Nombre: Danna López

Materia: Biología Molecular

Grupo: 2

PCR en tiempo Real y digital PCR

La PCR en tiempo real es una técnica que combina amplificación y detección en
el mismo paso, correlacionando el producto de la PCR de cada uno de los ciclos
con una señal de intensidad de fluorescencia.

Pasos para realizar la PCR:

• Aislamiento y caracterización ARN

• Síntesis de cDNA
• Adquisición datos de real time
PCR
• Generación de factores de
normalización
• Datos normalizados
• Análisis de datos

El PCR en tiempo real es un método que se basa en la detención de la presencia

de material genético en específico de los patógenos y los virus esta técnica es
donde existen copias genéticas.

Sybr Green sondas TaqMan

Este colorante también se puede usar en diferentes

blancos de amplificaciones. Se incorpora también a la
estructura secundaria de la doble hélice del ADN y se
une energéticamente a los ácidos nucleicos que la
componen, por lo que su tasa de emisión de
fluorescencia aumenta significativamente.
sondas TaqMan

El sistema de detección específico para una

secuencia de interés se puede dividir en tres
categorías: sondas de hidrólisis, sondas híbridas
,sondas de horquilla.

Todos se basan en el principio FRET, según el

cual consiste en una transferencia de energía
entre dos fluoró foros: un donante informado y un
aceptor apagado y emiten flúor.

Interpretación de resultados.
Es esta pcr los datos se comienzan a recopilar durante la fase de exponencial,
la fluorescencia es un indicador donde se ve los resultados y números de
ampliaciones que se generan durante la pcr.

Ventajas Desventajas
• Sensibilidad • Requerimiento de equipo y reactivos
• Trancripcion reversa costosos.
• Amplicones pequeños • La polimerización puede tener erros al
• Cuantificación sintetizar el ADN.
• Amplio rango dinámico • A la alta sensibilidad se necesita un
correcto diseño experimental.
• Las técnicas deben ser normalizadas para
conclusiones precisas.
Aplicaciones

• Ver enlaces para Clínica y diagnóstico.

• Diagnóstico de alergias.
• Anatomía patológica.
• Diagnóstico de enfermedades autoinmunes.
• Investigación sobre el cáncer.
• Cultivo celular y transfección.

Digital PCR
La PCR digital funciona separando una muestra de ADN o ADNc en muchas
reacciones de PCR individuales en paralelo; algunas de estas reacciones
contendrán la molécula diana (positiva), mientras que otras no (negativa). Una
sola molécula se puede amplificar un millón de veces o más.

Pasos:

• Preparacion de la muestra
• División o distribución de la muestra.
• Amplificación
• Droplet digital PCR
• La secuenciación

Funciona dividiendo una muestra de ADN o ADNc en muchas reacciones de

PCR individuales en paralelo. Estas reacciones pueden contener (positivo) o
no (negativo) la molécula diana. Una sola molécula puede amplificarse
millones de veces o más.

Interpretación de resultados.
En esta pcr digital los resultados de cuantificación sus análisis permiten que
tengan una mayor precisión sus resultados da fragmentos negativos en los
cuales se ajustan a los estadísticos de poisson.
 Ventajas Desventajas
• No es necesario depender • Se requiere un manejo mas
de referencias o estándares. especifico.
• Capacidad para aumentar la
• Como es digital es un poco
precisión mediante más
repeticiones de PCR. mas costoso
• Alta tolerancia a los • Menor sensibilidad
inhibidores.
• Capacidad para analizar
mezclas complejas.

Aplicaciones

• Deteccion de mutaciones poco frecuentes

• Analisis de variación en el numero de copias
• Analisis de expresión genética
• Analisis de expresión de mARN
• Deteccion de microrganismos patógenos microbianos
• Monitorizacion de aguas residuales con dPCR
• Cuantificacion de carga vírica
• Deteccion de GMO

PCR en tiempo Real Digital PCR

• Mayor especificidad con el uso • Detención durante la fase

de la sondas .
• Detención sobre la fase
exponencial temprana.
• Rango dinámico de detención
amplia.
• Mayor sensibilidad
exponencial.
• Menor especificidad.
• Menor sensibilidad
• Requerimiento de reactivos de
bajo costo.