BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

APLICACIÓN DE TÉCNICAS
DE PCR Y ELECTROFORESIS
AL ESTUDIO DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Alejandro, Mariem, Omar, Rochdi y Lubna

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01 INTRODUCCIÓN
02 FUNDAMENTO DE LA PCR
03 UTILIDADES DE LA PCR
04 COMPONENTES DE LA PCR
05 ETAPAS DE LA PCR
06 PROBLEMAS QUE SE PUEDE PRESENTAR EN LA PCR
07 VARIANTES DE LA PCR
08 ELECTROFORESIS EN GEL
09 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
10 CONCLUSIÓN
11 BIBLIOGRAFÍA
 INTRODUCCIÓN
En 1986, el bioquímico estadounidense Kary Mullis (1944-
2019) desarrolló un método de laboratorio que permite
multiplicar enormemente el número de moléculas de
ADN de una muestra desconocida de tamaño ínfimo. La
técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR), le valió el Premio Nobel en 1993, 7 años después
de publicar sus resultados experimentales.

Vídeo PCR
 FUNDAMENTO DE LA PCR
¿Qué es la PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica muy común

en laboratorios que se utiliza para hacer muchas copias de una región en
concreto del ADN (Llegando haber muchos millones) en poco tiempo ya
que amplifica de manera exponencial esta región. Esta región de ADN
puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador. Por ejemplo,
podría ser un gen que sirva para diferenciar el ADN con la de otra persona,
del niño y de él o los presuntos padres en caso de un test de paternidad.

La PCR depende de una ADN polimerasa resistente a altas temperaturas, la

Taq polimerasa, y requiere de cebadores diseñados específicamente para
la región de ADN de interés.

En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de

temperatura que permiten la producción de muchas copias de nuestra
región especifica.
 UTILIDADES DE LA PCR
Entre las muchas áreas de aplicación de PCR están: la arqueología, la medicina forense,
pruebas de paternidad, genética, investigación biológica y el diagnóstico clínico.

2 TEST DE PATERNIDAD

1 HUELLA DIGITAL GENÉTICA

Técnica forense que permite identificar a una persona comparando su
ADN con el de una muestra obtenida. Como la muestra puede ser muy
escasa, la PCR permite aumentar la cantidad de ADN amplificando
ciertos segmentos polimórficos (variables en la población), para luego
separarlos mediante electroforesis, lo que se conoce como ADN
fingerprint o huella digital.
Amplificando por PCR fragmentos polimórficos de ADN de la madre, del niño y
de el o los presuntos padres, y separándolo mediante electroforesis, se puede
visualizar una serie de segmentos que tiene el niño, que debe compartir con la
madre y padre biológicos.
4 ANÁLISIS DE ADN ANTIGUO
Con la PCR se puede analizar ADN que tiene miles de años de antigüedad,
lo que ha permitido estudiar muestras obtenidas desde momias y de

3 DETECCIÓN DE ENFERMEDADES
HEREDITARIAS
restos de animales extintos, como algunos ejemplos.

5
Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR, con
los partidores adecuados, y luego ser secuenciado, para así determinar
si un individuo porta alguna mutación que explica la presencia de una
enfermedad o su aparición en el futuro, la que puede ser heredada a
sus hijos.
MUTAGÉNESIS
Con variaciones en la secuencia de los partidores, se puede producir un
segmento de ADN que presente diferencia en una o más bases respecto
al ADN original. Esta mutación puede ser en un sitio determinado de un
gen (sitio dirigido) o en un lugar al azar de un gen o genoma.
 COMPONENTES DE LA PCR
Para llevar a cabo la PCR es necesaria la mezcla de reacción, compuesta por:

ADN molde

ADN polimerasas termoestables

(Taq ADN polimerasa)

Desoxinucleótidos trifosfatos, nucleótidos de timina,

citosina, adenina y guanina (dTTP, dCTP, dATP, dGTP)

Cebadores o primers de dos tipos

Cloruro magnésico

Otros aditivos
 ETAPAS DE LA PCR
La PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación. Cada ciclo consta de tres fases:

1. DESNATURALIZACIÓN DEL ADN MOLDE.

Tanto la temperatura como la duración deben ser las suficientes (normalmente, 94-95º C durante 15-30 segundos).

