PRUEBA DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (NAT)

FUNDAMENTO
El fundamento de la prueba de determinación de ácidos nucleicos, también conocida como
Prueba de Amplificación de Ácidos Nucleicos (NAT), radica en la detección y amplificación de
secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) presentes en una muestra.

El procedimiento básico es el siguiente:

Diseño de sondas: Se diseñan sondas que son complementarias a la secuencia de ácidos

nucleicos que se desea detectar.

Amplificación: Se utilizan técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el

ensayo de desplazamiento de cadena (SDA) o el ensayo mediado por transcripción (TMA) para
amplificar la secuencia objetivo, es decir, hacer muchas copias del material genético.

Detección: Las sondas diseñadas se unen a las secuencias complementarias presentes en la

muestra. Esta unión permite la detección y cuantificación del material genético de interés.

Este método permite un diagnóstico temprano de una enfermedad porque detecta material
genético (ADN o ARN) en lugar de antígenos o anticuerpos.

PROCEDIMIENTO
Obtención y transporte de la muestra:

 Obtener 5-10 mL de sangre anticoagulada por venopunción en tubos con EDTA.

 Transportar refrigerada al laboratorio en menos de 6-8 horas.

Extracción de ácidos nucleicos:

 Centrifugar la sangre y separar el plasma o los leucocitos.

 Lisar para liberar ácidos nucleicos virales.
 Purificar DNA/RNA viral con columnas de sílice o partículas magnéticas.

Transcripción inversa (para detección de RNA):

 Sintetizar ADN complementario a partir del RNA molde con retrotranscriptasa y

cebadores aleatorios.

Amplificación mediante PCR:

 Preparar mezcla con muestra, buffer, MgCl2, cebadores, sonda fluorescente, dNTPs y
Taq polimerasa.
 Para detección cualitativa se utiliza PCR anidada con dos rondas de amplificación.
 Para cuantificación se utiliza PCR en tiempo real que mide la fluorescencia en cada
ciclo.

Detección:
  En PCR anidada se hace una electroforesis para evidenciar banda de amplificación.
 En PCR en tiempo real se mide la fluorescencia emitida en cada ciclo.

INTERPRETACIÓN CUALITATIVA:

 Presencia de banda o curva de amplificación indica detección de HIV.

 Ausencia de banda o curva indica resultado negativo.

Cuantificación:

 Se compara la fluorescencia con curvas patrón de concentraciones virales conocidas.

 Se interpola para determinar la carga viral en copias/mL.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
1. Si el resultado de la NAT está por encima del umbral de detección, se considera
"detectable" y significa que se ha encontrado una cantidad medible de ARN viral del
VIH en la muestra. La cantidad exacta se proporciona en copias/ml o UI/ml.
2. Si el resultado de la NAT está por debajo del umbral de detección, se considera "no
detectable" o "indetectable". Esto no significa que el VIH esté completamente ausente
en el cuerpo, pero indica que la cantidad es tan baja que no se puede medir con
precisión mediante esta prueba en ese momento.
3. Un resultado "detectable" sugiere una replicación activa del VIH en el cuerpo, lo que
indica una infección activa.

VALORES NORMALES
PCR cualitativa (anidada):
 Ausencia de banda de amplificación visible en el gel de electroforesis.
PCR cuantitativa (tiempo real):
 No detección de curva de amplificación exponencial. Fluorescencia basal inferior al
límite de detección del ensayo.
Carga viral:
 Indetectable o <20-50 copias/mL según límite de detección del kit.
Controles:
 Control negativo: no debe amplificar. Control positivo: debe caer dentro del rango
esperado en copias/mL.
Curva estándar:
 Debe tener un coeficiente de correlación (R2) mayor a 0.98.

LIMITACIONES DE LA PRUEBA O MÉTODO

1. Costosa y compleja: La prueba NAT es costosa y requiere equipamiento especializado
y personal capacitado.
2. No detecta la infección temprana: Puede haber un período de ventana durante el cual
el VIH no es detectable por NAT.
 3. Necesita equipamiento de laboratorio especializado: Requiere equipos avanzados y
personal especializado.
4. Falsos positivos y falsos negativos: Puede dar resultados incorrectos en ciertas
circunstancias.
5. No reemplaza las pruebas de detección iniciales: Se utiliza para confirmar resultados
positivos en pruebas de detección iniciales.
6. No evalúa la respuesta inmunológica del paciente: No mide la respuesta
inmunológica del paciente.
7. No es una prueba de cura: Mide la carga viral pero no cura la infección.

