Técnicas y aplicaciones de los ácidos nucleicos.

Parte 7A

Técnicas más utilizadas:

En general tenemos entre estas técnicas a la ​hibridación con sondas,​ la​ amplificación de señal ​y la
secuenciación ​(muy importante). También tenemos la parte del ​ADN recombinante ​que es el último puntero
de la biotecnología actual. La ​amplificación de los blancos​, en donde se utiliza la reaccion en cadena de la
polimerasa. También tenemos la ​RT-PCR​ (se explicará más adelante) pero trabaja en base a la reaccion de la
transcriptasa reversa. El ​Multiplex PCR ​y por último tenemos el​ Nested PCR ​que es utilizado para el
diagnóstico de la hepatitis C.

Ventajas de trabajar con su ADN: ​Las ventajas de trabajar con este tipo de moléculas, sobre todo para el
diagnóstico es que son:
- Biomoléculas muy fuertes. En sus propiedades fisicoquímicas.
- Son fáciles de manipular.
- Se puede obtener de diferentes fuentes. Las muestras pueden ser de cualquier tipo.

Estas moléculas permiten diagnosticar e investigar múltiples procesos patológicos a nivel más fundamental.

1. Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:

Su base fundamental ​es la
complementariedad de la secuencia
de la base nitrogenadas.​ En una
secuencia genética específica (que
deseamos estudiar) se abre y es
separada de su homólogo, y al
producirse una curva de reasociación,
buscando que esta cadena se separe de su cadena complementaria, esta cadena a estudio va a intentar buscar
otra vez a su cadena homóloga. Entonces a partir de esto se busca desarrollar sondas de diagnóstico para
secuencias específicas. Las sondas pueden ser marcadas con
- Enzimas.
- Moléculas antigénicas o quimioluminiscentes.
- Radioisótopos.

Podemos tener:
 - hibridación en fase líquida.
- hibridación en fase sólida.
- hibridación in situ.

Por ejemplo, la fase in situ Fish es una técnica utilizada para poder marcar la localización de genes sobre los
cromosomas.

ESTA LÁMINA LA SALTO:

Técnicas para la detección y genotipage de VPH:

- Hibridación in situ.
- Reaccion en cadena de la polimerasa punto final simple.
- Reaccion en cadena de la polimerasa tipo Multiplex.
- Reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real.
- RCP + enzimas de restricción.
- RCP + Hibridación reversa.
- Híbrido de captura.
- Microarreglos: Tiene que ve ver con la parte de la expresión del gen directamente
- Secuenciación.

2. RT – PCR – Transcripción Reversa Acoplada a la Amplificación Genética:

Sucede a través de la reacción en cadena de la polimerasa que se utiliza particularmente en el caso de los virus,
sobre todo aquellos virus que contienen ARN. Entonces es mucho más fácil pasar el extracto de ARN
genómico, como por ejemplo el virus de COVID-19, y con este ARN pasarlo (por la enzima transcriptasa
reversa) a ADN y así poder trabajar con él libremente en el laboratorio. Recordemos que la enzimas
transcriptasa reversa (RT) permite que a partir de una cadena de ARN se pueda sintetizarse a partir de ella una
cadena de ADN.

Esta técnica es utilizada en la parte de la detección de las especies Mycobacterium, y también para la
determinación de las terapias antimicrobianas.
Puntualizando:
- Amplifica blancos de ADN.
- Detección de las infecciones por virus de ARN.
- Detección de las especies Mycobacterium.
- Determinación de las terapias antimicrobianas

A mayor detalle podemos ver que hay un RNAm (amarillo) y a traves de la enzima transcriptasa reversa,
sintetisamos a partir de este mensajero un cDNA o ADN complementario. A partir de este material ya
transcrito, y a través de los reactivos de PCR, amplificamos esta secuencia específica de ADN y ya luego se
puede estudiar libremente con esta.

3. NESTED PCR:
Es un truco (así dijo ella), en donde lo que hacemos es ir acortando la
parte de una secuencia más grande ADN, el cual sería el target DNA,
para luego amplificarla (primera amplificación) y luego acortamos más
esta secuencia recién cortada y con este corte, volvemos a amplificar esta
nueva secuencia mucho más corta. Como resultado tenemos una
secuencia mucho más particular y mucho más específica. Este estudio es
utilizado para la detección del virus de hepatitis C.

