UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENIERIA PESQUERA.

BIOQUIMICA DE ALIMENTOS

(PRACTICA DE LABORATORIO Nº04)

DETERMINACION DE NITROGENO TOTAL
(METODO KJELDAHL)

 ELABORADO POR:

LEYTON PEDRERA, LUCERO

PINGO RUIZ, ROCIO
YOVERA DAVILA, XIOMARA

 PROFESOR ENCARGADO:

ING. JUAN JULCAHUANGA DOMINGUEZ

 FECHA DE ENTREGA:

10 DE JUNIO 2019

 SESION:

MARTES 12 – 2 pm

PIURA – PERU
DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL

I. INTRODUCCION

Tendemos a pensar en las proteínas como un sustantivo incontable: una

sustancia homogénea, algo que debería estar en tu dieta en cierta cantidad.
Las proteínas no son simplemente una sustancia, sino que hay muchísimas
proteínas diferentes en un organismo o incluso en una sola célula. Además,
son de todos los tamaños, formas y tipos que puedas imaginar, y cada una
tiene una función única y específica. 
Químicamente las proteínas están constituidas por combinaciones complejas
de carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y otros elementos en menor
proporción como son azufre cobre y fosforo.
Desempeñan múltiples funciones en nuestro cuerpo, todas ellas de vital
importancia, como formar parte de la estructura de los músculos, huesos o
tendones, funcionan como catalizadores de numerosas reacciones químicas,
transportan numerosas sustancias como hormonas o fármacos, participan en
los sistemas de defensa y también pueden ser utilizados como fuente de
energía, aunque este proceso es energéticamente poco rentable para el
organismo y genera productos tóxicos que deben ser procesados y eliminados
por el hígado y riñones.
Para poder determinar el contenido de proteína bruta que constituyen diversos
alimentos de origen animal y vegetal por el método de semi-micro kjeldahl o
digestión de Kjeldahl, el cual es un proceso de análisis químico para determinar
el contenido en nitrógeno de una sustancia química y se engloba en la
categoría de medios por digestión húmeda. Se usa comúnmente para estimar
el contenido de proteínas de los alimentos. Este método se desarrolla en tres
etapas las cuales son la digestión, destilación y titulación.
El procedimiento a seguir es diferente en función de si en la etapa de
destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre una disolución de ácido
bórico o sobre un exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico patrón.

II. OBJETIVOS:

1. Determinar el contenido de proteína bruta que constituyen los diversos

alimentos de origen animal y vegetal, por el método Semi- Micro
Kjeldahl.
III. MARCO TEORICO

LAS PROTEINAS

Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos que están unidos por un

tipo de enlaces conocidos como enlaces peptídicos. El orden y la disposición de los
aminoácidos dependen del código genético de cada persona. Todas las proteínas
están compuestas por: Carbono, Hidrogeno, Oxigeno y Nitrógeno.
Las proteínas suponen aproximadamente la mitad del peso de los tejidos del
organismo, y están presentes en todas las células del cuerpo, además de participar
en prácticamente todos los procesos biológicos que se producen.

De entre todas las biomoléculas, las proteínas desempeñan un papel fundamental

en el organismo. Son esenciales para el crecimiento, gracias a su contenido de
nitrógeno, que no está presente en otras moléculas como grasas o hidratos de
carbono. También lo son para las síntesis y mantenimiento de diversos tejidos o
componentes del cuerpo, como los jugos gástricos, la hemoglobina, las vitaminas,
las hormonas y las enzimas (estas últimas actúan como catalizadores biológicos
haciendo que aumente la velocidad a la que se producen las reacciones químicas
del metabolismo). Asimismo, ayudan a transportar determinados gases a través de
la sangre, como el oxígeno y el dióxido de carbono, y funcionan a modo de
amortiguadores para mantener el equilibrio ácido-base y la presión oncótica del
plasma.

