Tema 11.

Métodos de estudio del

ADN

 Enzimas empleados en la manipulación del

ADN

 INGENIERÍA GENÉTICA: HERRAMIENTAS

Modificaciones en las moléculas de ADN requieren herramientas
moleculares con función conocidas y controlables.

 Enzimas: de corte, modificación o ligación que permiten la

manipulación:
1. Nucleasas
2. Fosfatasas (fosfomonoesterasas)
3. Quinasas
4. Ligasas
5. Polimerasas
6. Transcriptasas reversas

Deoxinucleotidil terminal transferasas

 Moléculas de DNA de replicación autónoma que sirven de vehículos en

la manipulación (Vectores)

 NUCLEASAS:
Nucleasas: rompen los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos. Pueden
ser específicas de ADN(ds ó ss), o ARN.

Exonucleasas: cortan nucleótidos de los extremos (ADN o ARN).

Endonucleasas: cortan los enlaces fosfodiéster internos (puede generar

varios fragmentos).
  ENDONUCLEASAS RESTRICCIÓN:
Endonucleasa de restricción: enzima que se une a la molécula de ADN en
una secuencia específica, normalmente palindrómica, y corta la doble cadena
dentro o cerca de dicha secuencia diana.

Descubiertas en bacterias: sistema de protección contra la entrada de ADN

de bacteriófagos.

Existen tres tipos (I, II & III) de endonucleasas de restricción.

Los tipos I y III tienen actividad endonucleasa y metilasa, pero la posición

de corte es variable en relación a la secuencia de reconocimiento (Tipo I:
400 pb a 7 kb; Tipo III: 25 pb).

NO muy empleadas en ingeniería genética.

Tipo II: corta el enlace fosfodiéster siempre en la misma posición (dentro

o cerca de la diana reconocimiento). Conociendo la secuencia, se puede
predecir el número de fragmentos de corte.
TIPO II: Proteínas diméricas que reaccionan con la secuencia específica y
algunos nucleótidos flanqueantes. Cada subunidad corta una cadena.
Longitud secuencia diana: 4, 5, 6 y 8 pb.

1. Bases flanqueantes: determinan qué cadena se corta primero y la

velocidad de corte.
2. Isoesquizómeros: reconocimiento de misma secuencia diana (corte
puede variar).
3. Enzimas de restricción que reconocen secuencias distintas pero
producen los mismos extremos cohesivos.
4. Algunas Enzimas de restricción son capaces de cortar cuando su
secuencia diana está metilada y otras no son capaces. El uso
combinado de enzimas de los dos tipos que reconocen la misma
secuencia permite determinar el estado de metilación del ADN.
Aplicaciones de tipo II:
1. Mapas de restricción. El ADN se corta con varias enzimas de restricción,
solas y en parejas, para determinar el número de sitios de corte y sus
posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre ellos.

2. Fragmentar ADN en técnicas como el Southern blot; identificación de

polimorfismos de ADN (RFLP).

3. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados,

y crear ADN recombinante.

 LIGASAS:
Las ligasas forman enlaces fosfodiéster entre los extremos 5’- P y 3’-OH
de nucleótidos adyacentes de una doble hélice que no estén unidos.

Extremos cohesivos complementarios (↑ eficiencia): emparejamiento

provisional por puentes de hidrógeno → Ligasa

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Pero, es más difícil
ligar fragmentos romos (reacción de ligación es menos eficiente)
  FOSFATASAS:
Eliminan los grupos fosfato de los extremos 5’ de las cadenas de ADN,
solo actúan en condiciones parcialmente desnaturalizantes (e.g.
temperaturas elevadas).

QUINASAS:
Fosforilan los extremos 5’ OH del ADN (generados por las fosfatasas)
con gasto de ATP. Esto suele hacerse para marcar el ADN con fósforo
radiactivo (se usa ATP marcado).

 ADN POLIMERASA:
Sintetizan nuevos polinucleótidos complementarios a una cadena molde
existente.

Requieren un extremo 3’-OH al que la enzima pueda añadir nuevos

nucleótidos.

 ADN polimerasas III: requiere oligonucleótido sintético corto (~20

nucleótidos): primer → Delimita la región de la molécula que se va
a copiar/amplificar.

