UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

GENÉTICA Y EMBRIOLOGÍA

INFORME DE LABORATORIO N° 10

ESTUDIANTES:

- Olivos Ruiz Noelia Estefani

- Paredes Gil Franco Jose

DOCENTES:

Peña Piscoya Hugo Heriberto

Marin Sánchez Edgard Huberto

NRC 6421

Jueves 7:50 a 9:35 pm

Trujillo – Perú

2022

PRUEBA MOLECULAR DE APOYO AL DIAGNÓSTICO:

Reacción en cadena de la Polimerasa: PCR punto final.
COMPETENCIAS
● Reconoce las implicancias de la técnica de PCR punto final y sus
aplicaciones.
● Emplea los conocimientos de la técnica del PCR punto final en el diagnóstico
propuesto: Síndrome de Marfan.

INTRODUCCIÓN:
● Tamay, Ibarra y Velasquillo, 2013 nos comentan: “La reacción en cadena de
la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de
veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en
los que la secuencia blanca es copiada fielmente” (p.70)
● Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o
ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos
trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio
(Mg +), una solución amortiguadora o buffer y H2O (Tamay, Ibarra y
Velasquillo, 2013, p. 71) Cruz, Larios y Caldera, 2016 en su investigación nos
dice: “La PCR punto final se lleva a cabo en tres fases: desnaturalización,
hibridación y elongación”. P. 15
● Si, el protocolo aplicado para la PCR punto final, ha sido el correcto;
podemos verificarlo mediante las visualizaciones de amplicones aplicando la
técnica de electroforesis, que mediante la separación de moléculas gracias al
campo eléctrico aplicado se visualiza tras aplicar un colorante fluorescente
para su posterior análisis (Tamay, Ibarra y Velasquillo, 2013, p. 73).
● La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental
para la mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. Se ha
presentado la base teórica y práctica de la PCR. Existen muchas variantes de
la PCR convencional, como son la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa
(que permite cuantificar la cantidad de producto amplificado) o la PCR por
transcripción inversa (mediante la cual se obtiene una copia de DNA
complementario, DNAc, utilizando como molde ácido ribonucleico, RNA).
Existe gran cantidad de información referida tanto a la PCR convencional
como a sus variantes (Pérez, A. 2011, p.10)
DESARROLLO DEL CASO
 (Hipotético)

Se presenta 2 niños de 10 (paciente N°1) y 8 (paciente N°2) años respectivamente,

con clínica típica de Síndrome de Marfan, el médico entre otros estudios de
laboratorio pide un estudio diferencial de PCR punto final para el gen de la fibrilina 1
(FBN 1),implicado en este síndrome; obteniéndose los siguientes resultados:

LEYENDA:
PM: Leader / peso molecular
C (+): control positivo
C (-): control negativo
Ig: inmunoglobulina
P-1: paciente 1
P-2: paciente2

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el papel del gen FBN1 en el S. de Marfan y cómo es su expresión
normal?
- El síndrome de Marfan (SM) es un trastorno sistémico causado por
mutaciones en la proteína de la matriz extracelular fibrilina 1 (FBN1), con un
patrón de herencia autosómico dominante, los pacientes se caracterizan por
presentar compromiso ocular, cardiovascular y esquelético dentro de un
espectro clínico variable.

- La fibrilina 1 es una glicoproteína predominante en la matriz extracelular,

codificada sólo por un gen (FBN1) constituido por 65 exones, localizado en el
cromosoma 15q21.1., cuyo defecto se expresa mediante un efecto dominante
negativo, es decir, en los heterocigotos, la fibrilina 1 mutante destruye el
ensamblaje de las microfibrillas normales, posiblemente, al actuar con los
productos del alelo normal., esto trae como consecuencia una formación de
fibras elásticas anormales, con la consiguiente disfunción de los tejidos que la
poseen. Además, se ha postulado que la fibrilina normal inhibiría el
crecimiento de los huesos largos y que las fibras elásticas a través de su
tensión controlarían el crecimiento de éstos, por lo tanto, al existir una
alteración en estas estructuras se produciría el crecimiento óseo exagerado
propio de la enfermedad.