2. HIBRIDACIÓN DE LOS CEBADORES CON EL ADN MOLDE.

La temperatura de la hibridación de los cebadores con el ADN molde (se fija de forma experimental para cada pareja de
cebadores) depende de la Tm de los cebadores.
Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm.
En el termociclador se lleva a cabo la reacción de la PCR, ya que permite
Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm. programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de
incubación para que se desarrollen automáticamente.
Esta programación se realiza en tres etapas principales:

3. EXTENSIÓN DE LOS CEBADORES.

Se produce la elongación de los cebadores por la ADN
polimerasa copiando la hebra molde.
PROBLEMAS QUE SE PUEDE PRESENTAR EN LA PCR
A pesar de su relativa simplicidad, los ensayos de PCR no son inmunes a los errores: los fallas pueden resultar
en una baja sensibilidad o especificidad. Cada paso del proceso de PCR debe controlarse y evaluarse
estrictamente.

La calidad y pureza de las muestras es un factor clave. Los fallos pueden requerir tiempo y ser costosos. Sin
embargo, con un riguroso control de calidad y resolución de problemas, puede producir siempre resultados
de alta exactitud.

Para mantener la integridad de los resultados y producir datos significativos y fiables a escala, existen ciertas
comprobaciones de rendimiento que deben tener lugar:
1. Realiza el control de calidad durante la recogida, el transporte y la preparación.
2. Utiliza el etiquetado correcto y códigos de barras legibles al clasificar las muestras.
3. Evita la contaminación minimizando las tareas manuales con automatización integral
4. Asegúrate de que el ADN/ARN son de la más alta calidad, los reactivos están bien formulados y los
cebadores y sondas están correctamente diseñados.
VARIANTES DE LA PCR
PCR anidada
Variante de la PCR convencional
que implica dos rondas de
amplificación con un par de
cebadores diferentes en cada
ronda para aumentar la
sensibilidad y la especificidad de la
detección.
Primero, se realiza una reacción
con un cebador externo para
amplificar una región más grande
de ADN que contiene el
fragmento de interés.
Este producto de amplificación
luego se usa como plantilla para
una segunda PCR usando
cebadores internos para amplificar
regiones específicas.
PCR in situ
El ARN o ADN monocatenario
llamado sonda se marca y se
permite que se empareje con su
secuencia complementaria en el
ARN o ADN presente en una
muestra cromosómica o de tejido.
La sonda está etiquetada con un
marcador químico o radiactivo
para que se pueda ver su unión.
PCR de alta fidelidad
Es un tipo de PCR que posee una
tasa de errores muy baja y
lógicamente da como resultado un
alto grado de precisión en la
replicación del ADN de interés.
Cuando hablamos de fidelidad,
nos referimos a su capacidad para
insertar la base correcta durante la
PCR.
Esto implica múltiples etapas:
Capacidad para leer cadenas
de plantilla
Selección de nucleósidos
trifosfato apropiados
Inserte el nucleótido correcto
en el extremo 3' del cebador

