SEMANA 11

INSTRUCTIVO PARA LA PRÁCTICA 11

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE PRUEBA MOLECULAR DE
APOYO AL DIAGNÓSTICO: REACCIÓN EN LA
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
Competencias:
⮚ Reconoce las implicancias de la técnica de PCR en tiempo real y
sus aplicaciones.
⮚ Emplea los conocimientos de la técnica del PCR en tiempo real en el
diagnóstico propuesto: Displasia Espondiloepifisaria Congénita.
Introducción.
La evaluación de la expresión génica mediante los métodos clásicos requiere de
una gran cantidad de RNAm que es difícil de obtener cuando el número de muestras es
limitado o cuando el material biológico es una población de diferentes tipos celulares.
Aunque la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha tenido un fuerte impacto en
esta área, su uso en la cuantificación de la expresión génica ha sido problemática,
principalmente debido a la naturaleza exponencial del PCR, donde pequeñas diferencias
en la eficiencia de la amplificación pueden alterar de manera significativa el
rendimiento del producto de la amplificación (amplicón). Recientemente ha sido
introducida una nueva tecnología que permite la cuantificación precisa de los
amplicones durante cada ciclo del PCR (Bonilla, Párraga, López, Escolar, y del Mazo,
2002, p. 3).
Los primeros que sentaron las bases para desarrollar la PCR en tiempo real
fueron Higuchi y colaboradores, en 1992, al videograbar en tiempo real la incorporación
de bromuro de etidio al ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV.
Desde entonces, el objetivo de la PCR en tiempo real ha sido detectar y cuantificar las
secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes
en la reacción. El principio de la técnica se basa en la PCR punto final, sólo que la
forma en cómo se detectan y analizan los productos de la amplificación es diferente. El
término en tiempo real se refiere a que la detección de los productos amplificados
sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el término cuantitativo hace referencia
a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra, a diferencia de la PCR
punto final en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la secuencia
blanco (Mas, Poza, Ciriza, Zaragoza, Osta, y Rodellar, 2016, p. 73-74).
Instrucciones: Contesta las siguientes preguntas en forma clara y precisa, en base a la
direccionalidad del diagnóstico del PRC real time para la displasia
espondiloepifisaria congénita.
1. Gen alterado en esta enfermedad

Una mutación en el gen COL2A1 produciría la displasia espondiloepifisaria

congénita, este gen se encuentra ubicado en el cromosoma 12. La enfermedad es
un tipo de displasia ósea que se manifiesta desde la etapa de lactancia, entre las
características más resaltantes se encuentran: estatura baja, desarrollo de la caja
torácica alterado, y desarrollo anormal de las articulaciones de miembros
superiores e inferiores.

2. Tipo de enfermedad autosómica

Es un trastorno autosómico dominante (gen COL2A1), la mayoría de casos
surgen por mutación de novo.

3. Que es PCR convencional y PCR real time, indique diferencias,

semejanzas, ventajas y desventajas de ambas técnicas
PCR CONVENCIONAL: Permite detectar un fragmento de ADN de un
patógeno o mutaciones genéticas. Mediante la amplificación de un fragmento del
ADN se busca identificar o ubicar con mayor exactitud agentes que puedan causar
alguna enfermedad.
● Ventajas: Solo necesita 2 cebadores, estos hibridaron un sitio de la
molécula y como resultado se tendría una banda única. Cuesta menos que
una PCR en tiempo real.
● Desventajas: Requiere gel de agarosa, tiene mayor riesgo de
contaminación, no puede ser cuantificada, tiene menor especificidad,
rango dinámico de detección estrecho.

PCR EN TIEMPO REAL: Permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN

presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta
probabilidad muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de
fusión. Tiene dos aplicaciones:
 En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN (que se multiplica en
cantidad en cada ciclo), se une al fluorocromo (SYBR Green por lo general)
produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para
QPCR.
Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos
fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo y el
inverso; cuando la sonda está intacta presenta una transferencia energética de
fluorescencia por resonancia o FRET. Dicha FRET no puede producirse
cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos se encuentran distantes,
producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa.
● Ventajas: Tiene una mayor rapidez, menor probabilidad de
contaminación, mayor especificidad (con uso de sondas), mayor
sensibilidad y mayor posibilidad de cuantificación.
● Desventajas: Requiere 3 regiones conservadas (las cuales son 2 cebadores
y 1 sonda), es mucho más costosa, pueden generar falsos positivos por la
presencia de dímeros y primers (con SYBR).

4. En el método de apoyo al diagnóstico: qPCR; explique los métodos

de cuantificación:
• Cuantificación absoluta
Esta cuantificación consta en medir el número de cadenas de
amplificadores para lo cual debemos conocer la cantidad inicial de DNA
molde y los demás sustratos en base a esto se identifica la cantidad de
cadenas, se utiliza cuando se están analizando ADNs virales o bacterianos
para hallar las cadenas de virus. Determina la concentración de ácidos
nucleicos en la muestra. - Resultado final con unidades (carga viral,
copias de mensajero, copias de un gen). - Se necesita una curva patrón
absoluta

• Cuantificación relativa
Se utiliza para evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos
estados fisiológicos. Estos cambios se basan en los niveles de ARNm del
gen blanco con un gen de referencia (housekeeping), que no cambia su
expresión a pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen por
diversas causas - Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de
incremento o disminución (expresión genética). - Se necesita curva patrón
(al menos para prueba de primers).