2. ¿Qué es PCR punto final o convencional?

- La reacción en cadena de la polimerasa, abreviada PCR por su nombre en

inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica que permite “amplificar” o
“fotocopiar” diminutos segmentos de ADN millones de veces, por lo que es
considerada uno de los avances científicos más importantes en la biología
molecular. Es un método in vitro eficiente y rápido para la amplificación
enzimática de secuencias específicas de ADN o ARN procedentes de varias
fuentes. Una PCR convencional consta de un ADN específico, un conjunto de
cebadores oligonucleótidos sintéticos que flanquean la secuencia de ADN
específico, una ADN polimerasa termoestable (normalmente una polimerasa
Taq) y nucleótidos. Utilizando cicladores térmicos, existen tres etapas durante
cada ciclo de amplificación que son, la desnaturalización de la doble hebra
del ADN (dsDNA) en ADN monocatenarios separados, la hibridación de los
cebadores con la secuencia específica de ADN y la extensión, en la cual la
ADN polimerasa extiende el ADN desde los cebadores creando nuevos ADN
bicatenarios que contienen una hebra antigua y una nueva. Las cadenas
sintetizadas en un ciclo sirven como molde en el siguiente, lo que produce un
aumento de un millón de veces de la cantidad de ADN en tan sólo 20 ciclos.
 - Por otro lado, la PCR en tiempo real es una modalidad del PCR de punto
final, donde la acumulación de ADN amplificado es detectado y cuantificado a
medida que la reacción avanza, es decir, “en tiempo real”, en esto último
radica su diferencia, se logra incorporando una molécula fluorescente que se
asocia al ADN amplificado, donde el incremento de esta fluorescencia es
proporcional al incremento de la cantidad de moléculas de ADN amplificadas
en la reacción.

3. ¿Qué pasos se siguen para hacer un PCR punto final?

1. DESNATURALIZACIÓN
A una temperatura de 95 °C durante 20 a 30 segundos dentro de un
termociclador, ambas cadenas de ADN son calentadas y separadas.
Se debe tener en cuenta que: primero, si la cantidad de bases G-C es
alta, tomará más tiempo el proceso de desnaturalización, ya que
presenta tres enlaces de hidrógeno, uno más que las bases A-T; y
segundo, la velocidad, de acuerdo al modelo, del termociclador.

2. HIBRIDACIÓN
Luego de la separación de las cadenas de ADN, a una temperatura de
50 a 65 °C, se dejan enfriar y se incuban durante un periodo de 30
segundo a 1 minuto, con la finalidad de que los cebadores
(Fragmentos cortos de ADN con una secuencia inversa,
complementaria y específica a los extremos de la región de ADN que
va a copiarse) se unan a las secuencias complementarias de la
cadena molde.

3. ELONGACIÓN
La etapa final del PCR es llevada a cabo por la Taq polimerasa, la cual
empieza su función catalítica a gran velocidad agregando dNTP 's
complementarios a la cadena molde, en dirección 5’ - 3’, con la
finalidad de crear cadenas completas de ADN. Se debe considerar que
la temperatura óptima de dicha enzima es de 72 °C.

4. ¿Qué es la electroforesis en gel?

- La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos
de ADN (u otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y
carga. Consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las
moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se
desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades,
con lo que se separan unas de otras.

- Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa,
debido a esto, la electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN
 únicamente por su tamaño. Esta técnica nos permite ver cuántos
fragmentos diferentes de ADN están presentes en una muestra y cuán
grandes son unos con respecto a otros. También podemos determinar el
tamaño absoluto de un fragmento de ADN examinándolo junto a una
"escala" estándar de fragmentos de tamaño conocido.

5. ¿Cómo es el proceso de migración del ADN a través del gel?

