Biotecnología Molecular Animal y Vegetal

Informe de Prácticas

Ejercicios Diseño de cebadores (primers) para PCR

Nombre y Apellidos:
1.

2.

3.

4.

1
 1. Diseño de primers para diagnóstico de una enfermedad genética:
expansión de trinucleótidos:
Huntington’s Desease
La enfermedad de Huntington (Huntington’s Desease, HD) es una enfermedad neurodegenerativa
hereditaria, caracterizada por la disfunción gradual e irreversible de funciones fisiológicas, motoras y
cognitivas. Los síntomas aparecen típicamente a partir de los 30 años y pueden progresar durante 20 años
más. La mutación genética que provoca la HD ha sido asignada a un gen, de función desconocida. En
individuos sanos que no desarrollarán la enfermedad, el gen de la HD contiene en su parte 5’, la que
codifica para el extremo amino terminal de la proteína, una secuencia de codones CAG (para glutamina,
Gln, Q) que está repetida consecutivamente entre 6 y 39 veces. La proteína HD contiene por tanto una
secuencia poli-glutamina en su dominio amino-terminal. En individuos que desarrollarán la enfermedad en
la edad adulta, este codón se repite entre 40 y 55 veces, típicamente. En individuos que desarrollarán la
enfermedad en la infancia, este codón se repite más de 70 veces. Por tanto, la longitud de esta repetición
simple de trinucleótido indica si un individuo desarrollará HD, y a qué edad aparecerán los síntomas
aproximadamente.
Se muestra en la figura una pequeña porción de la secuencia codificante amino-terminal del gen HD, de
3.143 codones, con la repetición CAG sombreada, codificadora para la región poli-glutamina. Nota que la
región de poli-glutamina va seguida de una región de poli-prolina, que no se expande y no se asocia a la
enfermedad. (Tomado de Lehninger Principles of Biochemistry, fourth edition, chapter 9)

307 ATG GCG ACC CTG GAA AAG CTG ATG AAG GCC TTC GAG TCC CTC AAG TCC TTC CAG CAG TTC

M A T L E K L M K A F E S L K S F Q Q F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

367 CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG

Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q..

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

427 CAG CAG CAG CAG CCG CCA CCG CCG CCG CCG CCG CCG CCG CCT CCT CAG CTT CCT CAG CCG

Q Q Q Q__ P P P P P P P P P P P Q L P Q P

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

1.1 Basándote en la secuencia dada, diseña dos oligonucleótidos de 21 nucleótidos que sirvan
como cebadores/primers en una reacción de PCR para realizar un test de diagnóstico para HD.
Puedes utilizar el software: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Primer directo:
2
Primer reverso:

1.2. Indica la longitud, o rango de longitudes, que tendrá el producto de PCR en el test de Huntington si el
individuo es y será sano (respecto a HD).

1.3. Indica la longitud que tendrá el producto de PCR en el test de Huntington si el individuo va a
desarrollar la enfermedad en la edad adulta.

1.4 Indica la longitud que tendrá el producto de PCR en el test de Huntington si el individuo va a
desarrollar la enfermedad durante la infancia.

En la reacción de PCR utilizamos la misma polimerasa que hemos usado en prácticas de BTMAV, la Phusion
Flash Hot Start DNA Polymerase de ThermoFishcerScientific:
Usando www.thermoscientific.com/pcrwebtools calcula:

Tm de primer directo

Tm de primer reverse

Temperatura de Annealing recomendada para la reacción de PCR con este par de primers:

Utiliza las herramientas disponibles en: https://eu.idtdna.com/site/account/login?returnurl=%2Fcalc

%2Fanalyzer para analizar:
Posibles apareamientos entre
primer directo con primer directo,

primer directo con primer reverso

primer reverso con primer reverso

Posibles estructuras secundarias de primer directo

Posibles estructuras secundarias del primer reverso.

(Usa la aplicación BLASTA en bases de datos de genoma humano (no transcriptos) para determinar 5 o
menos:
Posibles hibridaciones inespecíficas de primer directo con otras zonas del genoma humano

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer reverso con otras zonas del genoma humano

3
 2. Diseño de primers para diagnóstico de una enfermedad genética:
mutación puntual:
Anemia falciforme

2.1 Basándote en la secuencia dada en la figura, diseña tres primers de 21 nucleótidos (nota que los
primers de la figura tienen 14 y 16 nucleótidos) que sirvan como cebadores en una reacción de PCR para
realizar un test de diagnóstico para Anemia falciforme. Necesitas dos primers directos, uno específico para
cada alelo, y otro reverso.

