PRACTICA 4

PRACTICA DE PCR

I.- OBJETIVO

Lograr que el alumno conozca y sea capaz de explicar los principios básicos de la PCR,
y de la forma de realizar una amplificación estándar con el uso de un termociclador.

II.-INTRODUCCIÓN

2.1.- Fundamentos de PCR.

En 1983, el bioquímico Kary Mullis desarrolló la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
La PCR es una técnica que replica enzimáticamente al ADN in vitro, permitiendo que una
pequeña cantidad de moléculas de ADN (molde) sean amplificadas selectivamente de
manera exponencial.
El método comienza con la separación del ADN digerido por enzimas de restricción, los
fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante gel-electroforesis y luego se
transfieren a un filtro. El ADN adherido se desnaturaliza (sometiendo las doble cadenas
de ADN a alta temperatura lo que rompe los puentes hidrogenados que las mantienen
unidas) y se hibrida (o deja que se ligue) exponiéndolo a sondas radiactivas, lo que
permitirá detectar por rayos X los fragmentos de interés para su purificación y duplicación
en procedimientos de estudios o manipulación.
El sistema implica la adición de un cebador corto (un oligonucleótido) en cada extremo
de la secuencia elegida de ADN, separando las dos cadenas de la doble hélice por
calentamiento y exponiéndolas a un ADN polimerasa que reconoce a los cebadores
dispuestos a cierta distancia entre sí en lados opuestos de la cadena y duplica el número
de cadenas de ADN en la muestra. Esta enzima es obtenido a partir de una purificación
de una bacteria que prospera en las elevadas temperaturas de las aguas termales y que no
se desnaturaliza por temperatura cuando el ADN seleccionado lo es. De este modo en la
PCR, ambas cadenas de ADN se copian simultáneamente y si el procedimiento se repite
unas veinte veces, se obtendrán un millón de copias a partir de un solo fragmento original.

El primer paso crítico es la selección del ácido nucleico a partir del cual se amplificará la
secuencia de interés; a este ácido nucleico suele llamársele molde o templado. El paso
siguiente es la selección de primers, que dan la información previa necesaria de esa
secuencia blanco, tienen unos 18 a 25 nucleótidos de largo, que son específicos y
complementarios a las secuencias que flanquean el ADN blanco. Para reducir la
posibilidad de que los primers se enlacen en otros sitios del ADN que no sean los
deseados, es necesario tomar en cuenta varias consideraciones en su diseño:
• Composición de bases. El contenido de GC debe ser de 40 a 60%.
• Temperatura de fusión (Tm). Los valores de Tm calculados para los dos primers
usados juntos no debe variar en más de 5 °C.
• Secuencias terminales 3’. No deben ser secuencias complementarias a alguna
región del otro primer utilizado en la misma reacción
• Secuencias autocomplementarias. Deben evitarse repeticiones invertidas o
cualquier secuencia autocomplementaria de más de 3 pb de largo.

La PCR estándar consiste en una serie de ciclos de 3 reacciones sucesivas:

a. Desnaturalización. Temperatura de 93 a 95 °C para el ADN genómico.
 b. Alineamiento (annealing). A temperatura variable (entre 45 a 65 °C) de acuerdo
con la Tm de los primers. En esta fase los dos primers se hibridan con sus
respectivas secuencias complementarias en el molde.
c. Síntesis o polimerización. De manera característica alrededor de 70 a 75 °C. La
ADN polimerasa empleada es termoestable, por lo que no se afecta.

Las cadenas recién sintetizadas, sirven de moldes para la síntesis del nuevo ADN, lo que
da lugar a una reacción en cadena con un incremento exponencial del producto.
Una desventaja evidente de la PCR es el tamaño limitado de los productos de la
amplificación: es cada vez más difícil obtener una amplificación eficiente a medida que
aumenta la longitud del producto deseado. Hoy existen ADN polimerasas capaces de
amplificar fragmentos de hasta 30 kb
La PCR tuvo gran impacto en 4 áreas principales de la Biología Molecular: el mapeo de
genes, la clonación, la secuenciación de ADN y la detección de genes.
La PCR también ess utilizada como una herramienta de diagnóstico médico de
enfermedades infecciosas o para detectar mutaciones específicas que pueden causar
enfermedades genéticas, en las investigaciones criminales, en pruebas de paternidad y en
la secuenciación del genoma humano, por mencionar algunos usos
PROCESO
Esta técnica se divide en tres fases:
a. Desnaturalización: normalmente al tratarse de cadenas de ADN se separan por
acción del calor. En el caso del SARS al ser monocatenario no es necesaria esta
fase.
b. Acoplamiento: los cebadores se unen en lugar concreto del filamento de ADNc
(starting point), marcando así el inicio de la secuencia diana.
c. Extensión: la polimerasa ya comienza a trabajar y lo hace a partir de los primeros
nucleótidos de la secuencia diana y sus complementarios los cebadores.
LIMITACIONES
a. Esta prueba solo detecta el virus en el momento de la infección para saber si estaba
infectado días antes o si ha pasado la enfermedad se deberán realizar las pruebas
inmunológicas
b. No es una prueba rápida ya que requiere de varias horas (3-4) y, en esta época que
se necesitan los resultados rápidamente, es un gran inconveniente.
c. Pueden producirse falsos negativos o falsos positivos