Las dos propiedades principales de las proteínas, que permiten su existencia y

el correcto desempeño de sus funciones son la estabilidad y la solubilidad. La
primera hace referencia a que las proteínas deben ser estables en el medio en
el que estén almacenadas o en el que desarrollan su función, de manera que
su vida media sea lo más larga posible y no genere contratiempos en el
organismo. En cuanto a la solubilidad, se refiere a que cada proteína tiene una
temperatura y un pH que se deben mantener para que los enlaces sean
estables.
CALIDAD DE LA PROTEINA

Para juzgar la utilidad de las proteínas de los alimentos para mantener y

reparar los tejidos y para llevar a cabo los procesos de crecimiento y formación
de estructuras corporales se utiliza el término de "calidad de la proteína",
calidad que se estima utilizando diversas medidas experimentales. Por
ejemplo, el "valor biológico de la proteína" (VB) se define como la proporción de
la proteína absorbida que es retenida y, por tanto, utilizada por el organismo.
Otro parámetro habitualmente utilizado es el denominado "coeficiente de
utilización neta de la proteína" (NPU) que, a diferencia del anterior, sí tiene en
cuenta la digestibilidad de la proteína, es decir, mide la proporción de la
proteína consumida que es utilizada.

Durante la síntesis proteica deben estar presentes en las células todos los
aminoácidos necesarios, si falta alguno, la síntesis puede fallar. Por ello, si la
proteína ingerida contiene todos los aminoácidos esenciales en las
proporciones necesarias para el hombre, se dice que es de alto valor biológico,
que es completamente utilizable. Por el contrario, si sólo tiene pequeñas
cantidades de uno de ellos (el denominado aminoácido limitante), será de
menor calidad. En general, las proteínas de los alimentos de origen animal
tienen mayor valor biológico que las de procedencia vegetal porque su
composición en aminoácidos es más parecida a las proteínas corporales. Las
proteínas de los huevos y de la leche humana tienen un valor biológico entre
0.9 y 1 (eficacia del 90‐100%, por lo que se usan como proteínas de referencia,
un concepto teórico para designar a la "proteína perfecta"); el VB de la proteína
de carnes y pescados es de 0.75 y 0.8; en la proteína del trigo de 0.5 y en la de
la gelatina de 0.
METODOS DE DETERMINACION DE PROTEINAS

Existen diversos métodos alternativos para determinar proteínas:

 UTILIZACION DEL FACTOR DE CONVERSION

Determinar el contenido de nitrógeno total y multiplicar por un factor de

conversión de nitrógeno a proteína. Este factor se calculó considerando el
porcentaje de nitrógeno de la proteína principal y no de toda la mezcla. Además
se utiliza el factor de conversión de nitrógeno a proteína utilizando la
composición de aminoácidos del alimento a analizar, lo que se complica al
combinar los alimentos, por lo cual se prefiere continuar con el uso de los
factores. Se multiplica el contenido de nitrógeno proteico por un factor de
conversión de nitrógeno a proteína.

 METODOS QUIMICOS

Las proteínas presentan un amplio rango de comportamiento químico debido a

la propiedad de los aminoácidos de tener diferentes tipos de grupos
funcionales, a las reacciones químicas de estos grupos y a os enlaces
peptídicos.

METODO BIURET: La reacción se caracteriza por una coloración purpura

cuando los iones cúpricos son complejados por los enlaces peptídicos a pH
alcalino. El matiz del color depende del tipo de proteína y su intensidad
depende del contenido de proteína presente.
METODO “DYE-BINDING”: Se caracteriza por la formación de un coagulo de
proteína, coloreado e insoluble producto de la reacción de la proteína con una
solución coloreada de ácido sinfónico a pH 2. El anión coloreado se une por
asociaciones electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por ejemplo, a
los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y
aminos terminales. Además, se producen atracciones intermoleculares por
interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la mitad no iónica del anión y
entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del anión en solución. El
coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de
tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de
proteína.

METODO DE DESTILACION ALCALINA: La hidrolisis de las amidas en medio

alcalino fuerte da origen a amoniaco el cual es destilado y su vapor es
relacionado con el contenido de proteína. Se ha encontrado que el rendimiento
de amonio es altamente reproducible para una proteína dada.

METODO DE LOWRY: Cuando se agrega reactivo de Folin a una proteína,

ésta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidación de los
aminoácidos tirosina, triptófano, cistina, cisterna e histidina.

METODO DE TITULACION CON FORMOL: A la muestra neutralizada con

álcali se le agrega formaldehido en exceso el cual reacciona con cada grupo
básico de lisina y arginina. El exceso de formaldehido se neutraliza con un
exceso de álcali estándar el cual se titula, y se relaciona con el contenido de
proteína.

