TÉCNICAS DE PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA (JEC) CFGS Fabric. Prod. Farm., Biot.

y Afines

PRÁCTICA N.º 13 Fecha: 07/02/2024

CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DEUN ADN RECOMBINANTE

1. OBJETIVO DEL EXPERIMENTO

El objetivo de este experimento será ensamblar y analizar moléculas de ADN in vitro, utilizando
varias técnicas de ADN recombinante, incluida la clonación de genes, la extracción de
plásmidos y el análisis de enzimas de restricción.

CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DEUN ADN RECOMBINANTE

https://www.edvotek.com/301

2. INTRODUCCION Y CONTEXTO
CLONACIÓN Y CONSTRUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE

Después de que James Watson y Francis Crick publicaran la estructura de la doble hélice, los
científicos de todo el mundo se apresuraron a descubrir los secretos codificados en nuestro ADN.
Sin embargo, les resultó difícil estudiar las propiedades de un gen individual porque un solo
cromosoma puede contener cientos de genes. Como tal, se desarrollaron técnicas de clonación
de genes para aislar, combinar y reproducir secuencias de ADN específicas. En primer lugar,
utilizando una enzima llamada endonucleasa de restricción, el ADN podría cortarse en trozos más
pequeños. Luego, se utilizó una segunda enzima llamada ADN ligasa para ligar o unir el
fragmento de ADN con un plásmido bacteriano. Finalmente, las moléculas de ADN híbridas se
introdujeron en bacterias, donde pueden reproducirse para crear millones de copias de la
secuencia de ADN inicial. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante inició la era de la
biotecnología al hacer posible el mapeo, la secuenciación y diversos estudios del genoma.

En esta exploración, los estudiantes ensamblarán y analizarán moléculas de ADN recombinante

utilizando las mismas técnicas de clonación de genes que se utilizan en los laboratorios de
investigación. Primero, los estudiantes ligarán el gen de resistencia a la kanamicina (kanR) en un
vector plásmido. El plásmido modificado se transforma en E. coli, que luego se siembra en placas
en medios que contienen kanamicina y se deja crecer durante la noche.
Debido a que el plásmido recién construido contiene el gen kanR, sólo las células transformadas
con éxito deberían crecer en colonias. Sin embargo, la presencia del plásmido en las células no
nos dice nada sobre la orientación o la cantidad de inserciones de kanamicina presentes dentro
del vector. Para ello, el plásmido dentro de un único transformante se cultiva, se purifica y se
analiza mediante digestión de restricción y electroforesis en gel de agarosa.
CREANDO ADN RECOMBINANTE

La kanamicina es un antibiótico aminoglucósido que se une a la subunidad 30S del ribosoma

procariótico impidiendo la correcta traducción del ARN mensajero. La enzima de resistencia a la
kanamicina, un aminoácido glucósido fosfotransferasa, inactiva el antibiótico mediante
modificación covalente.
Una vez modificado, el fármaco ya no
puede unirse al ribosoma. Los biólogos
moleculares identificaron el gen de la
resistencia a la kanamicina como parte de E.
coli TN903. El fragmento de 1282 pares de
bases del transposón utilizado para este
experimento incluye las siguientes
características (resumidas en la Figura 1:
Mapa del fragmento kanR de TN903):
(Figura no dibujada a escala)

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1. Promotor: una secuencia de ADN ubicada justo antes (o “aguas arriba” de) la secuencia
codificante de un gen. Secuencias promotoras reclutan la ARN polimerasa al inicio de la
secuencia del gen donde puede comenzar la transcripción.
2. Secuencias de unión ribosomal: secuencia corta que recluta ribosomas para un ARNm
determinado.
3. Codón de inicio: secuencia (ATG) que señala el inicio de la traducción.
4. La secuencia codificante de la proteína para el gen kanR. Esta secuencia de ADN de 813
pares de bases se transcribirá en el ARNm que se traducirá en una proteína de 30 kD que
consta de 271 residuos de aminoácidos.
5. Codón de parada o Stop: una secuencia específica (TAG, TAA, TGA) que señala el final
de la traducción. El codón de parada se encuentra a 325 pares de bases aguas arriba
del sitio EcoRI más cercano (ver Figura 1).