2.2.- Técnicas para detección de virus SARS CoV2

El SaRS-CoV-2 es un virus con ARN positivo cubierto de una cubierta de glicoproteínas
y lípidos.
Los métodos de detección de virus respiratorios pueden clasificarse en tres: 1) Detección
del material genético del virus 2) Detección del virus como entidad individual, por de
antígenos virales. 3) Detección de los anticuerpos generados en el organismo infectado
(test serológico).

2.2.1.- Detección del material genético

Usa la técnica de PCR, y está basada en la amplificación de fragmentos de ADN mediante
ciclos consecutivos de incrementos y bajadas de temperatura, lo que permite, a partir de
pocas copias de material genérico, obtener grandes cantidades que pueden ser detectadas
mediante fluorescencia.
Como la enzima polimerasa solo puede copiar cadenas de ADN y no ARN se debe usar
una variación de la PCR estándar, la RT-PCR.
El ARN vírico es necesario primero convertirlo en ADN (por transcripción inversa, RT)
para a partir de entonces iniciar el proceso de PCR (lo que se llama RT-PCR). Una vez el
genoma de interés es secuenciado (como en el caso del SARS-CoV-2), es necesario
encontrar aquellas regiones únicas que lo diferencian de otros virus de la misma familia.
Se amplifica una parte concreta del ADN vírico transcrito cientos de miles de veces. La
importancia de la amplificación reside en que, en vez de intentar encontrar una cantidad
minúscula del virus entre millones de cadenas de información genética, se tiene una gran
parte de ADN vírico para confirmar con exactitud la presencia del virus.
El cóctel de reactivos donde se añade la muestra tratada contiene las sondas de
reconocimiento con marcadores fluorescentes. La reacción de PCR se realiza en
termocicladores con distintas prestaciones, habiendo multitud hoy en día, pudiendo en
algunos casos ser compactos y permitir la detección simultanea de varias muestras. En
términos generales, se identifica como resultados positivos a la presencia de ARN vírico
aquellas muestras que resulten en una señal fluorescente por encima de un umbral
determinado previamente y negativos aquellos con una fluorescencia menor.

Se toma una muestra de una de las partes del cuerpo donde se acumula el coronavirus,
por ejemplo, la nariz o la garganta; se le aplican diversas soluciones químicas para
eliminar ciertas sustancias, como las proteínas y las grasas, y se extrae solo el ARN de la
muestra. Este extracto de ARN consiste en una mezcla del material genético de la persona
y, de estar presente, del ARN del coronavirus.
Se procede a la transcripción inversa del ARN para convertirlo en ADN mediante una
enzima específica. A continuación, se añaden pequeños fragmentos de ADN que
complementan determinadas partes del ARN vírico. Esos fragmentos se adhieren a partes
específicas del ARN vírico, y sintetizan una cadena de ADN complementaria al ARN
vírico.
A continuación, se introduce esa combinación en un aparato de RT-PCR (termociclador),
donde se someten a ciclos de calor-frío para provocar determinadas reacciones químicas
que dan lugar a nuevas copias del ADN de origen vírico. Esos ciclos se repiten una y otra
vez para seguir copiando las partes específicas del ADN vírico. En cada uno de ellos se
duplican las cantidades: de dos copias, se pasan a cuatro; de cuatro, a ocho, y así
sucesivamente.
Un sistema habitual de RT-PCR suele constar de 35 ciclos, y al final del proceso se habrán
creado unos 35 000 millones de copias nuevas de las partes del ADN vírico. Este ADN
vírico, tiene marcadores que se acoplan a las cadenas de ADN y emiten una fluorescencia,
que la computadora del aparato presentará en la pantalla.