 METODOS FISICOS

Son más simples, rápidos y el costo por análisis es menor aunque el costo de
los equipos es elevado. La exactitud de estos métodos se relaciona con las
características del material a analizar. La concordancia con nitrógeno total
depende de que el material no varié de muestra en muestra.

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA: Se aprovecha la absorción del grupo

amida del enlace peptídico a 6,46 Tm.

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA REFLECTANTE: La muestra se ilumina

con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja (0,75-2,5 Tm) y
se detecta la luz reflejada.
ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA: Mide proteínas en solución con
absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos aromáticos de tirosina y
triptofáno y entre 180-220nm.

METODOS REFRACTOMETRICOS: Mide la refracción directa de la proteína

en solución o el cambio de índice de refracción causado por la remoción de la
proteína de la solución.

METODO TURBIDIMÉTRICO: Mide la reducción de la intensidad de la luz al

pasar por una suspensión de partículas de proteínas. Este cambio se relaciona
con el contenido de proteína.

ESPECTROSCOPIA ELECTRONICA: Irradiación del material con rayos X y

cuantificación de los fotoelectrones liberados característicos al átomo de N del
grupo amida de la proteína.

POLAROGRAFIA: Determina trazas de proteína.

DETERMINACION DE NITROGENO TOTAL

El contenido proteínico de los alimentos puede determinarse por medio de

diversos métodos. La forma más habitual es su cuantificación de forma
indirecta y aproximada, bien a partir del contenido en nitrógeno de la muestra, o
bien deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno o dos aminoácidos
particulares que conforman la proteína, fáciles de identificar y de cuantificar por
su reactividad química específica. Este segundo procedimiento conlleva una
mayor inexactitud. El contenido total de proteínas en los alimentos está
conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una
combinación de carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química.
Actualmente todos los métodos para determinar el contenido proteico total son
de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo
de la proteína, pero dicho método se utiliza solo a veces en investigaciones
bioquímicas debido a que es dificultoso.

 METODO KJELDAHL

Este método lo desarrolló el investigador danés Johann Kjeldahl para realizar el

análisis de proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una
mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. También se utiliza el
método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno en aguas residuales y
suelos. Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, USEPA,
ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias. La convención general,
sobreentendida, es que la totalidad del nitrógeno de la muestra está en forma
proteica, aun cuando la realidad es que, según la naturaleza del producto, una
fracción considerable del nitrógeno procede de otros compuestos nitrogenados
(bases púricas y pirimidínicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por
ello se denomina “proteína bruta” o “proteína total” a la obtenida por este
método. Con este análisis, sin embargo, no se determina el nitrógeno nítrico, el
cianhídrico, el de la hidracina, el de grupos azo y el nitrógeno de un núcleo
cíclico.

 REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL:

Este método puede ser dividido, básicamente en 3 etapas: digestión o

mineralización, destilación y valoración. El procedimiento a seguir es diferente
en función de si en la etapa de destilación el nitrógeno liberado es recogido
sobre una disolución de ácido bórico o sobre un exceso conocido de ácido
clorhídrico o sulfúrico patrón. Ello condicionará la forma de realizar la siguiente
etapa de valoración, así como los reactivos empleados. En este artículo
docente se explica el primer procedimiento, cuando el nitrógeno se atrapa
sobre ácido bórico.

Para calcular:

De la valoración se puede calcular el número de equivalentes de nitrógeno

recogidos, y con este dato se obtiene el porcentaje de nitrógeno en la muestra.
Para calcular el porcentaje de proteína basta con multiplicar por un factor de
conversión el % de nitrógeno calculado. Este factor de conversión está
tabulado para cada grupo de alimentos.

IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

Materiales y equipos:

 Digestor, balones Kjeldahl de 100 ml

 Equipo destilador Kjeldahl

 Balanza analítica

 Erlenmeyers, buretas, pipetas, fiolas de 100 250 ml.

 Probetas de 10 ml. y 100 ml.

Reactivos:

 Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4)

 Ácido bórico al 3% (H3BO3)

  Catalizador (mezcla de K2SO4 + CuSO4 5HO2 en la proporción de 9:1)

 Hidróxido de sodio al 30%

 Ácido clorhídrico HCl 0.1N (valorado)

 Indicador rojo de metilo enmascarado.

V. PROCEDIMIENTO:

 El jefe de laboratorio inicio explicando la práctica de la determinación del

nitrógeno.