Codón de inicio del promotor

Sitio de unión ribosómica

Secuencia de codificación de proteínas para el gen kanR

Codón de parada traslacional

En este experimento, ligaremos el gen kanR a un pequeño

fragmento circular de ADN bacteriano conocido como
plásmido. En la naturaleza, los plásmidos permiten que las
bacterias intercambien genes beneficiosos. En el laboratorio, se
utilizan plásmidos bacterianos especializados llamados vectores
para introducir ADN de diferentes fuentes en las bacterias. El
vector utilizado para este experimento, un plásmido de 3000
pares de bases derivado de la serie de vectores pUC, contiene
las siguientes tres características que lo hacen útil para nuestro
experimento (Figura 2):

1. Origen de replicación: secuencia de ADN que permite a las bacterias copiar el plásmido.
2. Sitio de clonación múltiple (o MCS): una secuencia corta de ADN que contiene muchos
sitios de enzimas de restricción únicos y permite a los científicos insertar genes específicos
en el plásmido.
3. Marcador seleccionable: gen que codifica la resistencia a un antibiótico específico (en
plásmidos pUC, ampicilina). Cuando se utilizan medios selectivos, sólo las células que
contienen el marcador deben crecer en colonias. Esto permite a los investigadores
identificar células transformadas.

Para vincular el gen kanR a este vector, ambos fragmentos de ADN se cortan con una enzima
conocida como endonucleasa de restricción. Estas endonucleasas (también conocidas como
enzimas de restricción) actúan como tijeras moleculares, cortando el ADN bicatenario en
secuencias específicas. Muchas enzimas
de restricción reconocen y cortan tramos
palindrómicos de ADN, generalmente de
4 a 8 pares de bases.
en longitud. La digestión mediante una
enzima de restricción genera fragmentos
de ADN con uno de dos tipos de
extremos de ADN: "romas" o "pegajosos"
(Figura 3). Para ilustrar esto, consideremos
primero el sitio de reconocimiento y el
patrón de escisión de HaeIII. Esta enzima
corta ambas cadenas de ADN en la
misma posición, entre la G y la vecina C,

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lo que genera fragmentos sin salientes. Estos extremos denominados “romos” se pueden unir con
cualquier otro extremo romo.

A diferencia de HaeIII, EcoRI se escinde entre G y la vecina A, como lo indican las flechas en el
lado derecho de la figura. Es importante señalar que las posiciones de la escisión están
escalonadas, por lo que los fragmentos resultantes proyectan cortos salientes de ADN
monocatenario con secuencias complementarias. Estos salientes se denominan extremos
"pegajosos" porque las hebras simples pueden interactuar con otros salientes con una secuencia
complementaria o adherirse a ellos. La digestión del mismo fragmento de ADN utilizando
diferentes enzimas puede producir extremos pegajosos de diferentes longitudes y orientación de
las hebras (5' frente a 3').
Para crear extremos adhesivos compatibles para nuestra ligadura, ambas piezas de ADN (el
vector pUC y el inserto kanR) se cortan con la misma enzima de restricción: EcoRI. Esta enzima
corta una vez dentro del sitio de clonación múltiple de nuestro vector, creando una pieza lineal
de ADN con salientes pegajosos de EcoRI en cada extremo (Figura 4A). También se crean
salientes de EcoRI en cada extremo del fragmento kanR cuando se digiere con la enzima.
Una vez cortados los
fragmentos de ADN,
se unen entre sí in
vitro (Figura 4B).
Primero, los
nucleótidos
desapareados en los
extremos de los
fragmentos de ADN
se emparejan entre sí,
creando una
molécula de ADN
circular. Luego, la
ADN ligasa cataliza la
formación de un
enlace fosfodiéster
entre el fosfato 5' al
final de un fragmento
y el grupo hidroxilo 3'
al final del otro
fragmento (Figura
4C). Se agrega ATP a
la reacción para
suministrar la energía
necesaria para la
formación del enlace
(Figura 4D). Aunque
la ADN ligasa es más
activa a 37 °C, la
ligación de
fragmentos de ADN
con extremos
cohesivos
generalmente se
realiza entre 4 °C y 22
°C. Las temperaturas
más bajas permiten
una interacción más
estable entre los
extremos adhesivos.

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Una vez ligadas las dos piezas de ADN,

hemos creado una molécula de ADN
recombinante. Idealmente, se liga un
único inserto kanR al vector en la
orientación correcta, creando un
plásmido de 4282 pares de bases. En
la práctica, la ligación no se limita a
un inserto por vector: se pueden crear
muchas combinaciones y
orientaciones entre el vector y el
inserto utilizando las dos piezas de
ADN (resumidas en la Figura 5).
Debido a que el vector se corta con
una enzima, los extremos del plásmido pueden autoligarse.

Además, una molécula vector puede unirse a otro vector en lugar del inserto, formando una
larga cadena lineal de ADN plasmídico llamada concatémero.
El fragmento kanR también puede circularizarse o concatemerizarse; sin embargo, dado que
esta secuencia no contiene un origen de replicación, no puede reproducirse en bacterias.