( ADN polimerasa I de E. coli: actividad de síntesis de ADN 5

´-3’ y actividad exonucleasa (5´-3´como 3´-5´) )

Encargadas de quitar los primers de ARN al comienzo de los fragmentos de

Okazaki y sintetizar ADN en su lugar.

 ADN polimerasa I: síntesis de cadena complementaria a extremos

cohesivos 5’ También, eliminación extremos 3’ (actividad exo 3´-5´)

 TRANSCRIPTASA REVERSA:
ADN polimerasas que usan ARN como molde: unen deoxinucleótidos a
extremos 3’-OH. Producen ADN copia (cDNA) a partir de ARNm.
 1. Cebador poliT complementario a la cola de poliA.
2. Híbrido ARN-ADN → eliminación cadena de ARN (Rnasa H o
condiciones alcalinas)
3. La cadena de ADN puede autocebarse → Eliminación de horquilla
(nucleasa)

 TRANSFERASAS:
ADN polimerasas que pueden unir deoxinucleótidos a un extremo 3’-OH sin
necesidad de molde.

Permiten añadir colas de extremos cohesivos a moléculas con extremos

romos.

 Reacción en cadena de la polimerasa

(PCR):

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer

muchas copias de una determinada región de ADN in vitro.

La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y

requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la región
de ADN de interés.
  Ingredientes esenciales para la PCR:
1. Taq polimerasa
2. cebadores (forward and reverse)
3. ADN molde
4. nucleótidos
5. cofactor necesario para la enzima (e.g. Mg2+)

En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de

temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región
diana. Pasos básicos:

1. Desnaturalización (96°C): Calentar fuertemente la reacción para

separar, o desnaturalizar, las hebras de ADN. Esto proporciona un
molde de una sola hebra para el siguiente paso.
2. Annealing (55 - 65°C): Enfriar la reacción para que los cebadores
puedan unirse a sus secuencias complementarias en el ADN molde
monocatenario.
3. Extensión (72°C): Aumentar la temperatura de la reacción para que
la Taq polimerasa extienda los cebadores, sintetizando nuevas
cadenas de ADN.

En la PCR, la producción de copias de la región diana es exponencial.

Dependiendo de los cebadores empleados puede ser un tipo de PCR u otro:

degenerada, específica, asimétrica, múltiple, aleatoria…
  PCR: DISEÑO DE PRIMERS.
- Complementarios con secuencia diana

- Tamaño entre 15 y 25 pb - Proporción de G+C entre 40-60%

- Temp. annealing similar para cada entre cebador 50 y 65ºC.

(Tm= 2x(A+T)+4x(C+G))

 COSAS A EVITAR:
• Estructura secundaria: - Se debe evitar que los cebadores sean
autocomplementarios

• Dímeros de primers: - Se debe evitar complementariedad entre los

primers

• Unión inespecífica: - Se debe evitar que los cebadores se unan en otros

sitios del genoma (off-target)

La PCR tiene muchas aplicaciones en investigación y en la práctica clínica. Se

utiliza de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el
análisis forense de ADN.

 PCR Y ELECTROFORESIS EN GEL:

Los resultados de una reacción de PCR pueden visualizarse mediante la
electroforesis en gel.

La corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz

de gel y se separan según su tamaño.

Se incluye un marcador de peso molecular para determiner el tamaño de los

fragmentos en la muestra de PCR (amplicón).
Los fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda" en el gel
que se puede identificar a simple vista, si el gel se tiñe con un agente
intercalante al ADN (e.g. Bromuro de etidio).

 PCR: DETECCIÓN DE MUTACIONES

PUNTUALES (SNP).
Se emplea un cebador que cubra el lugar del SNP. Si hibrida exactamente
con la cadena de ADN, entonces se amplifica el producto correspondiente.
Si la hibridación no es exacta, no aparece ningún producto de la PCR.
Determinación del número de repeticiones CAG en el
gen de la Hungtintina por PCR:
Se diseñan cebadores flanqueantes a las repeticiones y se separan los
productos de las PCR por electroforesis en un gel de poliacrilamida.