 De la práctica anterior de determinación de humedad y materia seca, se

toman las muestras secas para determinar la cantidad de proteína que
contienen.

a) DIGESTION

 Coloque en un balón kjeldahl de 100ml o.1g de muestra seca y

deshidratada y desgrasada. En este caso a nuestro grupo nos tocó
merluza
  Agregue 1 g de catalizador y
añadir 10 ml de ácido sulfúrico
concentrado y agite
suavemente.

 La digestión dura aproximadamente 3 horas y se considera terminada

cuando el contenido del balón es de color ligeramente verdoso
esmeralda.
 Se recomienda que con las muestras deben llevarse a cabo en blanco
(se colocan todos los reactivos menos la muestra, deben analizarse por
duplicado)

b) DESTILACION

 Terminado el proceso de digestión se agrega agua destilada al balón

para que este se enfríe.

 Luego se transfiere 10ml de la muestra a una fiola de 100ml.

 Conecte el equipo de destilación de modo que el extremo inferior del
refrigerante este inmerso en el Erlenmeyer y que contenga 10 ml de
acido Bórico al 3% y 2 gotas del indicador rojo de metilo enmascarado.

 Haga circular agua por el sistema refrigerante

 Agregue lentamente 5ml de NaOH al 30%

 El tiempo de destilación es de 15 min. Aproximadamente.

 Verifique el término de la destilación colocando papel de tornasol en el

extremo inferior del refrigerante. Si al recibir el destilado en el papel no
se colora, esto indica el término de la destilación.
  Retire luego el Erlenmeyer con el destilado y apague el mechero.

c) TITULACION
 Para este proceso se coloca el Erlenmeyer para ser valorado con una
muestra de ácido clorhídrico 0.1N, hasta que la muestra se vuelva
incolora.
 Luego se anota el gasto.
 Finalmente se calcula el porcentaje de hidrogeno con la fórmula:

( A−B ) f ∗d∗0.0014∗100
%N =
M

En este proceso vimos que mediante

reactivo ácido clorhídrico echándole
gota a gota hasta que cambie a su
color normal. Este resulta que nos
arroja es el cálculo importante porque
va a entrar en la formula
VI. RESULTADOS

(Muestra de merluza):

( A−B ) f ∗d∗0.0014∗100
%N =
M

DONDE:
A= gasto de la muestra (ml) caballa
B= Gasto del blanco (ml)
f= factor HCl- 0.1 N
d= proporción de las muestras descompuestas diluidas (en este caso 100/10)

( A−B ) f ∗d∗0.0014∗100 A= 1.54

%N =
M
B= 0.04
f= 1.013
d= 100/10
M= 0.1396 g.
% humedad= 80.43
 100
(1 . 5 4−0.04 ) 1.0 1 3∗( )∗0.0014∗100
10
%N =
0.1396
%N =15. 24
15. 24∗6.25=95. 25 = base seca
100 – 80.43= 19.57 = base humedad

95.25∗19.57
proteina en base humedad=
100
proteinaen base humedad=18.64 %

VII. CONCLUSIONES

1. Con la experimentación de semi- micro kjeldahl se pudo obtener en

primer lugar el porcentaje de nitrógeno de la materia seca de la merluza
que fue de 15.24% y esto sirve para poder calcular el porcentaje de
proteínas que contiene este producto.

2. Por medio de la titulación con el ácido clorhídrico (HCl) se pudo obtener

el gasto que se utilizó que fue de 0.94mm; este es un dato que sirve
para poder realizar los cálculos al momento de querer encontrar el
porcentaje de proteína.

3. Con el porcentaje de nitrógeno de la merluza se pudo aplicar una

fórmula para poder calcular el porcentaje de proteína que tiene, en este
caso fue de 18.54%, que comparando con el marco teórico está dentro
del rango de 15-25% que posee las proteínas.

VIII. RECOMENDACIONES
1. Debe haber una participación activa de todos los alumnos para poder
lograr los objetivos.

2. Para realizar una buena experimentación los equipos que se van a

utilizar deben encontrarse en buenas condiciones y debe haber
suficientes para todos los grupos que se forman a realizar la práctica.

3. El laboratorio debe contar con suficientes reactivos para que la práctica

sea realizada por los alumnos con un control adecuado.