Al clonar, la reacción de ligadura se puede optimizar de varias maneras para producir la

cantidad máxima del plásmido correcto. Por ejemplo, podemos evitar que el vector se una a sí
mismo eligiendo dos enzimas de restricción diferentes que produzcan salientes diferentes en
cada extremo del vector y del inserto. Esta práctica común evita que el vector se hibride consigo
mismo; Además, la inserción sólo puede entrar en el vector en una dirección. Además, los
vectores plasmídicos linealizados se pueden tratar con fosfatasa alcalina, una enzima que
elimina los 5' fosfatos de los extremos cortados del ADN. Esto elimina los problemas asociados con
el recierre de vectores y los concatémeros, porque la ligasa requiere un fosfato 5' para la
formación del enlace. Las mellas en la columna vertebral de azúcar-fosfato después de la
ligación del inserto de ADN al vector se reparan en el huésped transformado. Finalmente, se
pueden obtener mayores rendimientos de las moléculas recombinantes correctas ajustando la
relación molar del vector al inserto.

TRANSFORMACIÓN

En el laboratorio, los científicos pueden inducir a las células (incluso a bacterias como E. coli, que
no pueden transformarse naturalmente) a absorber ADN plasmídico. Para ello, las células se
tratan con sustancias químicas específicas que las hacen competentes o capaces de absorber
ADN del medio ambiente. A continuación, se añade ADN a la mezcla de células y la suspensión
se somete a un “choque térmico”, o se mueve rápidamente entre temperaturas muy diferentes.
Se cree que una combinación de iones químicos y el rápido cambio de temperatura altera la
permeabilidad de la pared y membrana celular, permitiendo que las moléculas de ADN ingresen
a la célula. Una vez que el plásmido se transforma en bacteria, se permite que las células
crezcan y se multipliquen de noche, produciendo millones de copias del plásmido. Para este
experimento, transformaremos nuestro ADN recombinante en una cepa de E. coli que no tiene
resistencia natural a los antibióticos, plásmidos ni enzimas de restricción. Estas características
hacen de la bacteria un excelente huésped para experimentos de clonación y subclonación.

Número de transformantes volumen final. en recuperación (ml) Número de

X = transformantes
µg de ADN vol. chapado (ml)
por µg

Figura 6: Cálculo de la eficiencia de la transformación bacteriana

En la práctica, la transformación es un proceso muy ineficiente: sólo una de cada 10.000 células
incorpora con éxito el ADN plásmido. Además, la eficiencia de la transformación es aún menor

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con moléculas de ADN lineales o concatémeros muy grandes. Sin embargo, debido a que en un
experimento de transformación se utilizan muchas células (aproximadamente 1 x 10 9 células), sólo
se deben eliminar unas pocas células transformadas para lograr un resultado positivo. Si las
bacterias se transforman con un plásmido que contiene un marcador seleccionable y se
siembran en medio de agar tanto selectivo como no selectivo,

Ejemplo específico:

100 transformantes 1 ml
X = 100.000 (1x105) transformantes por µg
0,01 µg de ADN 0,1 ml

Observaremos resultados muy diferentes. Las placas de agar no selectivas permitirán que
crezcan tanto las bacterias transformadas como las no transformadas, formando un “césped”
bacteriano. Por el contrario, sólo las células transformadas que expresan el marcador crecerán
en la placa de agar selectivo, lo que dará como resultado colonias aisladas.
Debido a que cada colonia en la placa de agar selectivo se origina a partir de una única célula
transformada, podemos calcular la eficiencia de la transformación o el número de células
transformadas por microgramo (μg) de ADN plasmídico (descrito en la Figura 6). Por ejemplo, si se
usaron 10 nanogramos (0,01 µg) de plásmido para transformar un mililitro (mL) de células, y la
siembra en placas de 100 microlitros (µL) de esta mezcla da lugar a 100 colonias, entonces debe
haber habido 1000 bacterias transformadas. en la mezcla de un ml. Dividir 1.000 transformantes
por 0,01 µg de ADN significa que la eficiencia de transformación sería de 1 x 105 células
transformadas por µg de ADN plasmídico. En general, la eficiencia de transformación oscila entre
1 x 105 y 1 x 108 células transformadas por µg de plásmido.

SELECCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PLASMIDOS RECOMBINANTES

En la mayoría de los casos, el gen de resistencia a los antibióticos del vector se utiliza para
seleccionar bacterias que contienen el ADN recombinante. Luego se analiza el ADN plasmídico
para determinar si el inserto está presente. En este experimento, podemos realizar una selección
simple y rápida para el inserto colocando los transformantes en placas de agar nutritivo que
contienen kanamicina. Sólo crecerán las células que contengan el inserto. Sin embargo, aún
debemos analizar nuestro ADN recombinante para verificar los resultados de la reacción de
ligación. Por ejemplo, el inserto puede estar presente en la orientación inversa o pueden estar
presentes múltiples insertos (Figura 5). Para determinar la naturaleza del plásmido recombinante,
el ADN se digiere con tres enzimas de restricción, utilizadas solas o en combinación. Las distintas
digestiones crearán diferentes patrones según la presencia y la orientación del inserto.
Antes de analizar el ADN recombinante, debemos aislar el plásmido de las células. Primero, se
utiliza una sola colonia de la placa de transformación para inocular medios líquidos. Debido a
que las bacterias a menudo eliminan sus plásmidos, el medio líquido contiene kanamicina para
mantener esta presión selectiva. Luego se permite que las bacterias crezcan y se multipliquen en
el medio durante la noche, produciendo millones de copias del plásmido. Finalmente, el
plásmido se purifica de las bacterias mediante el método de lisis alcalina y se analiza.