4
Primer directo 1: (amplifica genoma wild type):

Primer directo 2: (amplifica genoma con mutaciónde anemia falciforme):

Primer reverso:

2.2. Indica la longitud que tendrá el producto de PCR en este test de anemia falciforme.

Usando www.thermoscientific.com/pcrwebtools calcula:

Tm de primer directo 1:

Tm de primer directo 2:

Tm de primer reverso:

Temperatura de Annealing recomendada para la PCR con primer directo 1 y primer reverso:

Temperatura de Annealing recomendada para la PCR con primer directo 2 y primer reverso:

Usa https://eu.idtdna.com/site/account/login?returnurl=%2Fcalc%2Fanalyzer para caracterizar:

Posibles apareamientos entre

primer directo 1 con primer directo 1,

primer directo 1 con primer reverso

primer reverso con primer reverso

Posibles estructuras secundarias de primer directo 1

Posibles estructuras secundarias del primer reverso.

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer directo 1 con otras zonas del genoma humano (máximo 5)

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer reverso con otras zonas del genoma (máximo 5)

5
 3. Diseño de primers para diagnóstico de una enfermedad genética:
deleción de nucleótidos y cambio de pauta de lectura.
Waardenbrug syndrome

Nota: El Primer 1 en la figura original está mal alineado con el ADN genómico. Se ha superpuesto el mismo primer
sobre la secuencia correcta (desplazado tres nucleótidos, un codón)

3.1 Basándote en la secuencia dada en la figura, diseña 2 primers de 21 nucleótidos (nota que los primers
de la figura tienen 24 nucleótidos) que sirvan como cebadores en una reacción de PCR para realizar un test
de diagnóstico para el síndrome de Waardenbrug.

Primer directo:

Primer reverso:
6
3.2. Indica la longitud que tendrán los productos de PCR en el test de Waardenbrug si el individuo es sano.

3.3. Indica la longitud que tendrán los productos de PCR en el test de Waardenbrug si el individuo es
enfermo.

En la reacción de PCR utilizamos la misma polimerasa que hemos usado en prácticas de BTMAV, la Phusion
Flash Hot Start DNA Polymerase de ThermoFishcerScientific:
Usando www.thermoscientific.com/pcrwebtools calcula:
Tm de primer directo:

Tm de primer reverse:

Temperatura de Annealing recomendada para la reacción de PCR:

Posibles apareamientos entre:

primer directo con primer directo,

primer directo con primer reverso

primer reverso con primer reverso

Posibles estructuras secundarias de primer directo

Posibles estructuras secundarias del primer reverso.

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer directo con otras zonas del genoma humano

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer reverso con otras zonas del genoma humano

7
 4. Diseño de primers para detección de un transgén en maíz transgénico MON810:
4.1 detección de Cry1AB de B. thuringiensis
4.2 detección de CaMV Enhanced 35S promoter del virus del mosaico de la coliflor
Info: Patent of Monsanto MON810, 2010 (Clikar para abrir el pdf)

8
 http://bch.cbd.int/database/record.shtml?documentid=14750
Modified Organism MON-ØØ81Ø-6 - YieldGard™ maize
The transgenic maize line MON810 was genetically engineered to resist ECB by producing its
own insecticide. This line was developed by introducing a synthetic version of the cry1Ab
gene, isolated from the soil bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) which was modified to
enhance the expression of the Cry1Ab protein in plants, however the resulting amino acid
sequence is identical to the native protein.
Molecular studies demonstrated that a single truncated copy of the cryIAb coding sequence
was integrated into the corn genome along with the enhanced cauliflower mosaic virus 35S
promoter (P-e35S), and the hsp 70 intron (I-Hsp70). The nos terminator was not integrated
into MON810 due to a truncation of the 3' end of the gene cassette. Western analysis
confirmed that a truncated Cry1Ab protein of approximately 91 kD (native Cry1Ab had a
molecular weight of approximately 131 kD) was inserted into the genome.
Corn event MON 810 was produced by microprojectile bombardment of embryogenic corn
tissue with plasmids PVZMBK07 and PV-ZMGT10. However, plasmid vector PV-ZMGT10 was
not integrated into the plant genome. Further Southern blot analysis indicated that the genes
for glyphosate tolerance (CP4 EPSPS) and antibiotic resistance (neo) were not transferred to
line MON 810 and the absence of the CP4 EPSPS and gox gene products was also confirmed
by Western blotting. The CP4 EPSPS and GOX protein encoding genes were presumed to have
been inserted into the initial transformant at a separate genetic loci from the cry1Ab gene
and then subsequently lost through segregation during the crossing events leading to line
MON810.
Southern analysis confirms that the nptII gene (originally present in PVZMBK07 and PV-
ZMGT10) is not present in MON 810.
Genetic elements construct:

Cauliflower mosaic virus Zea mays Bacillus thuringiensis

CaMV Enhanced 35S promoter Hsp70 intron Cry1Ab

   
#100366 #100359 #14985

0.61 Kb 0.80 Kb 3.46 Kb

https://
https://
www.ncbi.nlm.nih.go https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
www.ncbi.nlm.nih.gov/
v/nuccore/ nuccore/AY326434.1
nuccore/JX139718.1
JX139718.1

9
4.1.1 Indica las secuencias del primers directo y primer reverso para amplificar el gen cry1Ab, dadas en
el Guión de Prácticas:

Primer directo:

Primer reverso:

4.1.2. Indica la longitud que tendrá el producto de PCR del gen cry1Ab integrado en el genoma de
MON810.
Básate en la secuencia del gen Cry1Ab (búscala en GenBank), y en las secuencias de los primers directo y
reverso utilizados en la PCR

Usando www.thermoscientific.com/pcrwebtools calcula:

Tm de primer directo:

Tm de primer reverse:

Temperatura de Annealing recomendada para la reacción de PCR:

Posibles apareamientos entre

primer directo con primer directo,

primer directo con primer reverso

primer reverso con primer reverso

Posibles estructuras secundarias de primer directo

Posibles estructuras secundarias del primer reverso.

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer directo con genoma de Zea mays (las 5 más probables)

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer reverso con genoma de Zea mays (las 5 más probables)
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4.2.1. Diseño de primers para detección de CaMV Enhanced 35S promoter en maíz transgénico MON810.
Basándote en la secuencia del promotor CMV35S (búscala en GenBank), diseña dos primers de 21
nucleótidos que sirvan como cebadores directo y reverso en una reacción de PCR para detectar una planta
transgénica que contenga este promotor.

Primer directo:

Primer reverso:

4.2.2. Indica la longitud que tendrá el producto de PCR del promotor CaMV Enhanced 35S promoter
integrado en el genoma de MON810 usando tus primers.

Usando www.thermoscientific.com/pcrwebtools calcula:

Tm de primer directo:

Tm de primer reverse:

Temperatura de Annealing recomendada para la reacción de PCR:

Posibles apareamientos entre

primer directo con primer directo,

primer directo con primer reverso

primer reverso con primer reverso

Posibles estructuras secundarias de primer directo

Posibles estructuras secundarias del primer reverso.

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer directo con genoma de Zea mays (máximo 5)

Posibles hibridaciones inespecíficas de primer reverso con genoma de Zea mays (máximo 5)

11
 5. Interpretación de resultados de la práctica

Después de las prácticas, al fin llega el momento de ver interpretar los resultados de los diferentes
granos de maíz (WT o MON810).

Obtenéis la siguiente imagen de la electroforesis de los distintos amplicones

(El carril de la derecha es un marcador de tamaño de ADN lineal de doble cadena).

1 2 3 4 5 6 7 M

Justifica qué muestra hay en cada carril.

Las posibilidades que existen o pueden existir son las siguientes:
transgénico, silvestre, muestras donde ha fallado una de las parejas de los primers y el blanco.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

FIN del Informe de Prácticas.

12
Información adicional

Parámetros a tener en cuenta en el diseño de pares de cebadores para PCR

Wrong pair of primers:

complementarity in their 3’ends -> formación de“primer dimer” PCR product.
No obtenemos amplificación de la secuencia diana porque los primers se consumen en la formación de
dímeros de primers, no porque la secuencia diana no exista: tenemos un falso negativo.