5. Partes de la curva del qPCR y grafique, explique

● Fase Inicial: Entre los 20 primeros ciclos, la fluorescencia no es la
suficiente para discriminar el ruido basal ni el ADN amplificado pero sí
para delimitar la línea base.

● Fase Geométrica: Abundancia de reactivos provoca una amplificación

de la qPCR cercana al 100% de eficacia. En esta fase, el
comportamiento del ADN es 2n , es decir, de cada molécula de ADN
saldrán dos, esto resulta en la duplicación de la PCR después de cada
ciclo.

● Fase Lineal: La eficiencia de la amplificación es inconstante debido a

 la limitación de los reactivos y el decaimiento de la actividad
enzimática.

● Fase Estacionaria: La amplificación se detiene debido a que los

componentes se agotaron. El producto es constante por más que se
incrementen el número de ciclos.

Fuente:
Velilla, Martínez y González, 2002, p. 38
http://www.scielo.org.co/pdf/cmvz/v15n1/1900-9607-cmvz-15-01-31.pdf

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcrtiempo.pdf

6. Explique lo siguiente: ¿Es necesario tener un control endógeno en el proceso

de PCR-RT?

Detección de la expresión de un gen por la presencia del mRNA. Es una

variante de la PCR en la que se usa ARN como forma inicial en lugar de ADN,
y por ende se utiliza la enzima transcriptasa inversa para poder hacer la síntesis
de un ADN complementario al ARN (ADNc). La ventaja de esto es que se
puede detectar un número de
copias de ARN muy bajas, teniendo así, el desarrollo inicial de una RT-PCR
de la siguiente forma:
● 1º paso: Retro-transcripción a partir del ARN
● 2º paso: Amplificación a partir de la primera hebra de ADNc
 7. Un pediatra envía dos muestras para diagnóstico de displasia
espondiloepifisaria congénita, mediante qPCR (M1=paciente 01 y M2= paciente
02), en el laboratorio realizan el análisis con el siguiente resultado:

Fluorescencia

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ciclos

M1: ROJO y M2: VERDE.

Al médico le envían estos resultados: ¿Cuál es su interpretación?

M1: Se puede observar una mutación leve donde la proteína sí se ha podido
amplificar, sin embargo, no llegó al control endógeno, lo cual representa el
límite normal de proteínas. Al no tener los valores normales, podemos
concluir que si bien se encuentra mutado no es grave.

M2: Es la muestra más alterada o letal, en donde toda la proteína perdió su

forma y capacidad de amplificarse convirtiéndose en inservible. Esta después
de 35 ciclos no es capaz de amplificarse, el ADN está tan mutado que no llega
a amplificarse y solo puede ser Heterocigoto recesivo. Totalmente mutado,
proteína inservible.
8. Asumiendo que: por cada ciclo se duplica las copias de ADN, hallemos la
carga de ADN inicial comparativa entre M1 y C (+) en base al mismo treshold.
¿Cuántas veces es mayor o menor la carga genética, para el gen analizado, de
M1 en relación con el C(+)?
Datos: NF=No x 2ct Donde: NF= Carga ADN final 2ct= copias del ADN por ciclo
No= Carga ADN inicial

C(+)/M1 = ¿?
 ● La carga genética inicial de M1 es 218 veces mayor que la carga genética
inicial de C (+)

CONCLUSIONES

● La reacción en cadena de la polimerasa, es una reacción química que los biólogos

moleculares utilizan para amplificar (crear copias) fragmentos de ADN. Esta reacción
permite que unos pocos fragmentos de ADN se repliquen en millones o miles de
millones de copias.
● Por otro lado también la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa
que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción,
si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR,
pero si usamos ADN complementario
(ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como
RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés.
● Además, se ha reportado que para la PCR convencional (punto final), la cantidad final
de producto amplificado puede verse afectada por inhibidores, saturación de la
reacción o bien por falta de una estandarización adecuada. Entonces, los resultados de
la PCR punto final pueden no tener relación entre la cantidad de ácidos nucleicos que
había al inicio de la reacción y la concentración final del producto amplificado.
● La PCR en tiempo real se ha convertido en una herramienta común en la investigación
básica, la industria, la agricultura, la medicina forense y la clínica, mismas que se han
visto beneficiadas por la sensibilidad, velocidad y especificidad de éste método.
Referencias bibliográficas

​ Bonilla, E., Párraga, M., López, L. A., Escolar, F., & del Mazo, J. (2002).
Cuantificación de la expresión génica a partir de un número limitado de células
mediante RT-PCR en tiempo real. Bioquimia, 27(1), 3-7.

​ Mas, E., Poza, J., Ciriza, J., Zaragoza, P., Osta, R., y Rodellar, C. (2016).
Fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Revista
AquaTIC, (15).

​ Velilla MSc, C., Martínez MS, J., & González MSc, M. S. (2020).
Standardization of Multiplex Real-Time PCR for the diagnosis of Feline
Immunodeficiency Virus (FIV) and Feline Leukemia Virus (FeLV) in Felis
silvestris catus. CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 15(1), 31-43.