La técnica de extracción de plásmido por lisis alcalina es un método sencillo y fiable para
purificar el ADN recombinante de las células bacterianas. Primero, las células se recolectan del
cultivo líquido mediante centrifugación, creando un sedimento de células en el fondo del tubo.
Luego, el sedimento celular se suspende en una solución que contiene el detergente
dodecilsulfato de sodio (o SDS). El SDS altera la membrana celular y libera el ADN de las bacterias
en un proceso llamado lisis. El alto pH de la solución desnaturaliza irreversiblemente el ADN
cromosómico de la bacteria y ayuda en la desnaturalización de proteínas y la degradación del
ARN. Además, se añade la nucleasa RNasa al lisado celular para degradar cualquier ARN
residual en la muestra. Por el contrario, el plásmido superenrollado no se ve afectado porque su
columna vertebral de fosfato permanece intacta. Una vez que se completan los efectos de la

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lisis, se agrega una solución ácida de acetato de potasio al lisado para neutralizar el pH y
precipitar el SDS y los complejos de membrana/proteína. Además, la mayor parte del ADN
cromosómico también precipitará porque está asociado a la membrana celular. Esto deja una
solución que contiene principalmente el plásmido superenrollado. Si se requiere un plásmido de
alta calidad para la secuenciación, la proteína residual se puede eliminar aún más del ADN
mediante disolventes orgánicos como el fenol y el cloroformo. En este experimento, se utiliza
alcohol isopropílico para purificar y concentrar el ADN de extractos celulares. Cuando se agrega
alcohol a la solución, se producen interacciones electrostáticas entre las moléculas de agua y la
columna vertebral de azúcar-fosfato del plásmido. interrumpido, forzando al ADN a salir de la
solución como un precipitado blanco pegajoso. El plásmido precipitado se concentra en el
fondo de un microtubo mediante centrifugación a alta velocidad. Una vez que se elimina el
sobrenadante, el sedimento de ADN se seca antes de resuspenderse en tampón Tris-ETDA para
análisis de digestión de restricción. ANÁLISIS CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE ADN
RECOMBINANTE Para verificar la presencia del inserto kanR, el plásmido recombinante se digiere
con EcoRI. Recuerde, este es el sitio que se utilizó para clonar el inserto en el plásmido. La
digestión del plásmido con esta enzima generará dos fragmentos de 3000 y 1282 pares de bases
que representan el vector y el inserto, respectivamente. Esta digestión no confirma la orientación
del inserto ni identifica la presencia de múltiples insertos porque cada inserto producirá el mismo
producto de 1282 pares de bases (Figura 5, A-C).

La presencia de múltiples insertos se puede confirmar escindiendo el plásmido con la

endonucleasa PvuII. El único reconocimiento PvuII

El sitio de unión en el plásmido recombinante está en 5' y se encuentra en el vector plasmídico,

aproximadamente 128 pares de bases en 3' aguas abajo (en la dirección 3').
ción) del sitio EcoRI del vector en el polienlazador. En consecuencia, cuando el ADN se digiere
con esta enzima, el plásmido se linealizará. El tamaño del plásmido linealizado se puede utilizar
para estimar cuántos insertos
están presentes en la
molécula de ADN
recombinante. Por ejemplo, si
dos insertos adyacentes se
ligaran al vector, el plásmido
linealizado tendría una
longitud de 5564 pares de
bases (1282+1282+3000).
Figura 7: Uso de resúmenes
dobles para determinar la
orientación de la inserción.

El único sitio PvuII en el vector se puede utilizar como punto de referencia fijo para determinar la
orientación del inserto kanR. El inserto posee un único sitio de reconocimiento XhoI ubicado a
~177 pares de bases del extremo 5' del ADN. Porque la relación entre
el sitio XhoI y el sitio PvuII cambian dependiendo de la orientación del gen kanR dentro del
plásmido, una "doble digestión" de
el ADN recombinante con estas enzimas producirá un fragmento con una longitud distintiva, que
puede usarse para determinar la orientación del inserto (Figura 7). Por ejemplo, una digestión del
plásmido en la Figura 7A con XhoI y PvuII producirá fragmentos de 1233 y 3049 pares de bases
después de la doble digestión. Cuando el inserto está en la orientación opuesta, una doble
digestión producirá fragmentos de 305 y 3977 pares de bases.
Estadísticamente, uno esperaría encontrar una ocurrencia de 50:50 de las dos orientaciones de
inserción si se analizaran muchas colonias. Cabe señalar que la orientación del inserto kanR no
tiene grandes efectos en su expresión porque el fragmento tiene su propio promotor. Sin
embargo, cuando el vector proporciona el promotor necesario para la expresión, una de las
orientaciones del inserto puede suprimir la expresión del gen subclonado.

