Uf8. Aplicación de Técnicas de PCR Y Electroforesis Al Estudio de Ácidos Nucleicos

UF8.
APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE PCR Y ELECTROFORESIS AL ESTUDIO DE

ÁCIDOS NUCLEICOS
PRIMERA PARTE: PCR A TIEMPO FINAL
Biología Molecular y Citogenética. CFGS Laboratorio Clínico y Biomédico
Dra. Ana Mª Martínez Serrano
Técnica de PCR
✓ La PCR es una técnica que genera in vitro un gran número

de copias de un determinado fragmento de ADN.
✓ Se trata de una clonación molecular pues se amplifica el

ADN (o ARN previa obtención de ADNc) sin emplear células
(clonación acelular).
✓ Simula una replicación natural del ADN in vitro.
✓ El análisis de ácidos nucleicos ha provocado un avance sin

precedentes en cuanto al conocimiento e identificación de
distintas enfermedades, gracias a la amplificación de
fragmentos de ADN.

Técnica de PCR

Técnica de PCR
Antes del desarrollo de la PCR, la

amplificación del ADN se
realizaba in vivo. Es decir, se
realizaba una clonación celular.
Para ello, se manipulaba el ADN,
se transformaban células con ese
ADN recombinante que se
replicaba en esas células hasta
que se obtenía un número de
copias adecuado. Era una técnica
muy tediosa.

Técnica de PCR
La PCR, sin embargo, es una

técnica de clonación in vitro
que permite amplificar en un
tubo de ensayo una secuencia
de ADN determinada millones
de veces y en poco tiempo,
constituyendo una herramienta
fundamental en cualquier
laboratorio de biología
molecular.

¿Qué muestras utilizo en la técnica de PCR?
La PCR se realiza con muestras de ácidos nucleicos procedentes
de especímenes diversos que ya vimos en la UF8. Además, es
imprescindible conocer una parte de la región de ADN o ARN
que se quiere amplificar.

¿Cuáles son los objetivos de la técnica de PCR?
El objetivo básico de la PCR es la
amplificación de material genético
(sobre todo, ADN).
Esto permite:
1. Obtener una cantidad suficiente
de material genético para usarlo
en fines diversos.
2. Detección de determinadas
secuencias de las cuales se ha de
verificar su presencia o ausencia
en un ADN muestra.
APLICACIONES DE LA PCR
Son múltiples. Por ejemplo: en ciencia básica, permite la detección
y/o generación de fragmentos de interés mientras que en ciencia
aplicada permiten diagnóstico clínico, diagnóstico forense, control
alimentario, etc.

✓ Clonación acelular de fragmentos de ADN.
✓ Detección de secuencias sin purificación previa.
✓ Preparación de muestras para secuenciación de ácidos nucleicos.
✓ Establecimiento de polimorfismo de secuencia.
✓ Rastreo de mutaciones.
✓ Tipificación de ADN para trasplantes.
✓ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular.

✓ Determinación de la presencia de organismos modificados
genéticamente y para la autentificación de productos.

✓ Diagnóstico de enfermedades genéticas (incluido el diagnóstico
prenatal).
✓ Determinación de secuencias específicas de ADN relacionadas con
situaciones patológicas definidas.
✓ Marcadores genéticos para aplicaciones forenses (amplificación e
identificación de ADN de saliva, sangre, cabellos…)
✓ Pruebas de paternidad.
✓ Arqueología y paleontología (amplificación de material genético
obtenido de momias y fósiles).
✓ Estudios evolutivos.
✓ Detección de microorganismos infecciosos.
✓ Detección de células tumorales.
FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA PCR
La replicación in vitro del ADN consiste en la amplificación selectiva de

una determinada secuencia de ADN (ADN molde).
Para ello se usan 2 cebadores o primers complementarios a las
secuencias situadas en los extremos del fragmento de ADN molde que se
desea amplificar.

La replicación in vitro del ADN por PCR sigue las misma reglas que la
replicación natural.

✓ Una secuencia sirve de molde a

la ADN-polimerasa que, por
complementariedad, sintetiza la
cadena antiparalela.
✓ El sentido de la síntesis es 5’→3’

por lo que requiere de un
nucleótido libre en el extremo 3’
que proporciona el grupo – OH
para la adición del siguiente
nucleótido por enlace
fosfodiéster.

E N L A C E S FOSFODIÉSTER

CICLOS DE LA PCR
1 DESNATURALIZACIÓN DE LA DOBLE HEBRA DE ADN:

Tiene lugar a 95ºC con el fin de dar lugar a moléculas
monocatenarias.
2 ANILLAMIENTO O ALINEAMIENTO O ANNEALING:

Hibridación específica de los dos cebadores o primers a sus
secuencias complementarias monocatenarias.
3 ELONGACIÓN O EXTENSIÓN O POLIMERIZACIÓN:

replicación de la molécula monocatenaria.

CICLOS DE LA PCR

CICLOS DE LA PCR

CICLOS DE LA PCR
1 DESNATURALIZACIÓN DE LA DOBLE HEBRA DE ADN:
Es la aplicación de calor (95°C) para separar la doble hélice

en dos moléculas monocatenarias, permitiendo que ocurra el
siguiente paso. El calor suple la actividad de las enzimas
presentes en la síntesis in vivo.

