PCR CONVENCIONAL

HISTORIA:
En décadas atrás no se contaba con métodos para el estudio minucioso de regiones
de ADN, donde fuese posible su aislamiento y replicación en masa, sin embargo
durante la época de 1980 se empleaba un procedimiento conocido como la clonación
génica en la cual se introducía cadenas de nucleótidos al genoma bacteriano, luego
estos microorganismos se dividían y multiplicaban, no obstante se trataba de una
técnica que resultaba muy compleja y tardada de ejecutar. Después de varios intentos
Kary Mullis después de varios intentos logró amplificar regiones específicas de
material genético, en un principio lo utilizó para el análisis del gen de la b-globina
humana y para el diagnóstico prenatal de la anemia falciforme. Esta herramienta
marcó el inicio de una nueva era en el estudio y conocimiento de los ácidos nucleicos,
por ende, de la biología molecular.

¿QUÉ ES LA PCR CONVENCIONAL?

La PCR o reacción en cadena de la polimerasa y se trata de una reacción enzimática
in vitro (en tubos de ensayo) la cual es capaz de amplificar millones de veces una
secuencia de ADN en específico, esto se da durante varios ciclos en los que se copia
con exactitud la secuencia TARGET también denominada blanco. La reacción se ve
beneficiada por la actividad que realiza la enzima ADN polimerasa, pues esta puede
sintetizar de manera natural el ADN celular.

¿CÓMO FUNCIONA LA PCR CONVENCIONAL?

Para poder realizar esta técnica con éxito, es necesario tener en cuenta varios
elementos claves. El principal elemento es el ADN que ofrece una composición
manipulable en las condiciones adecuadas para la PCR. También la Taq
POLIMERASA, esta es una enzima termoestable, es decir, es capaz de funcionar a
altas temperaturas y esto es importante para la primera etapa de la PCR. También son
necesarios los primers o cebadores, los cuales son secuencias de oligonucleótidos
encargados de delimitar los moldes que se buscan amplificar. Las sales que llevan
cationes que permite la optimización de la reacción. Estos elementos ocasionalmente
vienen incluidos en los buffers, soluciones amortiguadoras encargadas de equilibrar el
pH en la PCR. Así mismo, se encuentran los dNTPs (bases nitrogenadas) con los que
la Taq polimerasa complementa las cadenas amplificadas. Y el agua que permite que
la enzima se adhiera y se mueva a lo largo de la cadena de ADN. Es importante tener
un control de estos elementos sin que afecte el rendimiento de la Taq polimerasa,
porque requiere condiciones óptimas para su actividad. Todos estos elementos
necesarios para la reacción se colocan en un tubo y se somete a ciclos repetidos de
calentamiento y enfriamiento en una máquina llamada termociclador, que se encarga
de realizar los ciclos en los tiempos y temperaturas requeridas, ya que en los inicios de
la PCR se realizaba en tubos esterilizados en baños maría, donde se marcaba un alto
margen de error y poca precisión en los productos.
La PCR Convencional consta de tres etapas, la primera es la desnaturalización, en
esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95
°C durante 20-30 segundos; el tiempo de desnaturalización depende de los pares de
bases nitrogenadas con los que cuente la cadena. La segunda etapa es la hibridación
o alineamiento, aquí se baja la temperatura, entre 50 y 60°C, para permitir que dos
primers se unan a las zonas 3’ complementarias que rodean el fragmento que se
quiere amplificar. Y la última etapa, la extensión o elongación, en esta etapa actúa la
Taq polimerasa y se vuelve a aumentar la temperatura a 72°C, esta enzima comienza
a sintetizar a una velocidad muy rápida una nueva cadena de ADN complementaria a
cada una de las hebras de ADN molde. La nueva cadena se sintetiza a partir de los
dNTPs complementarios para crear las cadenas completas de ADN, la extensión de
las cadenas ocurre en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. El ADN
polimerasa continúa sintetizando la nueva cadena hasta que llega al final del
fragmento de ADN. Estos tres pasos se repiten varias veces (generalmente entre 20 y
40 ciclos) para amplificar el fragmento de ADN deseado.
Para la verificación y análisis de amplificación por PCR, el producto es visualizado a
través de una electroforesis de geles de agarosa. Esta técnica implica separar los
fragmentos de ADN amplificados por tamaño utilizando un gel de agarosa y un campo
eléctrico. Los fragmentos se cargan en un pozo en un extremo del gel, y cuando se
aplica una corriente eléctrica, los fragmentos migran a través del gel. Los fragmentos
de ADN más pequeños migran más rápido que los fragmentos más grandes y se
separan según su tamaño. Una vez que se ha ejecutado el gel, se puede visualizar el
patrón de bandas de ADN utilizando colorantes como el bromuro de etidio.

VARIANTES DE LA PCR CONVENCIONAL:

Las variantes de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se desarrollan con el
fin de mejorar o adaptar esta técnica molecular para diversas aplicaciones y
necesidades en el campo de la investigación científica, la medicina y la genética.
Comprende las siguientes variantes:
PCR INVERSA: Se utiliza para convertir el ARN en ADN complementario antes de la
amplificación por PCR. Es esencial en pruebas diagnósticas de COVID-19.
PCR ANIDADA (NESTED-PCR): Consiste en realizar una segunda amplificación de
ADN.
PCR CON ADAPTADORES: Es una variante que utiliza cebadores adaptadores
específicos en lugar de cebadores diseñados para secuencias genéticas específicas.
PCR ASIMÉTRICA: En esta se utiliza una mayor concentración de uno de los
cebadores en comparación con el otro.
PCR LARGA (L-PCR): Es usada para amplificar fragmentos de ADN más largos de lo
que se puede lograr con la PCR convencional.
PCR MÚLTIPLEX: permite la amplificación y detección simultánea de múltiples
secuencias de ADN en una sola reacción.
RT- PCR (PCR CON TRANSCRIPTASA INVERSA): Se utiliza para convertir el ARN
en ADN complementario antes de la amplificación por PCR.

APLICACIONES DE LA PCR CONVENCIONAL:

La PCR convencional comprende una amplia gama de aplicaciones. En la
investigación científica, pues resulta sumamente útil en los procesos de clonación de
genes como se mencionó con anterioridad.
También en la detección de mutaciones genéticas, una vez que la región de interés se
ha amplificado mediante PCR, se pueden utilizar diferentes métodos para detectar y
analizar las mutaciones presentes en esa región.
En la medicina forense, ya que, permite un análisis genético comparativo con fines
legales. También para identificar individuos acusados por crímenes de violencia y
homicidios, para la comprobación de la paternidad, exoneración de sospechosos,
entre otras más.
Y a la hora de diagnosticar un paciente por alguna enfermedad causada por agentes
patógenos, ya que, permite detectar y amplificar material genético de patógenos
específicos presentes en muestras clínicas.

CONCLUSIÓN:
En resumen, la PCR convencional es una técnica valiosa y versátil en la biología
molecular. Su capacidad para amplificar y detectar secuencias específicas de ADN
con alta sensibilidad la convierte en una herramienta esencial en la investigación y el
diagnóstico científico. Sin embargo, es importante tener en cuenta sus limitaciones y
realizar los controles adecuados para garantizar resultados precisos y confiables.

ELECTROFORESIS DE GELES DE AGAROSA: es la técnica de separación más

utilizada para el análisis y caracterización de ácidos nucleicos de distintas
procedencias.