Puntualizando:
- Utiliza dos sets de primers.
- Alta sensibilidad debido al número de ciclos totales.
- Alta especificidad debido a la amplificación con el 2do sets de
primers.
- Alta probabilidad de contaminación.

DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH

El diagnóstico del VPH se realiza a través de diferentes tipos de muestra como: La citología uretral y cervical,
la biopsia de cualquier tejido y aquellas realizadas en bloques de parafina.
Lo primero que se realiza es el procesamiento de la muestra para poder extraer AD. El VPH es un virus de
ADN de doble cadena, y lo que se realiza es la utilización de la estrategia de la lisis alcalina. Esta se basa en la
ruptura de las células epiteliales, en donde está el contenido del virus, y esa lisis alcalina libera todo el material
genético.

Requerimientos del PCR

Tenemos un tubito de 0,2 ml en donde se encuentra:
- Taq polimerasa:​ ​La ​polimerasa Taq​ es un tipo
de ADN ​polimerasa​ termoestable.
- Transcriptasa reversa:​ Porque vamos a trabajar
por ejemplo con un virus.
- Templete del RNA del virus o la bacteria.
- Primers o iniciadores.
- Nucleótidos.

En la imagen inferior a la izquierda se ve un equipo de PCR en tiempo final y a la derecha tenemos los
bloques de calentamiento que tiene este sistema computarizado.

Mecanismo de funcionamiento de la PCR:

1. Desnaturalización​: Primero desnaturalizamos las cadenas de ADN, sin romperlas en su totalidad, a una
temperatura de 95 grados celsius. Estas temperaturas para estos procesos pueden variar, dependiendo
del contenido de guanina y citosina (recordemos la 2da clase).
 2. Recocido (annealing):​ Se colocan la secuencia de iniciadores o primers en la síntesis de las cadenas.
Estos primers van a ser específicos ya que nosotros tenemos que conocer los iniciadores de la secuencia
de genes que queremos amplificar, por lo tanto tenemos que conocer los colindantes de los primers a
utilizar. Esto se realiza a una temperatura aproximada de 50 grados celsius.

3. Extensión (extension):​ La polimerasa, al leer los primers, comienza a sintetizar las cadenas a una
temperatura adecuada.

Este ciclo se repite muchas veces para AMPLIFICAR esta secuencia

específica de ADN.

Esta es una cámara típica de electroforesis, en donde trabajo con mis

PCR de punto final debido a que se requiere visualizar en este equipo el
amplificado. Esto se realiza a través de la colocación del amplificado en
gel de agarosa.
 Bioquímica Clase 7A (Parte II)
Separación de Fragmentos

Dependiendo del tamaño de la molécula de ADN que se esté estudiando, los geles que
se utilicen en el proceso pueden ser de agarosa o de poliacrilamida

La foto superior es una imagen de una cámara de electroforesis, la cual está llena de
gel de agarosa (este gel se puede encontrar en diferentes concentraciones dependiendo
del tamaño de la molécula a estudiar). Recordemos que, como principio, el ADN es una
molécula cargada negativamente. Al colocar a la molécula de ADN en un campo
eléctrico y aplicar una carga eléctrica, la malla de agarosa se polimeriza, creando poros.
En consecuencia, la muestra se va a separar en fragmentos, los que sean más positivos
se dirigen al polo negativo, y los que sean más negativos se dirigen al polo positivo.

La foto superior es una imagen de un fragmento de VPH amplificado por RCP punto
final que ha sido pasado por una corrida electroforética. La marca de 268pb nos indica
que el proceso fue exitoso y que la muestra dio con un target de un gen conservado
humano, mientras que la marca en 450pb nos indica una secuencia de genes
conservados del VPH.

Si desglosamos el significado de las columnas:

 MM es un marcador de peso molecular

 HeLa es una extracción de la amplificación de material genético de células en
cultivo

Enzimas de restricción

Se encargan de buscar ciertas secuencias determinadas sobre el genoma y cortar el

material genético en secuencias específicas. La siguiente lámina indica de donde han
sido aisladas estas enzimas de restricción. Estas enzimas de restricción forman parte de
los sistemas de reflexión (¿reparación?) y modificación que tienen la mayoría de las
células

Lo que nos indica este diagrama es que cuando una enzima de reducción encuentra una
de las secuencias mencionadas en el cuadro (como por ejemplo 3’—CC con la Hae III)
ellas cortan una secuencia especifica.
La imagen superior es un ejemplo de como la enzima de restricción actúa. La enzima
Pvu II, al detectar sus secuencias características, escinde la cadena de ADN en un eje de
simetría, creando así dos fragmentos de cadena distintos.

