“AÑO DE LA UNIVERSALIZACIÓN DE LA SALUD”

UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

CURSO
 GENETICA Y EMBRIOLOGIA
DOCENTES
 Dra. Mogollon Garcia
 Dr. Peña Piscoya
 Dr. Vidal Fernandez
ALUMNOS
 IRIGOIN ASTOPILCO Diego
 IZQUIERDO DEL BARCO Luciana
 LOPEZ LOPEZ Robinson Jorge
 LUCHO ZARATE Mayra

TURNO
 Practica: Sábado 05:05 pm (NRC: 8656)

2020 – II
INTRODUCCIÓN:

La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa o PCR

convencional se refiere a una técnica la cual consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de
ADN especifico, mientras que la PCR en tiempo real es el método más sensible para detectar y
cuantificar los ácidos nucleicos. Ambas presentan un ciclo de amplificación de 3 pasos, los cuales
son la desnaturalización del ADN de doble cadena, unión de los primers al ADN cadena sencilla y
alargamiento de las cadenas de ADN molde. Además, ambas presentarán aplicaciones en pruebas
genéticas o para la detección de ADN patógeno.

Entre sus diferencias tenemos:

• Para el PCR convencional se necesita una ADN polimerasa, magmesio. nucleótidos, primers, el
ADN molde que se desea amplificar y un termociclador para su amplificación, mientras que para el
PCR en tiempo se necesitará un marcaje con compuestos fluorescentes, además de lo antes
mencionado lo que permitirá la recopilación de datos a medida que la PCR avanza

• Para la PCR convencional no es posible detectar el tiempo real ni cuantificar la secuencia, mientras
que la PCR en tiempo real la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la
reacción y es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra.

• Para la PCR convencional, la cantidad de ARNm que puede detectar la reacción necesita una mayor
concentración comparada con la cantidad de ARNm de la PCR en tiempo real, la cual, puede detectar
la reacción puede ser a partir de concentraciones bajas.

RESPONDE A LAS SIGUIENTES PREGUNTAS:

1. Gen alterado en esta enfermedad

La displasia espondiloepifisaria congénita (DEEC) es causada por mutaciones

en el gen COL2A1, que se encuentra en el cromosoma 12, dando como causa
defectos en el colágeno tipo II (evitan que los huesos se desarrollen
correctamente) , el colágeno tipo II es componente principal del cartílago.
Este tipo de colágeno también es encontrado en los discos intervertebrales
así como en el cuerpo vítreo del ojo.

2. Indica y menciona las características del patrón de herencia de la enfermedad.

Las características clínicas son variadas, pero en general muestran:

- Cuerpo de longitud corta que es acompañado de cierto acortamiento de los brazos y las
piernas.
- Los brazos pueden parecer largos en relación al cuerpo.
- Tamaño de cabeza normal con una ligera tendencia a ojos muy separados y características
ligeramente aplanadas,
 - Aumento hacia adentro de la curvatura de la columna lumbar (lordosis lumbar) y la
curvatura hacia afuera de la columna superior (cifosis), a veces acompañados por un doblez
en forma de S (escoliosis) que se desarrolla progresivamente a través de la vida.
- Distorsión de las articulaciones inferiores dando lugar a rodillas hacia dentro (genu valgo) o
arqueamiento de las piernas (genu varo).
- Dificultades para enderezar los brazos y las piernas (extensión limitada) y es frecuente
osteoartritis de las caderas, rodillas y columna.

Esta enfermedad genética tiene un patrón de herencia autosómica dominante en la gran mayoría
de casos, aunque se informan familias con afectados que presentan una herencia autosómica
recesiva y también se describen afectados como casos aislados.

3. Precisa las diferencias y semejanzas entre PCR convencional y PCR real time.

La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa o PCR

convencional se refiere a una técnica la cual consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de
ADN especifico, mientras que la PCR en tiempo real es el método más sensible para detectar y
cuantificar los ácidos nucleicos. Ambas presentan un ciclo de amplificación de 3 pasos, los cuales
son la desnaturalización del ADN de doble cadena, unión de los primers al ADN cadena sencilla y
alargamiento de las cadenas de ADN molde. Además, ambas presentarán aplicaciones en pruebas
genéticas o para la detección de ADN patógeno.

Entre sus diferencias tenemos:

• Para el PCR convencional se necesita una ADN polimerasa, magmesio. nucleótidos, primers, el
ADN molde que se desea amplificar y un termociclador para su amplificación, mientras que para el
PCR en tiempo se necesitará un marcaje con compuestos fluorescentes, además de lo antes
mencionado lo que permitirá la recopilación de datos a medida que la PCR avanza

• Para la PCR convencional no es posible detectar el tiempo real ni cuantificar la secuencia, mientras
que la PCR en tiempo real la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la
reacción y es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra.

• Para la PCR convencional, la cantidad de ARNm que puede detectar la reacción necesita una mayor
concentración comparada con la cantidad de ARNm de la PCR en tiempo real, la cual, puede detectar
la reacción puede ser a partir de concentraciones bajas.

PCR en Tiempo Real V S PCR convencional

 Amplificación y detección de productos en una
misma etapa.
Rango dinámico de detección amplio.
Detección durante la fase exponencial temprana
(máxima eficiencia de reacción)
Amplificación y detección de productos en 2
etapas separadas.
Rango dinámico de detección estrecho
Detección durante la fase exponencial.

Mayor sensibilidad Menor sensibilidad

Mayor especificidad con el uso de sondas Menor especificidad

Requerimiento de equipamiento y reactivos muy Requerimiento de equipamiento y reactivos de

costosos bajo costo.