MUESTRA PARA EL ANÁLISIS

 Sangre
 Plasma
 Suero

MATERIALES O EQUIPOS
 Muestras: sangre anticoagulada, plasma, suero, fluidos o tejidos conservados
adecuadamente.
 Kit de extracción de ácidos nucleicos: columnas de silica o partículas magnéticas.
Incluye buffers de lisis, lavado y elución.
 Equipo de PCR en tiempo real: Termociclador, tubos especiales, fluoróforos y
quenchers.
 Enzimas: transcriptasa reversa, polimerasa termoestable (Taq polimerasa).
 Cebadores específicos y sonda fluorescente (TaqMan, FRET) para la amplificación del
genoma de HIV.
 Nucleótidos, dNTPs. Magnesio y buffer de PCR.
 Controles positivo y negativo.
 Patrones de cuantificación con concentraciones conocidas del virus.
 Equipos de detección: termociclador con lector de fluorescencia, espectrofotómetro.
 Material general de laboratorio: microtubos, puntas, gradillas, soluciones, etc.
 Equipos de protección personal.

PRUEBA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA

FUNDAMENTO
El fundamento de las pruebas de inmunocromatografía se basa en la migración de una
muestra a través de una membrana de nitrocelulosa:

Muestra: Se añade una muestra en la zona del conjugado.

Conjugado: El conjugado está formado por un anticuerpo específico contra uno de los
epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección.

Migración: Si la muestra contiene el antígeno problema, este se unirá al conjugado formando

un complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Si no, migrarán el
conjugado y la muestra sin unirse.

Detección: La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro
epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del
antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará en este caso como rosa o azul
(muestras positivas). En el caso contrario las muestras son negativas.

Control: La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de
detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado
libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de que el
ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas

PROCEDIMIENTO
1. Traer la muestra (sangre, suero o plasma) y el kit a temperatura ambiente antes de
realizar la prueba.
2. Extraer la muestra de sangre por punción digital o venopunción según las indicaciones
del kit.
3. Con una micropipeta, colocar el volumen indicado de muestra (generalmente 10-50 μl)
en el pocillo de muestra de la tira reactiva.
4. Añadir el diluyente o buffer de corrida según especificaciones.
5. Dejar que la muestra migre por acción capilar a lo largo de la tira durante 10-20
minutos.
6. Observar si aparecen líneas coloreadas en la zona de resultados. La línea de control
siempre debe aparecer.
7. Interpretar el resultado comparando la presencia o ausencia de la línea de prueba con
el instructivo del kit.
8. Desechar la tira reactiva en un contenedor para material biológico peligroso.
9. Reportar el resultado al médico y al paciente, aclarando que un resultado reactivo
requiere confirmación.
10. Realizar pruebas confirmatorias en caso de resultado positivo

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
 Positiva: Si las dos bandas cambian de color, el resultado es positivo, lo que indica que
el antígeno o anticuerpo objetivo está presente en la muestra.
 Negativa: Si la banda más cercana a donde se pone la muestra no cambia de color, el
resultado es negativo, lo que indica que el antígeno o anticuerpo objetivo no está
presente en la muestra.
 Errónea: Si ninguna banda cambia de color o solo lo hace la más próxima (síntoma de
que la muestra no ha llegado a las dos bandas), el resultado es inválido.
VALORES NORMALES
No se expresan en términos de valores normales o anormales, como algunas otras pruebas de
laboratorio. Estas pruebas proporcionan resultados cualitativos, es decir, indican si se
detectaron anticuerpos específicos del VIH en la muestra de sangre o fluido oral del paciente.

LIMITACIONES DE LA PRUEBA O MÉTODO

1. Período de ventana: Puede dar falsos negativos si la prueba se realiza muy pronto
después de la exposición al VIH.
2. No detectan infecciones muy recientes: No son adecuadas para detectar infecciones
muy recientes.
3. Confirmación requerida: Un resultado positivo debe confirmarse con pruebas más
específicas.
4. No cuantifican la carga viral: No miden la cantidad de virus ni la respuesta
inmunológica del paciente.
5. Dependientes de la calidad de la muestra: La calidad de la muestra puede afectar la
precisión.
6. Errores de usuario: Deben realizarse correctamente según las instrucciones.
7. Posibilidad de falsos positivos y negativos: Pueden dar resultados incorrectos en
ciertas situaciones.
8. No adecuadas para el monitoreo de carga viral: No son útiles para medir la carga viral
o la respuesta al tratamiento en personas con VIH.

MUESTRA PARA EL ANÁLISIS

 Sangre
 Plasma o suero
 Muestra de fluido Oral

MATERIALES O EQUIPOS
1. Dispositivo de prueba: Componente principal del kit donde se aplica la muestra y se
leen los resultados.
2. Reactivo o anticuerpo conjugado: Contiene anticuerpos marcados que reaccionan con
el VIH en la muestra.
3. Buffer o solución de lavado: Se utiliza para procesar la muestra.
4. Hisopo o hisopos de recolección de muestras: Utilizados para obtener muestras de
fluido oral o sangre capilar.
5. Pipetas desechables: Pueden ser necesarias para medir y transferir líquidos con
precisión.
6. Instrucciones de uso: Manual de instrucciones que guía al usuario en el proceso.
7. Material para desecho: Contenedores para desechar materiales usados.
8. Controles de calidad: Permiten verificar la precisión de la prueba.
9. Equipo de protección personal (EPP): Proporciona guantes y batas para la seguridad
del personal.