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1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 1
2. DIAGNÓSTICO GENÉTICO........................................................................... 5
3. REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA: PCR
Prácticamente todas las muestras que entran en un laboratorio de
estudios genéticos tienen que pasar en algún momento por la técnica de PCR
(reacción en cadena de Ia polimerasa).
Estos tres pasos o fases conforman un ciclo que se repite unas 30 o 40 veces.
Puesto que cada cadena que se sintetiza en el ciclo anterior sirve de molde para
en cada el siguiente, ciclo se duplican las copias de ADN. Así la cantidad de ADN
obtenido crece de forma que es exponencial y pueden conseguirse al final del
proceso millones de copias de un
Componentes de Ia PCR
[NOMBRE DEL AUTOR] 7
ADN molde:
EI primer paso antes de iniciar una PCR es extraer el ADN que se quiere
amplificar, normalmente a partir de muestras de sangre o de parafina. EI
protocolo de extracción y de PCR cambia en función del origen de la muestra ya
que el ADN puede haberse visto afectado de forma diferente por los diferentes
mecanismos de preparación de muestras.
Cebadores:
Otros componentes:
Mutaciones Dinámicas
Son secuencias cortas repetidas, similares a las anteriores pero para las
que, en este caso, su repetición y/o expansién sí afecta a la expresión o función
de algún gen. Son por tanto repeticiones de nucleótidos en tándem que pueden
adquirir un tamaño patológico. Se denominan dinámicas porque este carácter
patológico depende del número de repeticiones. Hay muchas mutaciones
dinámicas descritas tanto en zonas exónicas como intrónicas. Algunos ejemplos
pueden verse en la enfermedad de Hunüngton, ataxias cerebroespinales,
distrofia miotónica, etc, todas ellas debidas a expansiones de tripletes.
Este sistema de ensayo tiene una relación señal / ruido muy buena. La
popularidad de los ensayos SYBR® Green I con los usuarios de PCR en tiempo
real se debe a tres factores: 1) bajo costo para el tinte; 2) facilidad de desarrollo
del ensayo, solo se requiere un par de cebadores; y 3) se puede usar el mismo
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mecanismo de detección para cada ensayo. El lado negativo es que cada
molécula bicatenaria producida en la reacción generará una señal, tal como
dímeros de cebador o productos de PCR inapropiados. Este hecho pone una
prima alta en el buen diseño del cebador y el control cuidadoso de la calidad
durante el desarrollo del ensayo. También significa que una ADN polimerasa de
arranque en caliente es un requisito para disminuir o eliminar las señales extra
ensayos (7).
Figura 1
Representación gráfica de la
incorporación del colorante SYBR®
Green I, resultando en un aumento
de la señal fluorescente durante la
PCR. El colorante libre tiene una
fluorescencia muy baja y no se unirá
a ADN monocatenario o
desnaturalizado. Durante el
recocido de cebador, se forma una
estructura bicatenaria y se une el
colorante SYBR® Green I, dando
como resultado un aumento
espectacular de la señal
fluorescente. Durante la extensión
del cebador por la ADN polimerasa Taq, la señal fluorescente aumenta proporcionalmente al
número de moléculas de colorante SYBR® Green I unidas por molécula bicatenaria. El proceso
se repite en cada ciclo con aumento de la fluorescencia total.
Las sondas FRET están compuestas por dos sondas; un fluoróforo donador,
que excitado por una fuente de luz externa, emite luz, absorbida por un segundo
fluoróforo próximo a él, denominado aceptor. Este aceptor emite luz a una
longitud de onda distinta del donador. Esta luz puede medirse. Para que este
fenómeno ocurra, ambas sondas deben estar muy próximas entre sí. Por lo que
deben diseñarse de manera específica para que hibriden con el DNA objetivo en
regiones muy cercanas, que permitan, que tras la excitación del fluoróforo
donador, éste sea capaz de excitar al fluoróforo aceptor, en la zona interna del
3) SondasTaqman:
Es una única sonda formada por un reporter, fluoróforo que emite a una
determinada longitud de onda; y un quencher, que absorbe la luz emitida por el
reporter haciendo que dicha emisión no sea detectada. El quencher puede ser
un fluoróforo o una molécula que no emite fluorescencia. Tras la fase de
elongación de la PCR, se libera el reporter por un fenómeno de hidrolización y
se produce la detección. Es decir, durante la elongación la sonda se une al DNA
y cuando la polimerasa se encuentra con la sonda, gracias a su actividad
exonucleasa (actividad que degrada el DNA que encuentra por delante) degrada
la sonda liberando el reporter.