2.2.2.- Pruebas de antígeno

En este caso, la detección no es del material genético sino del virus entero. Generalmente
esta estrategia se basa en la detección de las proteínas estructurales como sería la proteína
S, en caso de detección completa del virus, o la proteína N, para detección de partes o
fragmentos del virus, mediante el uso de anticuerpos específicos. Una forma de detectarlo
es usar los llamados Tests Rápidos de Detección de Antígenos (RADTs). Esta
aproximación es sencilla, aunque muy dependiente de la disponibilidad de anticuerpos
específicos de cuya calidad dependerá una mayor especificidad y sensibilidad del análisis.
Hay actualmente varias casas comerciales que distribuyen anticuerpos para distintas
proteínas estructurales del SARS-CoV (principalmente la S y la N) que también
reconocen el nuevo virus SARS-CoV-2, con los que se están poniendo a punto distintos
tests de detección. Para el SARS-CoV-2, los más habituales se basan en ensayos de flujo
lateral o tiras reactivas (parecidos a los tests de embarazo). Suelen estar fabricados en
materiales adsorbentes (como derivados de celulosa) y contienen ya adsorbidos distintos
reactivos (como anticuerpos) que cuando entran en contacto con la sustancia diana,
conducen a un cambio visual detectable (cambio de color en la zona de detección). Los
pasos necesarios para realizar el test de detección de virus son:
a. Colección de la muestra del paciente (muestra nasofaríngea)
b. Mezcla con solución reactiva (generalmente anticuerpos específicos)
c. Transferencia directa de unas gotas de la mezcla en la tira reactiva y lectura de la
respuesta (visual generalmente) al cabo de pocos minutos en la zona de captura

Las técnicas inmunoquímicas pueden ser también llevadas a cabo en laboratorios

centralizados, como por ejemplo los inmunoensayos enzimáticos o luminiscentes
convencionales tipo ELISA, que en general ofrecen resultados más fiables, reproducibles
y sensibles y pueden ser automatizados.

2.2.3.- Pruebas serológicas

Se basan en la detección indirecta del virus, a través de la medida específica de los
anticuerpos generados por el organismo de la persona infectada. Ésta es útil cuando no es
necesario que la infección esté activa, por lo que es útil en estudios epidemiológicos, pues
permite medir los niveles de anticuerpos con el tiempo. Además, se puede diferenciar
entre distintos tipos de anticuerpos que se producen en las distintas etapas de la infección:
por ejemplo, inmunoglobulinas M (IgM) que se generan al principio, y representan un
proceso de infección aguda, y las inmunoglobulinas G (IgG), más abundantes, indicativos
de infección primaria o que aparecen como respuesta a la fase aguda de infecciones
secundarias. En definitiva, los tests serológicos pueden proporcionar información valiosa
respecto a una infección activa o a un contagio previo.
En estos tests, se pone en contacto el suero del paciente con los antígenos del virus de
manera que la presencia de anticuerpos en el suero es detectada. Los pasos necesarios a
llevar a cabo en los tests serológicos son:
a. Colección de muestra de paciente. Extracción de sangre (y separación del suero,
en algunos casos).
b. Transferencia directa al test y lectura de la respuesta (visual generalmente) al cabo
de pocos minutos en la zona de captura o detección

III.- MATERIALES REQUERIDOS

• Tubos de PCR de 0.2 mL
• Tubos de 1.6 mL estériles
• Micropipetas y puntas de 200, 20 y 2 mL
• Muestra de ADN molde (se recomienda un ADN plasmídico con un inserto que
pueda ser amplificado con primers comerciales universales como los derivados
de secuencias de M13)
• Agua Milli-QTM estéril
• Buffer de PCR 10x con MgCl2 15 mM
• Mezcla de dNTP’s (a una concentración de 10 mM de cada uno: dATP, dCTP,
dGTP, dTTP)
• Primer 5’ a una concentración de 50 mM
• Primer 3’ a una concentración de 50 mM
• Taq ADN polimerasa a una concentración de 5 U/mL
• Hielo/contenedor
 • Termociclador
• Vórtex
• Agarosa grado Biología Molecular
• Buffer TBE 0.5x (preparado previamente)
• Buffer de carga 5x (preparado previamente)
• Marcadores de peso molecular
• Cámara de electroforesis horizontal
• Fuente de poder
• Parafilm
• Transiluminador
• Fotodocumentador