Las enzimas de restricción pueden ser utilizadas para genotipificar a muestras de VPH:

El cuadro inferior que vemos en la imagen son patrones de restricción, y utilizando esa
información podemos detectar que enzima de restricción está trabajando y por lo tanto
que genotipo o cepa de VPH estamos tratando en la muestra.
 Técnicas de amplificación de señal

Las TAS están diseñadas para reforzar la señal de moléculas como radioisótopos,
enzimas y fluorocromos. Es incapaz de amplificar ácidos nucleicos, lo cual es un factor
que limita su campo de utilidad. La prueba solía ser mucho más popular y veía más uso
hasta la llegada de la prueba PCR.

Existe una prueba, la cual ha sido usada para el estudio de ETS como la clamidia,
gonorrea, herpes simple (este todavía es un prototipo) y VPH, llamada Digene. La
prueba es de notoriedad importante debido a su sistema híbrido de captura, el cual le
permite tomar y combinar varias propiedades del material genético para detectar si la
muestra contiene algún virus. Digene funciona con los siguientes pasos:

1) Desnaturalización del ADN

2) Hibridación del ADN con sondas específicas de ARN
3) Se captura a las cadenas híbridas creadas con una placa de anticuerpo anti-ADN
híbrido.
4) Las cadenas capturadas reaccionan con un conjugado, marcándose así para el
último paso.
5) Las marcas están diseñadas para emitir quimioluminiscencia cuando ocurre una
reacción enzimática. Si esta quimioluminiscencia se detecta, la muestra contiene
alguno de los virus target.

La prueba puede detectar cargas semicuantitativas.

Prueba de PCR

Las pruebas de PCR tienen los siguientes elementos:

 La polimerasa
 Primers o cebadores
 dNTPs
 Cloruro de Magnesio
 Agua
 Buffer

¿Cuáles son los pasos de la PCR? Son los siguientes:

1) Desnaturalización: La molécula de ADN se abre para poder tener acceso al

segmento específico que se quiere estudiar para permitir…
2) Unión de cebadores: Los cebadores se unen a las cadenas de ADN,
permitiendo…
3) Duplicación de las cadenas: La ARN Polimerasa duplica la muestra de ADN que
se quiere estudiar. Una vez que las cadenas pasan por el proceso de iniciación,
elongación y terminación, el ciclo se repite con las nuevas moléculas que se han
creado
El resultado de este ciclo es la duplicación exponencial de la muestra original de
ADN que se quiere estudiar.
 Prueba Multiplex PCR

Es una reacción de amplificación que usa dos o más sets de primers o cebadores;
esta característica les permite amplificar varias secuencias simultáneamente, con la
condición de que los sets de primers deben tener temperaturas de hibridación
similares.

La imagen superior nos muestra el resultado de una prueba Multiplex. Con solo una
muestra y un set de primers, podemos observar que los amplificados van a tener
diferentes tamaños moleculares y esto nos puede ayudar a determinar si hay una
infección sencilla o triple para cada uno de los genotipos del VPH.

La prueba INNO-LiPA es mucho más sensible y por lo tanto más confiable al

momento de genotipificar al VPH y determinar si es de alto o bajo riesgo
oncológico. El primer paso es una amplificación por PCR de punto final y luego se
usa una hibridación con una base sólida que contiene sondas para los genotipos
principales de VPH, lo cual le permite a los investigadores detectar si el paciente
tiene infección de una o varias cepas de VPH.
CLASE NO. 7B/BIOQUIMICA

Siguiendo la clase anterior tenemos que…

Existen diferentes estrategias de amplificación en tiempo real:

Implica la utilización de un fluoroforo, de un quencher, una sonda para llevar la

secuencia target. Tambien se tienen una
polimerasa que va actuar para copiar la
secuencia de ADN. Se va a formar
apartir de este un hibrido con el
fluroforo y el quencher. Y existe una
extensión de este material que hay que
amplificar, en la cual hay una estrategia
donde se liberan el quencher y el
fluoroforo una vez completado esa
extensión y es lo que la maquina detecta
para enteneder si hubo amplificación o
no; facilita la velocidad con la que se
pueda tener el resultado.