- Una vez que el gel está en la cámara, cada una de las muestras de ADN
que queremos analizar se transfiere cuidadosamente a uno de los pozos, un
pozo se reserva para el marcador de peso molecular, un estándar de
referencia que contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas. A
continuación, se aplica energía eléctrica a la cámara y empieza a fluir
corriente a través del gel. Los grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-
fosfato le otorgan una carga negativa a las moléculas de ADN, por lo que
comienzan a moverse a través de la matriz de gel hacia el polo positivo.
Cuando el sistema está encendido y pasa corriente por el gel, se dice que el
gel está corriendo.

- Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más
rápido a través de los poros de la matriz del gel que los fragmentos más
grandes. Después de que ha corrido el gel por un tiempo, los fragmentos
más cortos de ADN estarán más cerca del extremo positivo del gel y los
más largos se mantendrán cerca de los pozos. Una vez que los fragmentos
se han separado, se podrá examinar el gel y saber el tamaño de las bandas
que se encuentran en él.

- Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se coloca bajo
luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permitirá ver el ADN
presente en distintos lugares a lo largo del gel. Una "línea" de ADN bien
definida en un gel se llama banda. Cada banda contiene un gran número de
fragmentos de ADN del mismo tamaño que han viajado juntos a la misma
posición. Un fragmento único de ADN no sería visible por sí mismo en un
gel. Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso
molecular, podemos determinar su tamaño aproximado.
6. Según los resultados del PCR punto final ¿Cuál es su interpretación?

- Se observa que en el paciente N° 01 el gen corre hasta un peso molecular

de 80 x 103 pb, mientras que en el paciente N° 02 hasta 230 x 10 3 pb, en
consecuencia podemos afirmar que el paciente N° 01 es Marfan positivo
para FBN1, debido a que presenta un gen que expone 80 x 10 3 pb, el cual
está muy por debajo con respecto al número de pares de bases que
presenta el control positivo que es el gen normal, lo que evidencia que dicho
gen está mutado y por lo tanto, el paciente N°01 presenta la enfermedad
de Marfan.

- Mientras que el gen del paciente N° 02 es Marfan negativo para FBN1,

debido a que presenta un gen normal con el número de pares de bases
normales con respecto al del control positivo que es el gen normal, quien
expone 230 x 103 pb al igual que el gen del paciente N° 02.

7. Explique genéticamente la razón por la cual el niño N° 1 (P-1) obtiene 80 x

103 pb y el niño N° 2 (P-2) obtiene 200 x 103 pb; en el corrido electroforético
del PCR punto final para el gen FBN1.

- La razón por la cual el paciente N° 01 obtiene 80 x 10 3 pb, es decir, menos

bases con respecto con respecto al control positivo (gen normal), es debido
a una deleción en el gen del paciente N° 01. Como ya sabemos una
 deleción, es un tipo de mutación que implica la pérdida de uno o más
nucleótidos de un segmento de ADN.
- En el paciente N° 02 no ocurre esto, ya que corre justo hasta el nivel del
control positivo (gen normal), lo que nos indica que no hay mutación para el
gen FBN1.

CONCLUSIÓN

- De acuerdo a los resultados obtenidos del PCR punto final, se concluye que,
el paciente N° 01 presenta la enfermedad de Marfan debido a que expone un
gen con 80 x 103 pb, el cual se encuentra por debajo del número de pares
bases con respecto al control positivo.
- Mientras que, el paciente N° 02 no presenta la enfermedad de Marfan,
porque expone un gen normal con el mismo número de pares de bases que
presenta el control positivo (230 x 103 pb) que es el gen normal.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Oliva N P, Moreno A R, Toledo G MI, Montecinos O A, Molina P J. Síndrome

de Marfán. Revista médica de Chile [Internet]. 2006 Nov;134(11). Available
from: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-
9887200600110001

2. Serrato Díaz A, Flores Rentería L, Aportela Cortez J, Palacios E. PCR:

reacción en cadena de la polimerasa [Internet]. 2018 [cited 2022 Nov 17].
Available from: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf

3. Morales P. ¿Qué es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR punto

final)? [Internet]. Blog | Biogenetix-Lab. 2020 [cited 2022 Nov 17]. Available
from: https://www.biogenetixlab.com/blog/que-es-pcr-reaccion-cadena-
polimerasa/#:~:text=Blog-