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Si hay múltiples inserciones presentes en un único vector circular, la determinación de la

orientación se vuelve más compleja (Figura 5B). Supongamos que el sitio PvuII en el vector está a
128 pares de bases a la derecha (3') del sitio de restricción RI (en el sentido de las agujas del
reloj). un pvuii
- La doble digestión con XhoI del recombinante de la Figura 5A produciría tres fragmentos que
tienen longitudes de 305, 1282 y 3977 pares de bases.

ANÁLISIS DE COMPENDIOS DE RESTRICCIÓN

Para ver los resultados de una digestión de restricción, los estudiantes utilizarán electroforesis en
gel de agarosa. A primera vista, un gel de agarosa parece sólido a temperatura ambiente. A
nivel molecular, el gel contiene pequeños canales a través de los cuales puede pasar el ADN. Se
añade una mezcla de moléculas de ADN a las depresiones (o “pocillos”) dentro de un gel y
luego se pasa una corriente eléctrica a través del gel. Debido a que la columna vertebral de
azúcar-fosfato del ADN tiene una fuerte carga negativa, la corriente impulsa el ADN a través del
gel hacia el electrodo positivo. Los pequeños fragmentos de ADN se mueven fácilmente a través
de estos agujeros, pero los fragmentos grandes de ADN tienen les resulta más difícil abrirse
camino a través de los canales. Por lo tanto, moléculas con tamaños y/o formas diferentes viajan
a diferentes velocidades. acelera, se separan y forman “bandas” discretas dentro del gel. Una
vez que se detiene la corriente, las bandas se pueden visualizar usando un tinte que se adhiere al
ADN. Cada grupo de estudiantes observará diferentes patrones de bandas después de la
electroforesis de los productos de la reacción de ligación debido a los diferentes plásmidos que
se construyen en el experimento. Sin embargo, debido a que los plásmidos pueden existir en
diferentes conformaciones, pueden estar presentes varias bandas inesperadas en las muestras de
ADN de plásmido no digeridas. En primer lugar, el ADN plasmídico superenrollado se enrolla
firmemente en una estructura secundaria compacta. Esto permite que el ADN se empaquete de
manera eficiente dentro de la célula. Este ADN parecerá más pequeño que su peso molecular
cuando se analice mediante electroforesis. Por el contrario, si la columna vertebral del ADN se
mella o corta durante la purificación, el plásmido perderá su estructura compacta y alcanzará el
tamaño adecuado. Esto creará dos bandas distintas cuando se analicen mediante electroforesis.
En la muestra también están presentes grandes cadenas de plásmidos entrelazados llamados
catenanos. Los catenanos, al ser las isoformas más grandes del ADN, parecerán mucho más
grandes que el ADN lineal. Todas estas isoformas son digeridas por enzimas de restricción, por lo
que producirán los mismos patrones. Después de la digestión de restricción, todas estas isoformas
producirán la misma serie de fragmentos de ADN cuando se analicen mediante electroforesis.

OBJETIVO DEL EXPERIMENTO

En este experimento, los estudiantes ensamblarán y analizarán moléculas de ADN in vitro

utilizando varias técnicas de ADN recombinante, incluida la clonación de genes, la extracción de
plásmidos y el análisis de enzimas de restricción.

CUADERNOS DE LABORATORIO

Los científicos documentan todo lo que sucede durante un experimento, incluidas las
condiciones experimentales, los pensamientos y las observaciones mientras se realiza el
experimento y, por supuesto, cualquier dato recopilado. Hoy documentarás tu experimento en
un cuaderno de laboratorio o en una hoja de trabajo separada.

Antes de comenzar el experimento:

• Leer atentamente la introducción y el protocolo. Utilice esta información para formular una
hipótesis para este experimento.
• Predice los resultados de tu experimento.

Durante el experimento:
• Registre sus observaciones en su cuaderno de laboratorio.

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Después del experimento:

• Interpretar los resultados: ¿sus datos apoyan o contradicen su hipótesis?
• Si repitieras este experimento, ¿qué cambiarías? Revise su hipótesis para reflejar este cambio.

3. COMPONENTES:

Reactivos y suministros (incluidos con este kit):

Guarde todos los componentes a continuación a temperatura ambiente.

