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Anlisis de Paternidad Usando Cibertorio

Arboleda Franco1; Cabrera Juan1; Pillajo Jssica1

1Escuela Politcnica Nacional, Facultad de Ingeniera Qumica y Agroindustria, Quito,

Ecuador

Resumen: El objetivo de la presente prctica fue determinar la paternidad de 4 postulantes, utilizando el mtodo de
electroforesis virtual. Este ensayo se basa en el anlisis de marcadores polimrficos realizando una amplificacin
por PCR (reaccin de cadena polimerasa) y separar estos fragmentos amplificados por electroforesis. Realizada la
separacin, se compar los patrones de banda del hijo, la madre y los 4 postulantes (posibles padres). La banda que
ms se asemej a la del hijo fue la del segundo candidato. El segundo postulante es el padre.

Palabras clave: Electroforesis virtual, PCR, anlisis paternidad, marcadores polimrficos.

Paternity test using Cibertorio

Abstract: The objective of the present practice was to determine the paternity of 4 postulants, using the virtual
electrophoresis method. This assay is based on the analysis of polymorphic markers by performing PCR
amplification (polymerase chain reaction) and separating these amplified fragments by electrophoresis. After
separation, the band patterns of the child, the mother and the 4 candidates (potential parents) were compared. The
band that most resembled that of the son was that of the second candidate. The second postulant is the father of the
child.

Keywords: Virtual electrophoresis, PCR, paternity test, polymorphic markers.

puentes de hidrgeno y as las bases complementarias

1 1. INTRODUCCIN
La reaccin en cadena de la polimerasa cuyas iniciales en
ingls son PCR fue desarrollada por el Doctor Kary Mullis en
el ao de 1993, la PCR es una tcnica que reproduce in vitro
y en pocas horas el proceso de amplificacin del ADN,
multiplicando de forma exponencial una secuencia de ADN
a partir de cantidades pequeas de muestra, que son
segmentos de la cadena. Sus requerimientos son que existan
nucletidos en el medio que son la materia base para fabricar
el ADN (adenina, timina, citosina y guanina), y una pequea
cadena de ADN que pueda unirse a la molcula que
queremos copiar para que sirva como cebadora. (UNED,
2000)
Se divide en tres etapas, las cuales estn en dependencia
directa con la temperatura:
- Desnaturalizacin: El ADN de doble cadena es
desnaturalizado comnmente calentando la muestra a
94C por un tiempo aproximado de 30 segundos, con
esto se logra que las cadenas se separen al romperse los
son separadas.
- Hibridacin: Se baja la temperatura de reaccin a 50-
70C, de forma que pequeas secuencias de DNA de
cadena sencilla se unan a secuencias complementarias
del ADN diana.
- Sntesis de ADN: tpicamente a 70-75 o C, comienza a
funcionar la replicacin incorporando nucletidos sobre
los primers y haciendo una copia completa y exacta de la
cadena molde. (Greif, 2012)
Estas tres etapas conforman un ciclo, el mismo que puede
repetirse varias veces y as obtener millones de copias del
fragmento de inters.
Las tres etapas de la amplificacin de AND por PCR se
muestran en la Figura 1, presentada a continuacin:

jessica.pillajo@epn.edu.ec
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Figura 1. Reaccin en cadena de la Polimerasa. (Duoc, 2014)
La amplificacin por PCR es una tcnica ampliamente usada
en la ingeniera gentica, entre sus aplicaciones se
encuentran:
- Diagnstico, pronstico y tratamiento de enfermedades
oncolgicas. (Sanz, 2013)
- Biotecnologa y ciencias agropecuarias
- Secuenciacin de ADN
- Estudiar la evolucin de las secuencias de un gen y los
efectos de variabilidad de la secuencia en la funcin del
cromosoma.
- Diagnstico prenatal, entre otras. (Cortzar y Silva,
2004)
Otra forma de analizar la paternidad es la determinacin del
grupo sanguneo que se realiza segn la presencia o ausencia
de protenas A, B o factores Rh presentes en los glbulos rojos,
esta prueba permite asegurar cuando una persona no es el padre,
sin embargo no prueba cuando lo es. (Bravo, 2009)
2. METODOLOGA
Se ingres a la direccin indicada en la gua de laboratorio
http: //biomodel.uah.es/lab/cibertorio/start.htm, se inici el
Cibertorio y se realiz el pedido de muestras para ensayo de
paternidad el cual contena: el ADN de un hijo (H), ADN de
la madre (M), ADN de cuatro posibles padres (P1, P2, P3,
P4), cebadores de PCR (D3, D8, D18, D21), reactivo (PCR
mix). Una vez que se hizo la compra, en el laboratorio de
reacciones se tom la micropipeta, se tom 20L de la
muestra de H y se coloc en un tubo y se repiti el proceso
con las muestras M, P1, P2, P3 y P4 en diferentes tubos. Paso
seguido en cada uno de los tubo se coloc 5L de la muestra
PCR mix, luego en cada tubo se coloc 1 L de cada uno de
los cuatro cebadores D3, D8, D18, D21, enseguida se agreg
21L de agua en cada uno de los tubos. Finalmente se
incubaron las muestras.
Se ingres al laboratorio de Electroforesis, se seleccionaron
los siguientes parmetros: autocarga de la muestra, gel de
poliacrilamida 5% , si fij el tiempo en 1hora 10 minutos y
el voltaje en 300 voltios, se apag la luz y se encendi la luz
UV y se procedi a realizar la separacin. Se observ que las
bandas se separaron a lo largo del gel.
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
Figura 1. Anlisis electrofortico de 4 muestras diferentes de
ADN amplifacados por PCR.
En la Figura 1 se puede identificar que los 4 marcadores STR
amplificados se encuentran divididos mediante el uso de un
anlisis electrofortico, esta divisin se da debido a que la
amplificacin del ADN provoca la adicin de nucletidos
libre a las hebras de estos, esto depende del tipo de cadena
nucleotdica que presente cada muestra. De esta manera se
puede determinar, de acuerdo a una comparacin en la
separacin del ADN amplificado del hijo y de los 4 posibles
padres, cual es el candidato que presenta mayor probabilidad
de ser el padre.
En la Figura 1 se puede apreciar 6 columnas separadas de las
muestras de ADN, la primera columna pertenece al ADN
materno, la segunda columna pertenece al ADN del hijo, la
tercera, cuarta, quinta y sexta columna pertenecen a los 4
posibles padres. Al comparar la columna del hijo con la
columna tercera, cuarta, quinta y sexta, se ha logrado
confirmar que se da un mayor nmero de coincidencias con
la columna perteneciente al segundo candidato, el cual es el
padre.
Otros tipos de anlisis de paternidad:
PCR anidada
Tcnica en la que el producto de una amplificacin es
utilizado como molde para realizar una segunda
amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el
primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de
nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial.
PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones
histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR
in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y
luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional
con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse
cantidades pequesimas de genoma.
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PCR mltiple
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una
secuencia. Para ello, se combinan dos o ms pares de
cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los
reactivos de la reaccin en cantidades suficientes, para
amplificar simultneamente varios segmentos de ADN.
id=153e8941-e2ee-4032-9b68-
b0408ff3ed67&groupId=10157. (Agosto, 2017)
[6] UNED. (2000). Reaccin en cadena de la
polimerasa. Obtenido de: http://cosmolinux.no-
ip.org/uned/pcr.pdf (Agosto, 2017)

RT-PCR
Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es
sensible al calor, es necesario hacer una transcripcin reversa
(RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR. La
transcripcin reversa genera una copia de la hebra de ARN,
pero esta copia es ADN complementario (ADNc o DNAc en
ingls) el cual es estable al calor y puede resistir la
metodologa PCR.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite
cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la
muestra original, o para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su
temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del
ingls melting temperature).
A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que
mide la acumulacin del ADN al final de un nmero
predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el
proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que
su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada.
(Glick y Pastermark, 2003, pp. 78-82)

4. CONCLUSIONES

REFERENCIAS

[1] Bravo, M. (2009). La verdad gentica de la

paternidad. Colombia: Universidad de Antioquia.

[2] Cortzar, A. & Silva, E. (2005). Mtodos Fsico-

Qumicos en Biotecnologa. Obtenido de:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf
(Agosto, 2017)

[3] Duoc, U. (2014). Hongos en PCR. Obtenido de:

https://es.slideshare.net/Arratiaa/hongos-en-pcr
(Agosto, 2017)

[4] Greif, G. (2012). PCR: Reaccin en cadena de la

polimerasa. Obtenido de:
http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_
bacterias/reaccion_en_cadena_polimerasa.pdf
(Agosto, 2017)

[5] Sanz, J. (2013). Tcnicas de amplificacin.

Fundamento terico. PCR. Obtenido de:
https://www.seap.es/c/document_library/get_file?uu