VARIANTES DE LA PCR
PCR múltiplex
Consiste en la aplicación
simultánea de varios fragmento de
ADN en la misma PCR. Se trata de
una PCR normal a la que se añade
varias parejas de cebadores. Esta
técnica permite reducir el tiempo
y costes en el análisis de los ácidos
nucleicos.
Sus aplicaciones son
siguientes:
Identificación de patógenos​
Análisis de mutaciones
Análisis de deleción de genes
Cuantificación de secuencia
molde
Detección de ARN​
Estudios forense
PCR a tiempo real
o cuantitativa
Es una variante de PCR que
permite detectar y cuantificar el
producto de la amplificación del
ADN. Gracias a la combinación del
método tradicional de PCR con la
utilización de fluorocromos unido
a una sonda que hibrida con las
cadenas amplificadas se puede
hacer el seguimiento y retrotranscriptasa que convierte un
cuantificación del proceso de
amplificación de un segmento de
ADN.
las
PCR inversa (RT-PCR)
Se usa una enzima llamada
trozo específico de ARN en un trozo
de ADN compatible. Luego, otra
enzima llamada ADN–polimerasa
amplifica ese trozo de ADN. Es
posible usar la reacción en cadena
de la polimerasa con
retrotranscripción para:
Detectar ciertos cambios en un
gen o cromosoma
Para identificar la activación de
ciertos genes, lo que ayuda a
diagnosticar enfermedades,
como el cáncer.
También sirve para estudiar el
ARN de ciertos virus.
 ELECTROFORESIS EN GEL
Es una técnica cuya finalidad es separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos
nucleicos en base a dos variables: masa y carga. Los materiales utilizados comúnmente son
polímeros como la poliacrilamida o la agarosa, cuya principal diferencia es el tamaño del poro
comportándose como un tamiz molecular que da lugar a la separación de las moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma.Conseguimos la separación de moléculas en un gel
mediante la aplicación de un campo eléctrico, estas moléculas migran a una velocidad
determinada dependiendo de su carga – masa.
Una vez depositada las muestras en los pocillos del gel, se le aplica un campo eléctrico y las
moléculas de ADN y proteínas con carga negativa migran al polo positivo.
Las moléculas más grande quedan más cerca por la dificultad de pasar por los poros del gel,
mientras que las pequeñas migrará más lejos.Los geles de poliacrilamida tienen un tamaño de
poro menor que los de agarosa, por lo que son muy efectivos para separar fragmentos
pequeños de ADN, siendo su poder de resolución muy elevada. La
electroforesis es vertical.
Este gel es considerado como uno de los mejores soportes para electroforesis, pero tiene una
desventaja: es neurotóxico, por lo que debe ser utilizado con precaución.

Vídeo demostrativo
 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Es la técnica de separación más utilizada para el análisis y caracterización de ácidos
nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar
moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Normalmente se utiliza para
separar, identificar y purificar fragmentos de AND o ARN y determinar el tamaño de un
fragmentos de ADN.
Aunque los geles de agarosa poseen un poder resolutivo menor que los de poliacrilamida,
tienen una amplitud mayor de tamaño en la separación.
Se necesita:
Una cubeta de electrofóresis,los geles se colocan en una cubeta, un recipiente que
se rellena con solución tampón(ph 8)
Una fuente de alimentación, donde se selecciona tanto el voltaje como la intensidad
de la corriente a aplicar que suministra la corriente eléctrica necesaria para movilizar
la muestra a través del gel
Se diferencian varias fases:
Preparación del gel de agarosa.
A las muestras que se van a analizar se le añade un pequeño volumen de tampón de
carga, una solución que lleva uno o varios colorantes y sacarosa o glicerol, esto aporta
densidad a la muestra y evitan que floten.
Tinción, que puede ser mediante la preparación previa de bromuro de Etidio
Visualización bajo la luz UV, mediante un transiluminador
 CONCLUSIÓN
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos
de ADN según su tamaño.
Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un
gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el
electrodo positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la
misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan
el gel más rápido que los grandes.
Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los
fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan
un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño.
 BIBLIOGRAFÍA
Libro de Biología Molecular y Citogenética
Ignacio Ramos Díaz, Eduardo Juan López Felices, Maria Valdivia Giménez y
Diego Carrión Martínez, Profesorado de “BIOLOGÍA MOLECULAR Y
CITOGENÉTICA”- Programación del módulo Departamento de Sanidad.
(2020/2021)
https://diagnostics.roche.com/es/es/article-listing/pcr-up-close.html
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AG
AROSA.pdf
https://www.edvotek.com/site/pdf/101sp.pdf.
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-
regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis
GRACIAS!
ALEJANDRO
MARIEM
OMAR
ROCHDI
LUBNA