CICLOS DE LA PCR
2 ANILLAMIENTO O ALINEAMIENTO O ANNEALING:
Es la hibridación específica de los dos cebadores o primers a sus

secuencias complementarias monocatenarias. Esto ocurre a 50-
68°C (la temperatura dependerá de la composición de bases de
los cebadores). Esta etapa justifica que sea necesario conocer
parte de la secuencia.

CICLOS DE LA PCR
Es la replicación de la molécula monocatenaria mediante una ADN

polimerasa a partir del cebador. Estas enzimas son capaces de
adicionar dNTPs a partir de la región 3’ de un cebador y copiar una
secuencia molde. Las ADN polimerasas requieren ión magnesio
como cofactor para ser funcionales. Se usan polimerasas
termoestables (Taq polimerasas).

CICLOS DE LA PCR

CICLOS DE LA PCR
Un ciclo de PCR está constituido por las tres etapas descritas.

Al final de cada ciclo, el ADN se ha duplicado. En cada ciclo,
hay más moléculas que sirven de molde para la polimerasa por
lo que la amplificación es exponencial o logarítmica. En
teoría, mientras los reactivos no se agoten, el número de copias
obtenidas debería ser de 2n (n = nº de ciclos) pero en la
práctica el rendimiento es más bajo.

CICLOS DE LA PCR

FASES DE LA PCR
1. FASE EXPONENCIAL FASE LAG: (hasta 5 ciclos aprox).
2. FASE LINEAL: (hasta el ciclo 20 aprox) en cada ciclo se

duplican los fragmentos producidos en el ciclo anterior.
3. FASE PLATEAU: no se produce más amplificación.
En general, en una
PCR el nº de ciclos
varía entre 25 y 40.

POLIMERASAS UTILIZADAS
1. Al comienzo de la técnica: polimerasa aislada de E.coli (fragmento

Klenow de la ADN polimerasa I): actividad óptima a 37º C, y se
inactiva a 94º C, por lo que en cada ciclo era necesario agregar
más enzima.
2. Luego, se sustituyó por una polimerasa termoestable aislada de

Thermus aquaticus (Taq), una bacteria termófila que vive las
fuentes de agua termal (entre 50 y 80 o C).
Taq polimerasa soporta 95 ºC: permitió automatizar el proceso (en

un termociclador).

REACTIVOS NECESARIOS PARA LA PCR
1. dNTP, en exceso y en cantidades equimolares.

2. MgCl2, cofactor enzimático.
3. Dos cebadores (primers o iniciadores).
4. ADN polimerasa termoestable: resiste 30-40 s a 95ºC.
5. Tampón: regulación del pH.
6. ADN molde.
7. Agua.
Todos los reactivos a

utilizar en la PCR deben
estar libres de ADNasas y
ARNasas, certificado por
el fabricante.

¿CÓMO SE DISEÑAN LOS PRIMERS?
1. Los primers deben ser específicos (tienen un papel esencial

en la especificidad de la reacción).
2. No deben formar estructuras secundarias ni hibridaciones
inespecíficas entre ellos u otra parte de la cadena.
El diseño de las
secuencias cebadoras es
complejo, habitualmente
se utilizan programas
informáticos que facilitan
esta labor.

1 Los iniciadores deben ser únicos para la secuencia a amplificar; es

decir: tienen alta especificidad.
▪ Deben tener similar contenido en GC

y longitud.
▪ El extremo 3’ del cebador es muy
importante y se busca que sea una
base G o C (3 puentes de H).
▪ En los extremos 5’, no es
necesario que haya un 100 % de
complementariedad con la
secuencia blanco.

2 Los iniciadores no deben formar estructuras secundarias

internas o con otras secuencias (como horquillas o dímeros de
cebadores), especialmente si estas secuencias secuestran el
extremo 3’.
✓ Horquilla
✓ Dímeros de cebadores.
Cuanto menor es la cantidad de primers disponible en la reacción,

menor es el rendimiento de la misma, es decir, menor amplificación
de la secuencia de interés.

La Tm de ambos primers debe ser muy similar (2-3°C de

diferencia, como mucho) y no debe diferenciarse en más de 5°C de la
Tm del producto a amplificar.
La Tm depende del
%G+C y de la
longitud de la
cadena.

Respecto a la longitud de los iniciadores, debajo de los 18nt, hay

riesgo de hibridación inespecífica pero grandes longitudes van a
requerir altas Tm. Por ello, se establece como longitud óptima la de
20-30nt con una Tm de 55-65°C, compatible con la amplificación de
la generalidad de los fragmentos.

ADN POLIMERASA TERMOESTABLE
✓ La principal es la Taq-polimerasa.
✓ Se activa a 75°C y es estable hasta los 95°C. Esta

estabilidad permite la automatización del proceso
en el termociclador.
✓ Incorpora nucleótidos en el extremo 3’-OH libre

utilizando como molde la hebra complementaria.
✓ Procede de Thermus aquaticus, una bacteria

termófila de manantiales de agua caliente.
✓ Añade unos 1000nt/minuto.
✓ Carece de actividad exonucleasa, por lo que no

corrige errores.

Otras polimerasas son las AmpliTaq® que son enzimas de arranque

en caliente que utilizan una modificación química para inhibir la
actividad de la enzima a temperatura ambiente. Se trata de una
enzima que se activa a una temperatura superior a la temperatura de
hibridación del cebador. Por lo tanto, los únicos productos
extendidos y amplificados son aquellos con cebado altamente
específico.

Otras ADN-polimerasas termoestables han sido posteriormente aisladas y

modificadas por ingeniería genética como la Pfu (de Pyrococcis furiosus),
la Vent (Thermococcus litoralis) y Tth (Thermus termophilus). Pfu y Vent
tienen capacidad de corrección de errores.


ESQUEMA PCR CONVENCIONAL
1. Inicio de la desnaturalización.
2. Ciclos de amplificación: desnaturalización- hibridación-elongación).
3. Amplificación final.
4. Conservación temporal.

1 DESNATURALIZACIÓN PREVIA
Calentamiento de la reacción anterior al inicio de los ciclos. Suele

realizarse en torno a 95°C durante 5-12 minutos. Se realiza para la
desnaturalización de la doble cadena del ADN muestra, la activación
de la polimerasa y la inactivación de proteasas y nucleasas de la
muestra.

2 CICLOS DE AMPLIFICACIÓN
Son unos 25-40 ciclos que se repiten consecutivamente. En ellos, la

temperatura va variando durante un tiempo programada para que se
realice cada una de las fases descritas.
1. DESNATURALIZACIÓN: 94-95°C,30-
60s. Separación de las hebras de ADN.
2. HIBRIDACIÓN o ANNEALING:50-
65°C, 30-40s. Unión de los cebadores
al ADN desnaturalizado.
3. ELONGACIÓN: 72-75°C, 1-3min.
Elongación de los cebadores realizada
por la polimerasa.

2 CICLOS DE AMPLIFICACIÓN
1. Si la muestra de partida es de
mayor tamaño que la región
diana, empezarán a aparecer
copias exactas de la diana a
partir del tercer ciclo de
amplificación.
2. Si la muestra de partida es el
propio fragmento diana, todas las
copias aparecidas desde el
primer ciclo serán iguales a la de
partida.

3 ELONGACIÓN FINAL
Prolongación de la última elongación manteniendo la temperatura a 72-

75°C durante unos 5 minutos. Permite que se completen todos los
fragmentos.
4 CONSERVACIÓN TEMPORAL
Refrigeración en el propio termociclador de los productos amplificados a

4°C hasta su procesado posterior.

PROGRESO DE LA REACCIÓN
Nº de Nº de
Nº de ciclos Nº total de
copias copias Diana/total
realizados copias
“largas” diana
1 2 2 0 0
2 4 4 0 0
3 8 6 2 25%
4 16 8 8 50%
5 32 10 22 69%
10 1.024 20 1.004 98%
20 106 40 106 99,996%
40 1012 80 1012 100%
n 2n 2n 2n-2n

TERMOCICLADOR
Es el equipo en el que se
realiza la PCR de manera
automatizada pues permite
que los cambios de
temperatura se den de
forma rápida, exacta y
precisa. Normalmente,
trabajan entre 4 y 96°C.

ELECTROFORESIS. VISUALIZACIÓN DE LA
PCR CONVENCIONAL
✓ Se realiza por electroforesis en geles de

agarosa o de acrilamida.
✓ Permite la separación de los fragmentos

según su tamaño.
✓ Los fragmentos de ADN tienen cargas

negativas que, en el campo eléctrico, se
moverán hacia el polo positivo, migrando
más rápido cuanto menor sea su tamaño.
✓ El amplificado aparece como una banda.

REDUCIR LA CONTAMINACIÓN
Lo más probable es que

la contaminación
provenga de la extracción
de la propia muestra
biológica, del ácido
nucleico molde o de los
amplicones (productos
de PCR).

REDUCIR LA CONTAMINACIÓN
Para evitar la contaminación, se

prescribe trabajar en tres áreas
diferentes, separadas
físicamente y que los materiales
de cada área no se utilicen en
las demás.
El flujo de trabajo debe darse
desde ÁREAS LIMPIAS (sin
ADN) a ÁREAS SUCIAS (con
ADN o amplicones).

ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO
ÁREA 1: PRE-PCR. ÁREA 3: POST- PCR.

Preparación de las Electroforesis.
muestras y mezclas de
reacción.
ÁREA 2: PCR o PCR-SETUP.

Termociclador.

SEGUNDA PARTE: PCR MÚLTIPLE
(MULTIPLEX-PCR)
MULTIPLEX PCR
Es el empleo de 2 o más pares de cebadores en un único tubo con el fin
de ampliar simultáneamente diferentes fragmentos de ADN. Ahorra
tiempo y reactivos pero el diseño de cebadores es aún más exigente pues
deben permitir la detección de cada diana y no interferir en las demás.

DISEÑO DE CEBADORES DE PCR - MULTIPLEX
En PCR-múltiple, los cebadores cumplen

algunos criterios específicos:
1. No deben complementarse entre
ellos (hibridaciones inespecíficas).
2. Deben tener temperaturas de
hibridación similares.
3. Cada pareja debe amplificar
una única secuencia diana.
4. Deben generar amplicones de
tamaños diferentes que permitan su
distinción por electroforesis.

DISEÑO DE CEBADORES DE PCR - MULTIPLEX

PCR - MULTIPLEX
U T I L I DA D :
La PCR-múltiple permite:
✓ El análisis simultáneo de múltiples marcadores moleculares
asociados a alguna enfermedad: búsqueda de varias deleciones,
mutaciones y polimorfismos en uno o varios genes.
✓ Detección simultánea de varios agentes patógenos.
✓ Identificación de organismos genéticamente modificados.
✓ Etc.

TERCERA PARTE: RT-PCR

Q-PCR (PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL)
La PCR a punto final presenta una serie de desventajas como la dificultad para
cuantificar el producto amplificado o el riesgo de contaminación en el
laboratorio. La PCR a tiempo real o Q-PCR se desarrolló para solventar estos
problemas, permitiendo la cuantificación de los ácidos nucleicos.

RT-PCR
(PCR CUANTITATIVA
A TIEMPO REAL)
La Q-PCR se emplea para determinar el número de copias o cantidad relativa

de una determinada secuencia de ADN o ARN. Los procesos de amplificación
y detección se producen de manera simultánea, sin necesidad de realizar
ninguna acción adicional como la electroforesis.

Durante la amplificación, se mide por fluorescencia la cantidad de ADN
sintetizado en cada momento, la cual es proporcional a la cantidad de ADN
formado.
Permite evaluar y
registrar en todo
momento la cinética de
la reacción de
amplificación.
La cuantificación está facilitada por la adición de fluoróforos que se van
uniendo al amplicón, de manera que a mayor cantidad de producto, mayor
fluorescencia se emitirá.
¿CÓMO SE CUANTIFICA?
RT-PCR (PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL)
La PCR en tiempo real, combina la amplificación y la detección en el

mismo paso gracias a que es capaz de emitir en cada ciclo una señal
fluorescente de intensidad variable.
Entre sus principales características figuran:
✓ Alta especificidad.
✓ Presenta un rango de detección muy amplio.
✓ Rapidez en obtener los resultados debido a que no necesita la

electroforesis que se hace después de las PCR para analizar
los resultados.

RT-PCR (PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL)
En la PCR en tiempo real, además de los reactivos usados en el resto

de PCR, es necesaria la presencia de fluorocromos; por lo tanto, se
necesita:
✓ Un termociclador para que realice los ciclos.
✓ Un fluorómetro para poder captar la señal fluorescente.
✓ Un hardware y software adecuados para analizar los datos

obtenidos.

Los termocicladores detectan la cantidad de fluorescencia producida en cada
ciclo de PCR y, mediante un software de análisis, se representa gráficamente
dicha fluorescencia respecto al número de ciclos.

En una gráfica de amplificación de Q-PCR, el eje vertical representa la
cantidad de fluorescencia normalizada y el eje horizontal, el número de
ciclos.

Para este tipo de PCR, los termocicladores incorporan un lector de
fluorescencia que simultáneamente a la reacción indican en la pantalla la
fluorescencia emitida por cada muestra evaluada, lo que permite saber en el
momento real en el que empieza la amplificación.

FLUORÓFOROS ESPECÍFICOS.
Son sondas de ácidos nucleicos marcadas con fluorocromos que se unen a

amplicones específicos.
DESVENTAJAS: necesitan diseño

VENTAJAS: son muy precisos
de secuencias específicas para su
y evitan posibles secuencias
uso como sondas, lo que es
inespecíficas presentes en el
elaborado y costoso.
producto de la PCR.
FLUORÓFOROS GENÉRICOS.
Son colorantes que se unen a todas las secuencias de doble cadena del ADN a
modo de agentes intercalantes. Cuanto más producto hay, más cantidad de
fluorescencia se emite.
VENTAJAS: DESVENTAJAS: se unen a todas las

no necesitan moléculas de ADN de doble cadena,
diseños por lo que son muy inespecíficos
específicos. (falsos positivos).

FLUORÓFOROS GENÉRICOS.
SYBR-Green®, EvaGreen®
Colorantes que se unen inespecíficamente al ADN de doble cadena
produciendo fluorescencia. Se insertan entre las bases del ADN
interrumpiendo la alineación y el emparejamiento de bases de las cadenas
complementarias.
EvaGreen
SYBR- Green®
DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.
Los estudios de expresión se basan en la amplificación de ARN que, en
realidad, no pueden ser amplificado por la polimerasa. Esto se resuelve
convirtiendo el ARN en ADN gracias a la transcriptasa inversa.

APLICACIONES DE LA Q-PCR.
1. Identificar pequeñas mutaciones o polimorfismos en genes causantes

de enfermedades hereditarias.
2. Genotipaje usando las curvas de fusión ya que cada fragmento
generado tendrá diferente tamaño y, por tanto, diferente Tm.
3. Detección de patógenos de relevancia clínica con gran enfásis en ensayos
cuantitativos para virus, bacterias, levaduras y protozoos.
4. Diagnóstico oncológico eficiente pues requiere de pequeñas
cantidades de tejido y es útil en ensayos de amplificación y expresión
de genes, duplicación y deleción genética.
5. Detección de mutaciones puntuales, diagnóstico, seguimiento y respuesta al
tratamiento.
6. Monitorización para seguridad alimentaria, bioterrorismo,
biotecnología, etc.
VENTAJAS RESPECTO A LA PCR CONVENCIONAL.
✓ La PCR convencional es medida a tiempo

final mientras que la qPCR monitoriza el
proceso de PCR.
✓ Un aumento en la señal de fluorescencia es
directamente proporcional al número de
amplicones generados.
✓ No necesita procesamiento post-PCR.
✓ Al usar sistemas cerrados, se reduce el riesgo
de contaminación.
✓ Cuantifica la concentración inicial del ácido
nucleico con mayor sensibilidad.
https://youtu.be/e74YYdSHraY
https://youtu.be/kvQWKcMdyS4
CUARTA PARTE: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS
La electroforesis se fundamenta en que:
1. Las biomoléculas poseen una carga

eléctrica cuya magnitud depende del
pH del medio en el que se encuentran.
2. A consecuencia de los anterior cuando se

someten a un campo eléctrico, pueden
desplazarse hacia el polo de la carga
opuesta al de la molécula.

CARGA DE LAS MOLÉCULAS
✓ ÁCIDOS NUCLEICOS: carga – por grupo fosfato (migran al ánodo)

✓ PROTEÍNAS(SDS): carga – .
Migración de las moléculas a través

de un gel u otro tipo de matriz
porosa según su:
✓ Peso molecular.
✓ Tamaño.
Movimiento generado por el campo
eléctrico.
CUBETA DE ELECTROFORESIS

La cámara de electroforesis es el dispositivo que permite la generación del

campo eléctrico alrededor del gel donde se depositan las muestras.
La cámara cuenta con dos polos que se

conectan a una fuente de energía.
El gel se encuentra
sumergido en una
solución tampón y el
campo eléctrico se
genera en ella. La
solución mantiene el
pH estable al paso de
la corriente.

SOPORTE PARA LAS MUESTRAS
✓ Evita perturbaciones mecánicas durante la separación.
✓ Se usa un gel semisólido de polímeros que forman una malla o microporos
tridimensionales a través de los cuales avanzan las moléculas según el peso
molecular, permitiendo la separación por tamaño de los diferentes
componentes de la muestra.
✓ Pueden ser de agarosa o poliacrilamida.
▪ Para la separación de ácidos nucleicos se usan geles de agarosa o
acrilamida.
▪ Para proteínas de acrilamida.
SOPORTE PARA LAS MUESTRAS

GEL DE AGAROSA
Polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de

mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente, se disuelve a
50-60ºC (líquida) y se solidifica cuando se enfría, formando un gel
muy poroso.

GEL DE AGAROSA
PREPARACIÓN
Se pesa la agarosa requerida, se disuelve en una solución amortiguadora

(TAE o TEB) adecuada de la misma composición y concentración que el buffer
de electroforesis y se calienta hasta formar una solución.

GEL DE AGAROSA
PREPARACIÓN
Sin dejar enfriar se vacía inmediatamente sobre un molde de forma rectangular

y en uno de los extremos se coloca un peine para generar los pocillos u
orificios donde se colocarán las muestras.

GEL DE AGAROSA
PREPARACIÓN

GEL DE AGAROSA
CONCENTRACIÓN
✓ Según el tamaño del ácido nucleico que se

vaya a analizar: ADN (geles – concentrados:
1%), productos de PCR (geles +
concentrados: 2%)
✓ El tamaño de los poros del gel depende de la

concentración de agarosa y ésta es
inversamente proporcional al tamaño del
poro obtenido
✓ A mayor concentración, menor tamaño de los

poros, y viceversa, si los poros son pequeños
la migración del ácido nucleico es más lenta.

GEL DE AGAROSA
CONCENTRACIÓN
✓ Los ácidos nucleicos con peso molecular

alto migran más lentamente que los de
menor PM porque tardan más tiempo en
atravesar los poros de agarosa.
✓ La concentración de agarosa más

utilizada para electroforesis de ácidos
nucleicos es de 0’5 a 2%.

GEL DE ACRILAMIDA (PAGE)
CONCENTRACIÓN
✓ La acrilamida es un polímero sintético,

termoestable, incoloro y químicamente
inerte.
✓ Genera geles con un amplio intervalo

de tamaños de poro.
✓ El gel es el resultado de la
polimerización de la mezcla
acrilamida - bisacrilamida.
✓ El tamaño de poro está determinado por la concentración. Regulando la

concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades,
siempre menor que la de los geles de agarosa.

✓ La acrilamida es una neurotoxina, por lo
que debe manejarse con precaución.
✓ Es esencial almacenarla en un lugar
refrigerado, seco y oscuro para reducir la
autopolimerización y la hidrólisis
✓ El gel soporta mayores voltajes que la
agarosa y es susceptible de teñirse por
varios procedimientos, y puede
desteñirse en caso necesario.
✓ Los geles pueden digerirse para extraer
fracciones separadas (bandas) o
desecados para su exposición radiográfica
y registro permanente.
✓ La EF se realiza en cámaras verticales.
✓ La EF de proteínas emplea geles de acrilamida.


AGAROSA VS ACRILAMIDA
✓ La agarosa no es tóxica.
✓ Permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con peso moleculares
variados, según la concentración de agarosa que se emplee.
✓ El poder de resolución de la agarosa es menor que el de la acrilamida.
✓ PAGE se usa para la separación de fragmentos más pequeños y cuando
se quiere obtener una mayor resolución.
✓ PAGE es más laboriosa de realizar e interpretar.

BUFFER GELES ACRILAMIDA
✓ El buffer de electroforesis es el
mismo con el que se prepara el
gel de resolución.
✓ Proporciona el medio para la transmisión
de la corriente eléctrica y mantiene el pH
sin variaciones mientras se realiza la EF.
✓ Para los AN pueden emplearse TBE o
TAE.
✓ Para la PAGE: TBE.
✓ TBE (tris, borato, EDTA).
✓ TBA (tris, ácido acético, EDTA).

MARCADOR DE PESO MOLECULAR
Son moléculas de ADN que permiten determinar por comparación el tamaño
de los fragmentos de ácidos nucleicos contenidos en las muestras sometidas
a electroforesis. Están disponibles comercialmente en amplia variedad.
Pueden ser:
▪ Fagos o plásmidos sometidos
a corte con enzimas de
restricción que generan
fragmentos de tamaño
conocido.
▪ Moléculas de ADN sintéticas
(escaleras: porque contienen
fragmentos con incrementos
de tamaño gradual).

MARCADOR DE PESO MOLECULAR

BUFFER DE CARGA
✓ Da peso, densidad y color a la muestra, lo
que facilita su depósito en el pocillo y evita
su salida del gel.
✓ Permite monitorizar el corrimiento de la muestra
en el gel.
✓ Se emplea en relación 1:3 respecto a la cantidad
de muestra.
✓ Contiene Tris, azul de bromofenol, sacarosa o
glicerol (dan densidad a la muestra depositándola
en el fondo del pocillo).
Azul de bromofenol es una molécula muy

pequeña con carga negativa que migra al
polo positivo muy deprisa.
No interacciona con el ADN (migra
independientemente de él) con lo que no sirve
para visualizarlo sino que permite ver cómo
avanza la electroforesis (marca el frente).
TRANSILUMINADOR UV
✓ Ilumina la muestra en el gel con luz UV, excitando la molécula

cromogénica que emite energía fluorescente que permite visualizarla.
✓ Es el sistema empleado con más frecuencia por ser simple y efectivo.

ELECTROFORESIS HORIZONTAL
Se realiza en gel de agarosa para ácidos nucleicos. Se cubre el gel con el tampón
para evitar que se seque por el calentamiento inducido por el paso de la corriente
eléctrica.
La carga de la muestra en los pocillos puede realizarse

de dos maneras:
✓ En seco: se llena parcialmente la cámara con tampón
de EF de tal manera que la parte superior del gel no se
cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse
sin la interferencia del líquido. Una vez cargada la
muestra, se corre durante unos minutos a bajo voltaje
hasta que la muestra entre en el gel y, entonces, se
cubre del todo con el buffer.
✓ EF submarina: la totalidad del gel se cubre el tampón.
La muestra se coloca con el gel sumergido en el buffer.

ELECTROFORESIS HORIZONTAL

ELECTROFORESIS VERTICAL
Se realiza en gel de acrilamida y permite la separación de proteínas y de ácidos

nucleicos de pequeño tamaño. El gel está contenido entre dos placas rectangulares
de vidrio donde la corriente eléctrica se genera gracias al buffer en el que se encuentra
embebido el gel y llena las cubetas o compartimentos del ánodo y el cátodo.

PROCEDIMIENTO GENERAL
1. Preparar un gel (de agarosa o

acrilamida) a la concentración
requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar
con un buffer de carga adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la EF al voltaje
pertinente.
5. Visualizar los ácidos nucleicos.

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
✓ El método más común para la electroforesis de ADN es en gel horizontal

de agarosa, con una concentración de 0’5 - 3%.
✓ La carga eléctrica negativa de la molécula de ADN la otorgan sus grupos
fosfato.
✓ Como la forma de la molécula de ADN siempre es la misma, la movilidad
depende de la longitud del ADN (pb) y se representa en bandas.


✓ La electroforesis se realiza a voltajes de 30-130 V (a mayor voltaje

mayor velocidad de migración).
✓ El avance electroforético se monitoriza a través de la visualización de los
colorantes (azul de bromofenol y azul de xileno) contenidos en el tampón
de carga con el que se mezcló la muestra antes de su colocación en el
pocillo.
✓ Si los fragmentos de ADN son pequeños (<50 pb) o se requiere discernir
entre fragmentos de AN con diferencia de longitud de 1- 20 pb, se debe
usar gel de poliacrilamida.
ADICIÓN DE MUESTRAS
✓ Solidificado el gel, se añade el buffer de EF (TAE

o TBE) a concentración 1x, cubriendo el gel (0’5
a 1 cm por encima) y se retiran los peines.
✓ Las muestras se mezclan con el tampón de carga y
se depositan en los pocillos, evitando que se
salgan y puedan entrar en otros pozos
contaminándolos.
✓ En al menos uno de los carriles se añade el
marcador de PM, para la determinación del PM de
la muestra. Este marcador también debe mezclarse
con el TC.

TRANSMISIÓN DE LA CORRIENTE
✓ Se conectan los cables de la fuente de energía (cada polo eléctrico) a

la cámara de EF en el electrodo que le corresponda y se aplica un
voltaje de acuerdo con el PM de las moléculas de ADN que se va a
separar.
✓ Para productos de PCR (100 pb-1’5 kb), se recomienda usar voltajes de
75-100 V.
✓ Para muestras de ADN genómico y plasmídico (> 2 kb) se recomienda
25 -75 V.
TRANSMISIÓN DE LA CORRIENTE
✓ Durante la EF se monitoriza la migración de la muestra con

colorantes en el tampón de carga(azul de bromofenol y azul de
xileno-verde).
✓ En geles de agarosa al 2% el azul de bromofenol se comporta
como un fragmento de 100 pb.
✓ La EF se detiene cuando la muestra se localiza en la posición
deseada, o cuando ha corrido 3/4 partes del gel.
¿QUÉ FACTORES PUEDEN AFECTAR A LA
MIGRACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS?
✓ La concentración del gel.

✓ El tamaño de la molécula de ADN muestra, su empaquetamiento.
✓ El voltaje.
✓ La composición del buffer de EF, su temperatura (que puede
aumentar demasiado si el voltaje es muy alto).
✓ La contaminación con agentes intercalantes en la muestra, etc.
VISUALIZACIÓN DE LAS MOLÉCULAS
✓ Se emplea el bromuro de etidio, un agente intercalante.

✓ Se trata de una molécula fluorescente que se intercala entre las
bases del ADN.
✓ Absorben luz en el ultravioleta y emiten en el visible.
✓ Está en desuso por su peligrosidad.
Se incorpora a la agarosa
(0.5 mg/ml) antes de la
solidificación, o después
de la EF, incubando el gel
en una solución que lo
contenga a 0.5 mg/ml.

Por su peligrosidad, se tiende a sustituir el bromuro de etidio por otros

colorantes que se pueden añadir durante la elaboración del gel o bien una
vez finalizada la EF sumergiendo el gel en tampón con el colorante:
✓ Fluoróforos no carcinogénicos y menos mutagénicos como SYBR® Safe,
que se une de manera no covalente a los ácidos nucleicos y se visualiza
con UV.
✓ Fast DNA Stain (BioRad®), una tinción no fluorescente.
Otra alternativa es el nitrato de plata para geles de acrilamida. Se trata de un

reactivo con más resolución que el bromuro de etidio, más económico y menos
tóxico. Sin embargo, no es totalmente inocuo pues lleva asociado el uso de
reactivos peligrosos como el formaldehído.
El PAGE también puede ser revelado con radiactividad (radiografía del gel).

ESTIMACIÓN DE LA CALIDAD DEL ADN
Degradación, mala resuspensión, presencia de ARN, contaminación con sales,
etc.
Mala resuspensión
Se soluciona diluyendo más.
Contaminación con sales
No se ha lavado bien con etanol; se
soluciona volviendo a lavar.
ESTIMACIÓN DE LA CALIDAD DEL ADN
Degradación, mala resuspensión, presencia de ARN, contaminación con

sales, etc.
Patrón electroforético de ácidos nucleicos

de Escherichia coli DH5αF’. Se aprecia el
DNA genómico (banda superior), el DNA Presencia de ADN genómico
plasmídico (banda tenue intermedia) y
diversas formas de RNA como el
ribosómico (mancha inferior). La agarosa no resuelve fragmentos
menores de 40 pb y aparece como una
Presencia de ARN mancha.
Los fragmentos mayores de 20.000 pb
Solo se observa abajo una
migran a la misma altura (DNAgenómico) y
línea continua. Se soluciona
aparecen como una única banda.
con tratamiento con ARNasas.

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS
1) SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE DIFERENTE

TAMAÑO DE UNA MUESTRA.
Esto permite comprobar la presencia de determinadas moléculas (análisis

cualitativo), valorar el tamaño de los fragmentos y estimar la concentración a
partir de la intensidad de las bandas (análisis semicuantitativo).

2) PURIFICACIÓN DE ADN.
Los fragmentos que sean de interés pueden purificarse a partir del propio gel y
ser utilizados: clonación, secuenciación, mutagénesis, fusión con otros
fragmentos, utilización como sondas, etc.

3) MAPAS DE RESTRICCIÓN.
Mediante el uso de enzimas de restricción, se obtienen fragmentos
determinados. Estos se pueden separar y ser transferidos a una membrana de
nylon o nitrocelulosa para realizar un Southern Blot. También se puede estimar
el tamaño de los fragmentos y realizar genotipado.

QUINTA PARTE: ELECTROFORESIS CAPILAR

ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis capilar (EFC) constituye una alternativa a la

electroforesis convencional realizada en un capilar.

Se realiza en capilares de sílice fundido de unos 20-200μm de diámetro

interno y de 10-100cm de longitud. Según el equipo, se requiere uno o más
capilares, pudiendo admitir hasta 96.

VENTAJAS.
Las razones del tremendo interés de la EFC en los últimos años se debe a una
serie de ventajas respecto a otros métodos:
1. Uso de altos voltajes (10-30kV) lo que deriva en procesos más rápidos
(5-30 minutos, incluso 1s).
2. La migración de las moléculas se sigue mediante detectores
(fluorescencia, conductividad, absorbancia, etc.).
3. Se aplica a todo tipo de sustancias, desde pequeños iones a
proteínas o ácidos nucleicos.
4. Consigue una gran resolución (buena separación de los componentes).
5. Se realiza en equipos totalmente automatizados lo que garantiza la
reproductividad.
6. Emplea cantidades ínfimas de muestra.
7. Consume volúmenes muy reducidos de tampón.
ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL O REDES
POLIMÉRICAS (ECG).
La separación de las moléculas está basada en la diferencia de tamaños y
cargas pero para la misma relación de carga, como es el caso del ADN, la
separación se basa únicamente en el tamaño; es decir: en el número de
pares de bases de los fragmentos de ADN.
Es la técnica de EFC que permite la

separación de ADN. Esta técnica se
desarrolló con el propósito de
permitir la separación de grandes
moléculas. Se basa en el uso de un
polímero que actúa como tamiz
molecular.

ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL O REDES
POLIMÉRICAS (ECG).
En esta electroforesis, los capilares se rellenan de gel como la agarosa o la

acrilamida para formar una matriz entramada que dificulta el paso de las
partículas.
EFC. FUNCIONAMIENTO.
Para el análisis del ADN, el capilar se rellena de un polímero. En los extremos del
capilar, se colocan dos viales: vial de entrada y vial de salida, rellenos de una
disolución tampón. Cada uno de ellos contiene un electrodo y están conectados a
una fuente de voltaje. Actúan como ánodo y cátodo.
Cátodo Ánodo
Vial de Vial de
entrada salida
EFC Vs. EF CONVENCIONAL.
1. Los fragmentos de ADN a separa están marcados con

fluorescencia.
2. Mayor exactitud y sensibilidad.
3. Mayor resolución.
4. Mayor reproductibilidad.
5. Fácil interpretación.
6. Se observan picos en vez de bandas.
7. Procedimiento (inyección, separación y detección) automático.
8. Separaciones rápidas.
9. Más costosas.
SEXTA PARTE: APLICACIONES DE LA
ELECTROFORESIS
DISCRIMINACIÓN ALÉLICA POR TAMAÑO.
Existen una serie de trastornos debidos a la expansión de tripletes (mutación en
donde un triplete se repite más veces de lo normal) que pueden detectarse con
esta técnica.
Expansión de
tripletes
Atrofia
Síndrome X- frágil Distrofia Enfermedad de
muscular
miotrófica Huntington
bulboespinal
ANÁLISIS DE STRs.
Las repeticiones cortas en tándem (Short Tandem Repeats o STRs) son
secuencias cortas de ADN no codificante que se repiten un número
determinado de veces.
En el ejemplo, la unidad de repetición "GATA" es igual para

todas las personas; lo que varía de unas personas a otras, es
el número de veces que se repite.

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APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE PCR Y ELECTROFORESIS AL ESTUDIO DE

✓ La PCR es una técnica que genera in vitro un gran número

✓ Se trata de una clonación molecular pues se amplifica el

✓ Simula una replicación natural del ADN in vitro.

✓ El análisis de ácidos nucleicos ha provocado un avance sin

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Antes del desarrollo de la PCR, la

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La PCR, sin embargo, es una

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✓ Clonación acelular de fragmentos de ADN.

✓ Detección de secuencias sin purificación previa.

✓ Preparación de muestras para secuenciación de ácidos nucleicos.

✓ Establecimiento de polimorfismo de secuencia.

✓ Tipificación de ADN para trasplantes.

✓ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular.

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La replicación in vitro del ADN consiste en la amplificación selectiva de

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✓ Una secuencia sirve de molde a

✓ El sentido de la síntesis es 5’→3’

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1 DESNATURALIZACIÓN DE LA DOBLE HEBRA DE ADN:

2 ANILLAMIENTO O ALINEAMIENTO O ANNEALING:

3 ELONGACIÓN O EXTENSIÓN O POLIMERIZACIÓN:

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Es la aplicación de calor (95°C) para separar la doble hélice

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Es la hibridación específica de los dos cebadores o primers a sus

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Es la replicación de la molécula monocatenaria mediante una ADN

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3 ELONGACIÓN O EXTENSIÓN O POLIMERIZACIÓN:

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Un ciclo de PCR está constituido por las tres etapas descritas.

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2. FASE LINEAL: (hasta el ciclo 20 aprox) en cada ciclo se

3. FASE PLATEAU: no se produce más amplificación.

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1. Al comienzo de la técnica: polimerasa aislada de E.coli (fragmento

2. Luego, se sustituyó por una polimerasa termoestable aislada de

Taq polimerasa soporta 95 ºC: permitió automatizar el proceso (en

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1. dNTP, en exceso y en cantidades equimolares.

Todos los reactivos a

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1. Los primers deben ser específicos (tienen un papel esencial

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1 Los iniciadores deben ser únicos para la secuencia a amplificar; es

▪ Deben tener similar contenido en GC

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2 Los iniciadores no deben formar estructuras secundarias

Cuanto menor es la cantidad de primers disponible en la reacción,

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