• Tinción de ADN segura SYBR®

• Solución de carga de gel 10x
• Tampón de electroforesis 50x
• UltraSpec-Agarosa™
• Tubos con tapón de rosca (estériles)
• Tubos de microensayo (0,5 ml)
• Pipetas de 1 ml (estériles)
• Placas de Petri (estériles, 60 x 15 mm)
• Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
• Asas/agujas de inoculación estériles
• Pipetas de 10 ml (estériles)
• Tubos de cultivo estériles de 50 ml
• Placas Petri (estériles, 100 x 15 mm)

Requisitos (no incluidos con este kit):

• Aparato de electroforesis en gel horizontal

• Fuente de alimentación DC
• Baño María, 37 °C y 42 °C (EDVOTEK Cat. # 539 altamente recomendado)
• Transiluminador UV o sistema de visualización de luz azul (se recomienda Cat. #557)
• Gafas de seguridad UV
• Microcentrífuga (la velocidad máxima debe ser de 10 000 Xg o más)
• Centrífuga modelo de sobremesa, clínica o de suelo
• Horno de incubación a 37 °C
• Incubadora con agitación o baño María con agitación
• Micropipetas automáticas (5-50 µL, 20-200 µL 100-1000 µL) con puntas de pipeta estériles
• Bomba de pipeta
• Balance
• Microondas o plato caliente
• Guantes calientes
• Guantes de laboratorio desechables
• Etanol 95-100% y alcohol isopropílico
• Agua destilada o desionizada
• Cubiteras y hielo
• Solución de lejía o desinfectante de laboratorio.

4. PROCEDIMIENTO
4.1 PREPARACION MEDIO BÁSICO PARA EL CULTIVO DE PLANTAS
BREVE DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO
En este experimento, creará un plásmido recombinante uniendo (ligando) covalentemente un
gen de resistencia a kanamicina y un vector pUC. Luego utilizará electroforesis en gel para
confirmar esta ligadura. A continuación, preparará una cepa de células de E. coli competentes
para absorber ADN exógeno, incluido el nuevo plásmido kanR. Las bacterias transformadas se
seleccionarán haciendo crecer las células en placas de kanamicina. Luego, las colonias
supervivientes se cultivarán durante la noche en un medio de crecimiento con kanamicina.

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Finalmente, verificará la presencia de los insertos kanR en su cultivo bacteriano y determinará la

orientación de los insertos aislando los plásmidos, digiriéndolos con múltiples combinaciones de
enzimas de restricción y analizando los fragmentos resultantes mediante electroforesis en gel.

Los siguientes son los cuatro módulos de este experimento:

Módulo I Ligación del vector plásmido a un fragmento del gen kanR

Módulo II Transformación del ADN recombinante en E. coli
Módulo III Cultivo de transformantes kanR
Módulo IV Extracción de ADN Plásmido Recombinante
Módulo V Análisis de Enzimas de Restricción

Descripción general del módulo I

En el Módulo I, realizará una reacción de ligación combinando la enzima ADN ligasa T4 (T4) con
una solución madre que contiene agua, vectores pUC predigeridos con EcoRI y genes de
resistencia a la kanamicina también predigeridos con EcoRI. Durante la incubación, los extremos
pegajosos de muchos de los plásmidos y genes precortados se unirán y la enzima T4 catalizará la
formación de enlaces en estos sitios, dando como resultado nuevas moléculas recombinantes.
También preparará un control que contenga el vector y el gen, pero no la enzima (C1). Una
parte de ambas muestras se procesará en un gel de agarosa para confirmar la ligación.

Módulo I-A: Ligación del vector plásmido al fragmento del Gen kan R

1. ETIQUETE dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL como "C1" y "R1" y con tu grupo de
estudiantes.
• "C1" contendrá la muestra de gel de control de ligadura, sin ligasa T4.
• "R1" contendrá la muestra de gel de reacción de ligación, con ligasa T4.
2. Usando una punta de pipeta nueva, TRANSFIERA 20 µL de la mezcla madre de reacción
de ligadura (proporcionada por su instructor) al tubo de control de ligadura “C1”.
3. GOLPE suavemente el tubo que contiene la ADN ligasa T4 sobre la mesa o CENTRIFUGUE
para recoger la enzima en el fondo del tubo.
4. Usando una punta de pipeta nueva, AGREGUE los 40 µL de la mezcla madre de reacción
de ligación al tubo de ADN ligasa T4.
5. INCUBAR ambas muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. Utilizando una punta de pipeta nueva, MEZCLE cuidadosamente las mezclas madre de
reacción de ligación con la ADN ligasa T4 pipeteando la solución hacia arriba y hacia
abajo. La solución puede aparecer turbia después de mezclarla. PULSE brevemente en
una microcentrífuga para recoger la reacción de ligadura en el fondo del tubo.
7. INCUBAR las muestras a temperatura ambiente (~ 22 °C) durante 1 hora. Durante la
incubación, MEZCLE periódicamente la muestra golpeando o agitando el tubo.
8. Usando una punta nueva, TRANSFIERA 20 µL de muestra del tubo de ADN ligasa T4 al tubo
R1.