VENTAJAS DEL PCR EN TIEMPO REAL

La detección del producto
1. Simple y rápida. en cada ciclo de reacción
2. Disminucion del riesgo de contaminación por amplicones. permite un análisis de la
3. Cuantificación precisa de DNA o RNA inicial. cinética de reacción
4. Alta sensibilidad y especificidad.
5. Detecction de mas de un producto especifico en una misma reacción.
6. Discriminación de productos inespecíficos con la opción de la “curva de
desnaturalización”.

Inferiormente se presenta una curva que nos da la relación entre la replicación viral
(en donde se sabe que el SARS-CoV-2 es un virus de RNA de cadena positiva, lo que
nos permite tomar la parte de transcripción reversa, para convertir rápidamente el
CLASE NO. 7B/BIOQUIMICA

genoma viral en una molecula de DNA). El Rrt-pcr, que es la técnica que se utiliza
para la diagnosticarían del SAR-CoV-2:

En esta primera etapa se puede ver si el Se empieza a ver una respuesta de IgG,
paciente esta infectado o no. hay un levantamiento de la parte
inmunológica.

Curva clásica hecha

para el virus de papiloma
humano

MICRO ARRAY TECHNOLOGY  Otro tipo de tecnología utilizada para ver

sobre todo expresiones y su basamento es la
transcripción reversa, marcaje con fluoroforo. Aquí
se utilizan o se trabaja con secuencias de genes
determinados. Permite ver la expresión simultanea
en distintos genes de acuerdo al fluoroforo en el cual
se colocaron.

El MICRO ARRAY también se puede ser de forma

robotica o en maquinas inteligentes.
CLASE NO. 7B/BIOQUIMICA

Ahora ¿Cómo se fue dando la secuenciación?

¿QUE ES EL MICROBIOMA?

Son pequeños organismos vivientes como bacterias o virus que viven en forma
colectiva, o en comunidades en un ser vivo.

A través de lo que es la secuenciación y acoplando los MICRO ARRAY y utilizando

la parte de bioinformática; se puede conocer cuales son los integrantes de un
microbioma, a raíz de eso se han podido hacer los
dendogramas, para saber cuales son los
microorganismo que están en un microorganismo
determinado.
Es importante saber que la ingeneria genética y la
medicina van de la mano: Y algunas de sus
aplicaciones en conjunto son las siguientes:
CLASE NO. 7B/BIOQUIMICA

Importante de destacar: en 2012 se publica un articulo en el cual se ve el

lanzamiento de las nuevas tijeras genéticas, CRISPR-Cas9, es una herramienta
sencilla y barata que permite cortar y pegar ADN, cortar un gen que causa una
enfermedad y cambiarlo por otro que no provoque ese problema. Se basa en el
mecanismo natural que emplean las bacterias para defenderse de los virus.

Hay fagos de bacterias que pueden infectar bacterias inyectan sus genomas, toman
posecion de la maquinaria celular e intenta reproducirse para generar más
partículas virales.

SECUENCIAS PALINDROMICAS

Son secuencias que se pueden leer de derecha a

izquierda o viceversa.

Se encuentran en diferentes zonas del ADN de las bacterias y ademas de las

secuencias palindromicas existen unos espaciadores. Este sistema de “clustered”
regulatorio es lo que se les llama CRISPR (osea las secuencias palindromicas y los
espaciadores que se repiten dentro del ADN)

¿QUE SON LOS CAS GENES?

Los genes asociados a CRISPR, llamados cas, son genes frecuentemente
relacionados con los arreglos de repeticiones CRISPR. Fueron descubiertos en el año
2002 y fue razón de un premio nobel. Lo importante de estos sitemas es que cuando
existe una infección entre bacteriófagos y las bacterias, dejan una huella genética la
cual queda impreganda dentro del genoma de la bacteria y llamaron a esta sistema
inmunológico de las bacterias (ya que si existe una segunda infección con el virus la
bacteria va a reconocer cuando el virus infecta su material genético, osea va a tener
como una especie de memoria inmunológica, e inmediatamente hay un sistema de
restricción e elimina este material genético intruso)
CLASE NO. 7B/BIOQUIMICA

Existen muchas opciones con respecto a este sistema las cuales se explican a
continuación: