usada como espesante se diferencia rápida y
sencillamente, de otros hidrocoloides (grasas vegetales,
almidón, etc.), en función de su composición aminoacídica.
 AMINOACIDOS: Prolina

• Se trata del único alfa-aminoácido (su amina en alfa es una

amina secundaria en lugar de una amina primaria). Este
aminoácido no esencial se forma directamente a partir de la
cadena pentacarbonada del glutamato.

• Es una molécula hidrófoba. Su masa es 115,13 g mol-1.

• La prolina está involucrada en la producción del colágeno. Está

también relacionada con la reparación y mantenimiento de los
músculos y huesos.
 AMINOACIDOS: Prolina

Determinación de prolina en miel

• Reacción de la prolina con ninhidrina en medio ácido y

posterior determinación a 517 nm de la absorbancia del
compuesto formado.

• Preparación de la muestra: Suponiendo que la miel ya ha sido

separada del panel por escurrimiento a través de un filtro de
luz de malla, optaremos por realizar el siguiente paso, la
homogeneización.

• Reblandecer la muestra calentando entre 25-30ºC agitándola al

mismo tiempo.

• Una vez homogeneizada se calienta a 50ºC al baño María hasta

que se consiga la fusión y se deja enfriar rápidamente.
 AMINOACIDOS: Prolina
Determinación de hidroxiprolina en carnes

• Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y oxidación de la

hidroxiprolina.

• El derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valora

colorimétricamente a 560 nm.

• Preparación de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectoras

del producto para poder tomar una muestra representativa.

• Se parten trozos de 0,5 - 1 cm y se cortan dichos trozos en pequeños cubos.

Después se pasan por una trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla
homogénea. Se guarda en frascos limpios y secos para prevenir la pérdida de
humedad.

• Se conserva en refrigeración de forma que evite su deterioro y cualquier

cambio en su composición.
 AMINOACIDOS: Triptófano

Determinación de triptófano en alimentos.

La muestra es hidrolizada en medio básico, seguidamente se realiza un ajuste
de pH.
El triptófano es separado por cromatografía líquida de intercambio iónico y
determinado por un detector UV a 280 nm.

El nivel de triptófano mantiene el nivele de seretonina en el cerebro

considerado como antidepresivo.
 Metionina y Cisteina

Determinación:

Las proteínas son oxidadas con ácido perfórmico

Se obtiene: ácido cisteico y metionina sulfonada,

Se realiza una hidrólisis ácida con HCl.

Cromatografía de intercambio iónico aplicándole un detector que sea capaz de

medir a 570 nm.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía en capa fina

Eliminar las sustancias que interfieren: proteínas, carbohidratos

y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico.

Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la

columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después con agua
destilada.

La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de modo

diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente.

 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía en capa fina

La identificación de un aminoácido
Comparando Los valores de Rf con otros tomados como referencia,
debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para
establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.

Rf = Factor de retraso

Rf = distancia recorrida por el compuesto desde el origen

distancia recorrida por el solvente desde el origen
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía en capa fina: Criterios

La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un

disolvente, para permitir una mejor resolución de los componentes ácidos,
básicos o neutros.

Aumentando la proporción de agua en el disolvente se incrementan todos los

valores de Rf.

Introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del

factor de retraso de los aminoácidos básicos.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía en capa fina bidimensional

o El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarse

empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes
distintos.
o Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente
para la separación cromatográfica de una dimensión (aproximadamente el
triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensión.
o Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un
ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente.
o Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de localización elegido.
o En la cromatografía de dos dimensiones, la composición de los dos
disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía en capa fina bidimensional

o Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran

número de aminoácidos presentes en una muestra.

o Los que tienen una movilidad similar en la primera dimensión se separan

en la segunda.

o Ésto es muy útil en la detección de los componentes que están en muy baja
concentración y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que
tengan una concentración alta cuando se utiliza la cromatografía en una
dimensión.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Electroforesis
o La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o
partículas coloidales) se separan en función de su distinta velocidad de
migración en un campo eléctrico.

o Estas separaciones son muy eficientes y de una extensa aplicación, pero

son unas técnicas muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco
reproducibles.

o Esta situación cambió espectacularmente con la aparición de aparatos

comerciales para realizar electroforesis analíticas a microescala en
columnas capilares (electroforesis capilar).
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Electroforesis

o Los aminoácidos transportan diferentes cargas netas a un pH particular.

pueden separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo
voltaje.

o Los medios utilizados más frecuentes como soporte son el papel o las
placas de capa fina (celulosa o gel de sílice), pudiéndose utilizar para
visualizar las manchas, los reactivos de localización.

o Las separaciones se pueden realizar más fácilmente con alto que con bajo
voltaje, siendo una de las principales ventajas de la primera, el que las
sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan en menor
extensión la calidad del electroforetograma.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Electroforesis

o Se pueden conseguir separaciones electroforéticas con támpones a

distintos pH.

o En la práctica los valores de pH escogidos están entre 2 y 5’3.

o A pH 2 todos los aminoácidos tienen carga positiva y los de tipo básico que
tienen la mayor carga positiva migran más rápidamente hacia el cátodo,
mientras, que a pH 5 los aminoácidos se dirigen hacia ambos electrodos,
dependiendo de la carga transportada.

o Las separaciones a pH 5’3 se utilizan para determinar la naturaleza ácida o

básica de un aminoácido desconocido.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía de gases

o Se realizaron ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece

la cromatografía de gases, aunque se han realizado considerables progresos
en el desarrollo de tales métodos, aún no se utiliza de forma rutinaria para el
análisis de aminoácidos en muestras biológicas.

o Los aminoácidos, aunque similares, son compuestos químicamente

heterogéneos y además no son suficientemente volátiles a menos que se
conviertan en algún derivado apropiado.

o Aparecen dificultades no sólo a la hora de elegir el método de obtención de

tales derivados, sino también en la selección de una fase estacionaria que sea
capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan
diverso de compuestos.

o A lo hora de elegir el detector aparecen también problemas similares.

 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Analizador automático de aminoácidos – HPLC

Técnicas para la determinación de aminoácidos

Cromatografía líquida

Cromatografía de reparto Cromatografía de intercambio

en fase reversa iónico.

La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación

más ampliamente utilizada.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Analizador automático de aminoácidos – HPLC

Las razones más importantes

o Sensibilidad,
o Fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas,
o Idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles
o Aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en
muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
o Ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos y otros.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía de reparto en fase reversa

o Definición:
La cromatografía en fase reversa consiste en un disolvente
fundamentalmente polar como fase móvil y una cadena hidrocarbonada
ligada como fase estacionaria.

o Ventajas
Gran reproducibilidad,
Tiempos de retención cortos,
Velocidad de muestreo alta,
Sistema cromatográfico simple
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía de reparto en fase reversa

La selectividad: Basada en las interacciones específicas entre el soluto y la

fase móvil,

Interacciones pueden ser:

o De tipo polar,
o De formación de puentes de hidrógeno
o Por equilibrios secundarios provocados al variar la composición de la fase
móvil:
✓ Acido-base,
✓ Formación de complejos o pares iónicos,
✓ Adición de complejos metal-ligando
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía de intercambio iónico

o La cromatografía iónica está relacionada con los métodos para la

determinación de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio
iónico.

o Existen métodos automatizados para la separación y detección de

aminoácidos y otras especies iónicas en mezclas complejas.

o El desarrollo de la HPLC al desarrollarse la técnica de supresión del efluente,

la cual hace posible la detección conductimétrica de los iones eluídos.

o El analizador de aminoácidos, con el que se lleva a cabo la cuantización de los

aminoácidos se basa en esta técnica.
 AMINOACIDOS: Técnicas de Separación

Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y
eficaces para la determinación de iones que se basan en el uso de resinas
de intercambio iónico.
Existen métodos automatizados para la separación y detección de
aminoácidos y otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo
de la HPLC moderna empezó a finales de los años sesenta, pero su
aplicación a la separación por intercambio iónico se retraso debido a la
inexistencia de un método general y sensible para la detección de especies
como los cationes alcalinos y alcalinotérreos, y aniones como los haluros,
acetato y nitrato. Esta situación se remedió en 1975 al desarrollarse por
técnicos de Dow Chemical Company la técnica de supresión del efluente, la
cual hace posible la detección conductimétrica de los iones eluídos. El
analizador de aminoácidos, con el que se lleva a cabo la cuantización de
los aminoácidos se basa en esta técnica.