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9. AGREGUE 5 µL de solución de carga de gel 10x a los tubos C1 y R1. NO agregue solución
de carga de gel 10x al tubo de ligasa T4. MEZCLE tocando o agitando brevemente.
10. PROCEDER a la electroforesis con las muestras en los Tubos C1 y R1. La muestra en el tubo
de ADN ligasa T4 se utilizará en la transformación del Módulo II.

PUNTO DE PARADA OPCIONAL:

El control de ligadura y las muestras de gel de reacción de ligadura (tubos "C1" y "R1") se pueden
almacenar a -20 °C para electroforesis en un momento posterior. La reacción de ligación en el
tubo de ADN ligasa T4 debe almacenarse a -20 °C hasta que sea necesaria para la
transformación en el Módulo II.

Módulo I-B: Electroforesis en gel de agarosa

FUNDICIÓN DEL GEL DE AGAROSA:

1. DILUYA el tampón concentrado (50X) con agua destilada para crear un tampón 1X
(consulte la Tabla A).
2. MEZCLE el polvo de agarosa con tampón 1X en un matraz de 250 ml (consulte la Tabla A).
3. DISOLVER el polvo de agarosa hirviendo la solución. Cocine la solución en el microondas
a temperatura alta durante 1 minuto. RETIRA con cuidado el matraz del microondas y
MEZCLA haciendo girar el matraz. Continúe CALENTANDO la solución en intervalos de 15
segundos hasta que la agarosa se disuelva por completo (la solución debe ser
transparente como el agua).
4. ENFRIAR la agarosa a 60°C agitando cuidadosamente para promover una disipación
uniforme del calor.
5. Mientras se enfría la agarosa, SELLAR los extremos de la bandeja de fundición de gel con
las tapas de goma. UBICAR la plantilla del pozo (peine) en la muesca apropiada.
6. Antes de moldear el gel, AGREGUE SYBR® Safe diluido a la agarosa fundida y agite para
mezclar (consulte la Tabla A).

Individual 0.8% UltraSpec-Agarose™ Gel with SYBR® Safe Stain

7 x 7 cm0.6 mL29.4 mL0.24 g30 mL 30 µL

10 x 7 cm*0.9 mL44.1 mL0.36 g45 mL 45 µL
14 x 7 cm1.2 mL58.8 mL0.48 g60 mL 60 µL

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7. VIERTA la solución de agarosa enfriada en la bandeja de gel preparada. El gel debería

solidificarse completamente en 20 minutos. El gel se endurecerá y se volverá menos
transparente a medida que se solidifique.
8. QUITE las tapas de los extremos y el peine. Tenga especial cuidado al retirar el peine para
evitar dañar los pocillos.

* Volumen de gel recomendado para el sistema de electroforesis integrado EDGE™.

CORRER EL GEL

9. COLOQUE el gel (en la bandeja*) en la cámara de electroforesis. CUBRA el gel con

tampón de electroforesis 1X (consulte la Tabla B para los volúmenes recomendados). El
gel debe quedar completamente sumergido.
10. CARGUE la muestra completa (25 μL) en el pocillo en el orden indicado en la Tabla 1.
11. COLOCAR cubierta de seguridad. COMPROBAR que el gel esté correctamente orientado.
Recuerde, las muestras de ADN migrarán hacia el electrodo positivo (rojo).
12. CONECTE los cables a la fuente de alimentación y REALICE la electroforesis (consulte la
Tabla C para conocer las pautas de tiempo y voltaje).
13. Una vez completada la electroforesis, QUITE el gel y la bandeja de fundición de la
cámara de electroforesis.

ANTES DE CARGAR LAS MUESTRAS, ASEGÚRESE DE QUE EL GEL ESTÉ CORRECTAMENTE ORIENTADO
EN LA CÁMARA DEL APARATO

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*Los geles que se hayan retirado previamente de sus bandejas deben “anclarse” nuevamente a la bandeja
con unas gotas de agarosa fundida antes de colocarlos en la cámara de electroforesis. Esto evitará que los
geles se deslicen en las bandejas y las cámaras.

VISUALIZANDO EL GEL SYBR®

14. DESLIZA el gel fuera de la bandeja de fundición sobre la superficie de

visualización del transiluminador.
15. ENCENDER la unidad. El ADN debería aparecer como bandas de color
verde brillante sobre un fondo oscuro. FOTOGRAFÍA resultados.
16. QUITAR y DESECHAR el gel y LIMPIAR las superficies del transiluminador
con agua destilada.