IV.- PROTOCOLO

4.1.- Aplicación de la técnica de PCR

• Rotular 4 tubos de PCR de 0.2 mL: dos para la reacción de PCR problema en
duplicado y otros 2 para el control negativo en duplicado (con agua Milli- QTM
en lugar del ADN). Mantener siempre los tubos en hielo hasta colocarlos en el
termociclador
• Descongelar en hielo el buffer de PCR, los dNTP’s, los primers y el ADN.
Mantener el agua Milli-QTM en hielo. Agitar con vórtex a los reactivos, pero no
el ADN ni la enzima.
• Sacar la polimerasa del congelador al momento de usarla y mantenerla en hielo
siempre. Regresar la polimerasa al congelador inmediatamente después de usarla.
• En un tubo de 1.6 mL nuevo estéril y sobre hielo, agregar los ingredientes para
hacer el coctel de reacción para las 4 reacciones (problema y control negativo en
duplicado), considerando una reacción adicional para que no falte. Seguir el orden
indicado comenzando por el agua, omitiendo el ADN y terminando por la
polimerasa. Agitar con vórtex antes de agregar la polimerasa. Después de agregar
la polimerasa, mezclar por inversión sin usar vórtex.
• Distribuir en cada tubo el ADN y después el coctel de reacción.
• Mezclar los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo y dar un
pulso en la centrífuga a los tubos durante 2 segundos para hacer que el líquido
quede en el fondo del tubo y se mezclen todos los componentes.
• Programar el termociclador con las condiciones de amplificación necesarias.
• Visualizar el fragmento de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % a
85 V por 45 min.

4.2.- Detección de virus

Una vez tenemos el ADNc empezaremos a amplificarlo.

Elementos necesarios para el proceso:
a. ADNc como plantilla. Se localiza la fracción de nucleótidos característicos del
SARS-CoV-2 que queremos determinar
b. Los cebadores o primers (secuencia complementaria de nucleótidos) que se unirán
a las zonas terminales del ADNc a determinar. Estos cebadores marcaran cada
origen de los fragmentos de la secuencia diana.
c. Ciertas cantidades de las cuatro clases diferentes de desoxinucleótidos trifosfato
(dNTP), que serán los que se irán añadiendo para formar las copias de la región
de ARN transformado en ADNc a determinar.
Estas cadenas serán la materia prima para sintetizar el resto de copias.
• Debemos tener una solución tampón y debe incluir ion magnesio, y enzima
polimerasa.
• Con estos factores en un tubo se generará copias de la región deseada de la cadena
original de ADNc.
• De la cadena original se hará una copia complementaria a la primera y habrá dos.
• En el segundo ciclo la DNA-polimerasa volverá a sintetizar a partir de estas,
teniendo cuatro.
• En un tercer ciclo tendremos ocho copias y así sucesivamente.
• Con tantas copias tendremos la secuencia diana en una alta concentración que
puede detectarse con varias técnicas como espectrofotometría o electroforesis.

V.- OBSERVACION DE VIDEOS

• PCR de paternidad
https://www.youtube.com/watch?v=ygxIM_0aI4w

• PCR
https://www.youtube.com/watch?v=tPtM78RVLM8

• Técnicas para detección del virus

https://www.youtube.com/watch?v=WO0Bji0dJyA

• Prueba molecular (PCR) de coronavirus

https://www.youtube.com/watch?v=KWc4638GPdw

VI.- CUESTIONARIO
1.- Que es la amplificación de un trozo de ADN
2.- En ingeniería genética para que se hace la amplificación del ADN
3.- Para se calienta el medio en la técnica de PCR
4.- Que función cumplen las enzimas taq, y ADN ligasa en la técnica de PCR
5.- A qué se debe el nombre de Taq de la ADN polimerasa utilizada
6.- Por qué es necesario tener un primer a cada extremo del segmento del ADN a
amplificar
7.- Cual es el material genético del SARS-COV2
8.- Describa los pasos que sigue el SARS-COV2 para replicarse una vez que esta dentro
de una célula infectada
9.-Qué diferencia hay entre las técnicas rápidas de diagnóstico de SARS-COV2, de
antígeno y serológica
10.- En una prueba de paternidad, como se conoce la relación de familiaridad entre padre
e hijo.