Good pair of primers:

No complementarity, no possibility of hybridization between them.
Similar GC content, not bigger than 50%,
Similar length
similar melting temperature (Tm)
(annealing step in PCR should be just 2 - 5 ºC lower than that of primers Tm.
No self-complementary sequences (formation of hairpins)

13
Oligonucleótidos de ADN:
Los usamos como cebadores en reacciones de PCR y de secuenciación, como oligonucleótidos antisentido
(ASO) (https://www.youtube.com/watch?v=nRHypCupg0A) (https://www.youtube.com/watch?
v=wn5K_vPU_24 , como “donadores” en edición génica mediante CRISPR-Cas9 , en mutagénesis dirigida
“in vitro”, etc.
Todos son sintetizados químicamente ≡ síntesis química de material genético.
Síntesis química de oligonucleótidos de DNA
The synthetic production of oligonucleotide primers. The production of 5’- AT-3´.

Phophoramidite nucleosides are modified with a dimethoxytrityl protecting group on the 5’-end (red) and
a β-cyanoethyl protected 3’-phosphite group (blue). Additionally, other modifiers (green) protect primary
amines occurring elsewhere in the molecule.
Vídeo
https://www.youtube.com/watch?v=kjSojZWnPQ4

14
Pasos de una reacción de PCR

Los oligonucleótidos actúan como cebadores (primers) o sitios de iniciación, directo o reverso, para la
replicación de ADN.
Los oligonucleótidos son sustratos de la reacción de PCR, y quedan incorporados al producto de la
reacción o amplicón → cuando se acaban los primers se acaba la reacción de amplificación → la
concentración máxima de producto (de amplicón) viene dada por la concentración de primers en la
reacción → si la concentración de primers en la reacción es 5 µM, la concentración máxima posible del
amplicón será 5 µM → no por hacer más ciclos de PCR obtendremos más producto.
Cada amplicón producido en un ciclo es usado como ADN diana en el siguiente ciclo.
La cantidad de amplicón solo es proporcional a la cantidad de ADN diana amplificado en la muestra en los
primeros ciclos de la reacción (PCR cuantitativa).
La cantidad de amplicón NO es proporcional a la cantidad de ADN diana amplificado en la muestra en los
últimos ciclos de la reacción, cuando todos los primers ya se han incorporado a los amplicones (PCR no
cuantitativa).

15
A partir de 1 única molécula de ADN diana en la muestra, en una reacción de PCR de:
29 ciclos se obtienen > 500 millones de amplicones (copias del ADN diana)
30 ciclos se obtienen más de 10 9 = mil millones (= un billón anglosajón ) de amplicones
(Siempre y cuando hallamos puesto mil millones de moléculas de cada primer en la reacción de PCR).

16
En un fragmento de ADN que contiene la parte codificante de un gen:
El Primer 1 o directo tiene la misma secuencia que la secuencia que la cadena “sentido” o codificante y se
unirá a la cadena antisentido o no codificante.
El primer 2 o reverso tiene la misma secuencia que la que la secuencia antisentido o no codificante, e
hibrida con la secuencia sentido o codificante.

17
18
El incremento en la concentración de Mg2+ hace que la polimerasa de ADN, polimerasa Taq en este caso,
haga más errores al incorporar nucleótidos, resultando en la producción de más productos inespecíficos.
Esto se puede utilizar para crear mutaciones al azar en los amplicones.

19
La actividad 5’-3’ exonucleasa permite usar sondas TaqMan® en PCRs cuantitativas.
La sonda será degradada 5’ a 3’ por la ADN polimerasa y sustituida por nueva cadena de ADN. La
degradación de la sonda TaqMan® libera fluorocromo de la sonda que y se mide la fluorescencia en cada
ciclo de la PCR.

Actividad de corrección o “Proof Reading”.: Los errores en incorporación de bases no afectan a

experimentos de detección, pero sí a los de clonación y expresión.

“Terminal transferase activity”: incorpora un dAMP al extremo 3’–OH de la cadena: El producto de PCR
tiene extremos 3’A protuberantes.

Leen la Inosina en la cadena molde: YES NO.

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