Descripción general del módulo II

En el Módulo II, transformará células huésped de E. coli con su plásmido recombinante del
Módulo I.
Las bacterias se cultivarán durante 16 a 20 horas en “placas fuente” de agar LB, se recolectarán
usando un asa estéril y se harán competentes en CaCl 2. A continuación, se agregará el plásmido
a la mitad de las células antes de que se sometan a un breve choque térmico. Las muestras de
bacterias (expuestas y no expuestasal plásmido) se les permitirá recuperarse brevemente antes
de sembrarlos en placas de agar nutritivo que contengan kanamicina y se incubarán a 37 °C
durante la noche.

REQUISITOS DE TIEMPO:

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Módulo II: Transformación del ADN Recombinante en E.coli

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1. DILUIR la reacción de ligación mezclando 5 µL de ADN del tubo de ADN Ligasa T4 (Módulo
I) con 45 µL de agua ultrapura en un tubo de microcentrífuga nuevo. ETIQUETE este tubo
como “DLR” (Reacción de ligadura diluida). MEZCLE tocando o agitando brevemente.
2. ETIQUETE un tubo de microcentrífuga con "C2" para Control y un segundo tubo de
microcentrífuga con "R2" para Reacción de ligadura.
3. TRANSFIERA 500 µL de solución de CaCl2 helada al tubo “C2” (Control) usando una pipeta
estéril de un ml. COLOQUE el tubo sobre hielo.
4. Utilizando un asa de inoculación estéril, TRANSFIERA 5 colonias bien aisladas de la placa
fuente de E. coli al tubo “C2”. GIRA el lazo entre tus dedos para liberar las células. Revise
el tubo para confirmar que las bacterias han llegado fuera del circuito.
5. RESUSPENDA las células bacterianas en la solución de CaCl2 pipeteando hacia arriba y
hacia abajo hasta que no se vean grumos de células y la suspensión celular luzca turbia.
6. TRANSFERIR 250 µL de la suspensión celular al tubo “R2”. COLOQUE los tubos sobre hielo.
7. AGREGUE 10 µL de ADN de control al tubo “C2”. COLOQUE los tubos sobre hielo.
8. AGREGUE 10 µL del ADN de reacción de ligadura (DLR) diluido al tubo "R2" (Ligación).
COLOQUE los tubos sobre hielo.
9. MEZCLE SUAVEMENTE ambas muestras agitando los tubos. INCUBAR los tubos en hielo
durante 10 minutos.
10. COLOCAR los tubos de transformación en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos.
Este paso de choque térmico facilita la entrada de ADN en E. coli.
11. REGRESAR inmediatamente los tubos a la cubeta de hielo e INCUBAR durante dos
minutos.
12. TRANSFIERA 250 µL de caldo de recuperación Luria a los tubos usando una pipeta estéril
de 1 ml. MEZCLE suavemente moviendo el tubo.
13. INCUBAR las células durante 10 minutos en un baño de agua a 37 °C. Este período de
recuperación permite a las células reparar sus paredes celulares y expresan el gen de
resistencia a los antibióticos.

PASO 5 RECUERDA: Para obtener mejores resultados, asegúrese de que las células estén
completamente resuspendidas.

IMPORTANTE: Para obtener mejores resultados, asegúrese de que el CaCl2 esté helado y que las
células se muevan rápidamente del hielo a 42 °C y luego inmediatamente de nuevo al hielo. Siga
todos los tiempos exactamente.

14. Mientras las células se recuperan, ETIQUETE el fondo de dos placas de agar con “Control”
y “Ligación”.

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15. Después del período de recuperación, QUITAR los tubos del baño María. CENTRIFUGAR las
células durante 5 minutos a máxima velocidad (10.000 x g).
16. Utilizando una pipeta, QUITAR y DESECHAR 0,4 ml del sobrenadante del tubo “C2”.
RESUSPENDER el sedimento celular en los 0,1 ml restantes de líquido.
17. Usando una punta de pipeta nueva, TRANSFIERA todas las células recuperadas (0,1 ml)
del tubo “C2” al centro de la placa correspondiente.
18. DISTRIBUIR las células por toda la placa con un asa de inoculación estéril. Asegúrese de
que las células se hayan extendido por toda la superficie de la placa. CUBRIR los platos.
19. REPITA los pasos 16 al 18 con las células de ligadura del tubo "R2". Asegúrese de utilizar una
punta de pipeta y un asa nuevos para esta muestra.
20. ESPERE 10 minutos para que el agar absorba la suspensión celular. NO invierta las placas
hasta que la suspensión celular se haya absorbido completamente en el medio.
21. APILA los platos uno encima del otro y pégalos con cinta adhesiva. ETIQUETE la cinta con
sus iniciales o número de grupo. COLOQUE las placas en posición invertida (con el lado
del agar hacia arriba) en un horno de incubación bacteriana a 37 °C para una
incubación durante la noche (16-18 horas).
22. OBSERVAR las placas de ligadura y control. ANALIZAR los resultados calculando la
eficiencia de transformación.

5. WEBGRAFÍA

EDVOTEK

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