Semejanzas: Emplean un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un

tampón de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable.

4. En el método de apoyo al diagnóstico qPCR; explique los métodos de cuantificación:

• Cuantificación absoluta:

Es el método más sensible para la detección y cuantificación de niveles de expresión de genes a

partir de muestras pequeñas de tejido. Depende de una RT-PCR en tiempo real (reto transcripción
o kinetic RT-PCR), se encarga de medir el cambio relativo en los niveles de expresión de ARNm y se
basa en comparar los niveles de expresión de una muestra problema frente a un gen constructivo.
• Cuantificación relativa:

Se utiliza una curva de calibración, la cual se realiza con diluciones seriadas de un estándar con una
concentración conocida. La curva estándar produce una relación lineal entre Ct y la concentración
inicial de ARN o ADN, lo que permite la determinación de la concentración de muestras
desconocidas con base a sus valores de Ct.

Son altamente reproducibles y permiten generar datos específicos y sensibles.

5. Indica y explica en la siguiente gráfica las partes de la curva de resultado del siguiente qPCR

Fase exponencial: Incremento exponencial y/o logarítmico del producto de PCR.

Fase inicial: Son los niveles de señal de fluorescencia durante los primeros ciclos (lo que se conoce
como ruido, pues no pasa el umbral).

Umbral: Es el primer incremento significativo en la cantidad de producto de PCR, medido por el

aumento de fluorescencia. No significa que no exista fluorescencia antes, solo que no es detectada
por el termociclador.

Fase meseta: Tope de amplificación.

6. Explique lo siguiente: ¿Es necesario tener un control endógeno en el proceso de PCR-RT?

Si es necesario porque gracias a esto se mide la expresión génica y en base al punto de control que
es un gen normal y permite corregir también algunas variaciones que existen entre varias muestras
entonces se comparan las cuantificaciones que existen entre estas.

7. Interpreta los resultados obtenidos en laboratorio para el diagnóstico de displasia

espondiloepifisaria congénita mediante qPCR realizadas a dos muestras (M1 y M2) que son
mostrados en la siguiente imagen:
 M1: VERDE y M2: ROJO. Al médico
le envían estos resultados: ¿Cuál es
su interpretación?

M1: Verde

M2: Rojo

Con respecto al gráfico mostrado, se interpreta que, si se alcanzó una concentración de copias a
partir del PCR rápido tiempo real cuantitativo en el M1, llegando a la fase meseta o plateau; sin
embargo, en el M2 no se logró pasar el umbral, viniendo a ser una señal no amplificada.

En el caso de los resultados, se observa una comparación entre la amplificación de los genes de
interés, es decir, las muestras (M1 y M2); y del gen endógeno o calibrador (C (+)), cuya expresión no
varía pesar de las condiciones del experimento (control endógeno) y es necesario para dicha
comparación.

La muestra M2 después de haber pasado los 45 ciclos no llegó a amplificarse, debido a la mutación
que presenta, la displasia espondiloepifisaria congénita, el gen COL2A1. Por otro lado, la muestra
M1 si llegó a amplificarse; sin embargo, no llegó a alcanzar a la curva del gen endógeno,
probablemente porque la mutación en esta ha sido más leve en comparación a la muestra M2.

 Muestra 1 (verde) ESTA ENFERMA

 Muestra 2 (rojo) ES SANA
 M1 si amplifica, tiene un producto, lo cual indica que está
codificando los genes mutados que producen esta enfermedad.
 Delta Rn (Y): Intensidad de emisión de Flurecencia.

8. Asumiendo que: por cada ciclo se duplica las copias de ADN, halla la carga de ADN inicial
comparativa entre M1 y C (+) en base al mismo treshold. ¿Cuántas veces es mayor o menor la
carga genética inicial, para el gen analizado, de M1 en relación con el C(+)?

- Datos: NF=No x 2ctDonde: NF= Carga ADN final por ciclo

- 2ct= copias del ADN

- No= Carga ADN inicial

 No de C(+)/ No de M1 = ¿?

RESOLUCION:

¿Cuántas veces es mayor o menor la carga genética inicial, para el gen analizado, de M1 en
relación con el C(+)?

No de C(+)/ No de M1=¿?

- No de C(+)= “A” → 5000= A x 2^35

A=5000/2^35

- No de M1= “B”→ 5000= B x 2^53

B= 5000/2^53

- No de C(+)/No de M1= A/B= (5000/2^35) / (5000/2^53)

A/B= 2^18= 262144

Rpta: La carga genética de M1 es 262144 veces menor que la de C(+).

Conclusiones:

- La PCR, 'Reacción en Cadena de la Polimerasa', es una prueba de diagnóstico que permite detectar
un fragmento del material genético de un patógeno.

- La displasia espondiloepifisaria congénita (DEEC) es un raro trastorno de los huesos en crecimiento

que da lugar a enanismo esquelético típico, y en ocasiones problemas con la visión y la audición.

- La displasia espondiloepifisaria congénita, es un tipo de displasia ósea manifiesta desde la etapa

de lactante, se produce por mutaciones en el gen COL2A1, ubicado en el cromosoma 12, causando
defectos en el colágeno de tipo II, un componente principal del cartílago.

- La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada
muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida
por el fluorocromo excitado.

- El patrón de herencia de la displasia espondiloepifisiaria congénita es autosómica dominante en la

gran mayoría de casos, aunque se informan familias con afectados que presentan una herencia
autosómica recesiva y también se describen afectados como casos aislados.