Figura 2
Ilustración gráfica que muestra la generación de
señales fluorescentes a partir de una sonda
TaqMan®. Cuando está libre en solución, el
colorante fluorescente reportero se apaga
mediante una segunda molécula usando FRET. A
medida que la reacción se enfría hacia la
temperatura de recocido, la sonda se une a una
secuencia plantilla complementaria a una
temperatura más alta que la imprimación en la
misma cadena. Durante la extensión del cebador
por ADN polimerasa Taq, la sonda se desplaza y
se degrada por una nucleasa 5 'presente en Taq
ADN polimerasa. La liberación del colorante
indicador de la molécula de sonda y su
proximidad al colorante de extinción permite que
se realice la señal completa del colorante indicador.
1) Genotipado:
Curvas Melting o Curvas de Fusión:
o Cada ADN se caracteriza por su Tm o temperatura de Fusión, que se
define como la temperatura en la que el 50% del ADN está en cadena
simple (mitad del DNA está desnaturalizado).
o La Temperatura de fusión de un producto de PCR puede monitorizarse
midiendo la disminución de fluorescencia por incremento de Ia
Temperatura se obtienen así las curvas de fusión.
o Variaciones de la Tm del producto de PCR: la Tm depende de la
secuencia del fragmento que estemos amplificando. Un fragmento bajo
en GC tendrá una Tm más baja, mientras que un fragmento rico en GC,
tendrá una Tm más alta. El tamaño o longitud del fragmento también
modifican la Tm, así como las concentraciones de sal y otros
componentes de la reacción.
2) Cuantificación
Ejemplos:
En este caso no se utilizan estándares sino que se utiliza el ADN del receptor,
antes del trasplante, como calibrador. Lo que se analizan son polimorfismos
informativos de inserciones o deleciones, así como alelos nulos.
La PCR digital lleva ya desarrollada desde hace unos años, pero ha sido
durante el último año cuando se ha iniciado su incorporación en diferentes
laboratorios para su utilización de forma rutinaria. La base de la PCR digital es
dividir una única reacción de PCR en miles de reacciones. Esta modificación de
la PCR a tiempo real permite hacer cuantificaciones absolutas. Funciona con
sondas TaqMan por lo que se puede diseñar una sonda para un alelo mutante y
una sonda para el alelo normal y ver la proporción de cada uno. Normalmente la
reacción es fragmentada en alrededor de 12000-15000 PCRs. La técnica permite
la cuantificación de cantidades iniciales muy pequeñas ya que al subdividir la
muestra la proporción de un alelo de baja frecuencia en la muestra general se
ve incrementada en algunas de las micromuestras. Dependiendo del número de
reacciones vacías, se sabe cuántas reacciones se tiene con 1, 2…5 copias, ya
que se sigue un modelo de distribución de Poisson, Se puede obtener ratios
entre alelos raros y alelos común. Se puede cuantificar hasta un ratio del 0.01%.
Figura 3
Equipo y materiales para llevar a cabo una PCR: Termociclador, puntas, placa de PCR, microtubos
y juego de micropipetas.
Figura 4
Perfil térmico típico de una PCR. Los tiempos de cada fase son orientativos. La temperatura de
hibridación puede variar en función de la especificidad de la reacción.
DEL VIH
5.1. Dinámica de replicación viral del VIH-1
– Hay situaciones excepcionales en las que la carga viral es muy útil para el
diagnóstico o confirmación de infección por VIH-1. Por ejemplo, en el diagnóstico
El volumen de plasma requerido para cada técnica varía entre 200 y 1.000
μl.
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