GTPasa

GDP

Pi

GAP
Proteínas G monoméricas GTP

(GTPasas pequeñas) GEF

GDP

GTPasa
GTP

Facultad de Ciencias, UNAM. Diciembre 2020 Profesor invitado: Dr. Jorge carretero Ortega
 ORGANIZACIÓN DE LA PRESENTACIÓN

• Generalidades.
• Ciclo de las GTPasas pequeñas
• Estructura y funciones
• Reguladores de las GTPasas
• Modificaciones postraduccionales
• Superfamilia de Ras
• Rho Rac y CdC42 en el rearreglo del citoesqueleto de actina
• Métodos de detección de GTPasas
 Generalidades
• Son monómeros de bajo peso molecular. Sus pesos moleculares oscilan entre 18-28 kDa. Son
consideradas switches moleculares.

• Presenta alta afinidad por nucléotidos de guanina (GDP o GTP).

• Tiene actividad intrínseca de GTPasa.

• La GTPasa Ras fue la primera G pequeña descubierta en los 80s. Se identífico como un
oncogen.

• Se han identificado alrededor de 150 miembros en eucariontes divididos en 5 familias.

• La mayoría sufre modificaciones postraduccionales lipídicas que le confieren una localización

subcelular específica.
GTPasas pequeñas como switches moleculares
El ciclo de las GTPasas
El ciclo de las GTPasas
Las GTPasas pequeñas controlan la transducción de señales
externas a efectores citoplasmáticos y nucleares.
Estructura
 Reguladores de GTPasas pequeñas

Factores Intercambiadores de
nucleótido de Guanina

Proteínas Activadoras de la
actividad de GTPasa

Inhibidores de la disociación de
nucleótido de Guanina
Rho GEFs
Modificaciones postraduccionales de GTPasas pequeñas
Modificaciones postraduccionales de GTPasas pequeñas
Modificaciones postraduccionales de GTPasas pequeñas
La superfamilia de Ras
EGFR signaling
(Ras/PI3K/ERK pathway) EGF CR1 EGF

Y845 Y845
P

Kinase
aPKCζ

Kinase
Y891 Y891

PI3K Y920 Y920

Y992 Y1045 Y1045 pY992

p70 S6K
P
PDK
Y1086 Y1068 Y1068 Y1086

Y1173 Y1148 Y1148 Y1173

Grb2
SOS
Ras
P
P
S473
T308 Raf

Raptor
mTOR PKB P
Mek 1/2
GβL

P
Erk 1/2

P P P
P P

Ets SRF Elk AP-1 AP-1

 La superfamilia de Ras

Familia Isoformas Principal función

Ras Expresión génica
39
Rat sarcoma virus Oncogénesis

Rho Reorganización del

22
Ras homologous citoesqueleto

Rab
Ras-like proteins in
63
brain Transporte vesicular
30
Arf (ADP-ribosylation
factor)
Ran
Transporte núcleo-
Ras-like nuclear protein 1
citoplasma
GTPasas de la familia de Rho: Rho, Rac y Cdc42
Importancia del estudios de las GTPasas de la familia de Rho

Metástasis
Angiogénesis

Cono de crecimiento
axonal Embriogénesis Movimiento de neutrófilos
Importancia del estudios de las GTPasas de la familia de Rho

Movimiento de neutrófilos
GTPasas de Rho y el rearreglo del citoesqueleto de actina

Rac Cdc42 Rho

GTPasas de Rho y el rearreglo del citoesqueleto de actina
Rac y Cdc42
Rho
Cono de crecimiento axonal
Movimiento celular colectivo
 Métodos de detección de actividad de GTPasas pequeñas
Precipitación por afinidad (pulldown)
 Métodos de detección de actividad de GTPasas pequeñas
FRET: Fluorescence resonance energy transfer
 EJEMPLO DE UN REGULADOR DE
LA ACTIVIDAD DE LA GTPasa RAC
El GEF P-Rex1 modula la actividad de Rac a través del receptor CXCR4
 VEGF Estrategia Experimental SDF-1

PIP3
β γ αi
GTP
Xho I EcoR I

shP-Rex1
Xba I

BamH I

shScr
pENTR shRNA
WB:

P-Rex1

P-Rex1
DH PH DEP DEP PDZ PDZ
RT-PCR
CXCR4, P-Rex1.

Rac GTP
Migración celular

Expresión P-Rex1 Angiogénesis

GRACIAS
Activación de Rac.
Rac
GDP Y
Esferas
Glutation GST PBD
sefarosa Rac
X Rac GTP
GTP
HMEC
Lisados celulares Ensayo de precipitación por afinidad

Rac
GTP

SDF-1

P-Rex1 Rac
GTP
 P-Rex1 participa en la activación de Rac en células HMEC

shScr shP-Rex1

VEGF - - 1’ - - 1’
SDF-1 - 5’ - - 5’ - 160
WB:
140

Relative Rac activation (%)

Rac-GTP
120
Rac1
100

80 *
P44/42 MAPK
60
ERK2
40

P-Rex1 20

0 B SDF-1 VEGF B SDF-1 VEGF

GAPDH
shScr shP-Rex1

SDF-1

P-Rex1 Rac
GTP
Experimento de quimiotaxis

HMEC

Incubación 37°C

Tinción de células
 120

SDF-1 SDF-1
100

Relative Cell Migration (%)

*
80

60

40

20

0
B 50 100 200 FBS VEGF B 50 100 200 FBS VEGF

shScr shP-Rex1

SDF-1

P-Rex1 Rac Migración

GTP
Experimento de angiogénesis in vitro

Preparación de matrigel
Carga del matrigel Incubar 1h 37°C

Cordones
Observar la formación de
cordones Cargar células
 shScr shP-Rex1

Basal
SDF-1

SDF-1

shScr
FBS

shP-Rex1

SDF-1

P-Rex1 Rac Migración Angiogénesis

GTP