Bioinformática y herramientas computacionales para el análisis de secuenciación de

próxima generación en genética clínica:

(galvis- Ricardo- Juan)

DIAPO 3

Primeros métodos de secuenciación:

Secuenciación sanger Secuenciación de Maxan-gilbert

Utiliza los didesoxinucleótidos y Se basa en la modificación química del

dependiendo de dónde se encuentren ellos ADN, específicamente en la modificación
se va a dar la terminación de la cadena de sus bases nitrogenadas (adenina,
que se está formando y así obtenemos citosina, guanina, timina) con la posterior
fragmentos de diferentes tamaños escisión del esqueleto de ADN en los
puntos adyacentes a los nucleótidos
Este tipo de secuenciación se convirtió en modificados
el método estándar de secuenciación y
marcó el inicio así de las tecnologías de
secuenciación de primera generación, con
ello vino el desarrollo también de varias
máquinas de secuenciación basadas en
este tipo de secuenciación sanger

El conjunto de métodos que surgieron después de la secuenciación sanger son los

que se conocen como secuenciación de próxima generación.

Estos funcionan bajo el principio de secuenciar millones de fragmentos de ADN

simultáneamente lo cual permite analizar cientos de genes y proporcionar grandes
cantidades de datos de secuenciación a un costo moderado

DIAPO 4

Pirosecuenciación 454

· Fue 1 de los primeros que se incluyeron al mercado

· Éste propuso que no se utilizarán los nucleótidos marcados, sino que la secuenciación se
hiciera con pirofosfato

· Este método de pirosecuenciacion fue utilizado para la secuenciación del genoma,

metagenoma, pero, sin embargo, con el paso del tiempo dejó ser competitivo y no se siguió
utilizando

· La secuenciación necesitaba de 3 enzimas:

- Polimerasa (polymerase): la cual se encarga de introducir el nucleótido, y como

subproducto se obtiene el pirofosfato
 - Sulfurilasa (sulfurylase): el pirofosfato utiliza la sufurilasa para convertirse en ATP

- Luciferasa (luciferase): forma un complejo con el ATP y se produce una señal,

esta señal es captada por un secuenciador y luego es reproducida en el pirografo
como un pico

- Apirasa (apyrase)*esta se añade posterior al proceso mencionado*: se encarga

de degradar los nucleótidos que no fueron incorporados a la secuenciación y
degradar los restos que no fueron utilizados, esta enzima ayudó a que se
disminuyeran los costos por los lavados que se tenían que hacer para introducir un
nuevo nucleótido

DIAPO 5

Los métodos de secuenciación de segunda generación se pueden agrupar en dos

categorías principales:

1) Secuenciación por hibridación: Sirve para determinar el orden en que se

producen nucleótidos en una hebra de DNA haciendo posible construir información de
secuencia contigua más grande, basada en información superpuesta de los puntos de
hibridación de la sonda permitiéndonos identificar SNP (polimorfismos de un solo
nucleótido) relacionados con enfermedades en genes específicos o identificar anomalías
cromosómicas graves.

DIAPO 6

2) Secuenciación por síntesis (SBS): ‘’lectura corta’’, las moléculas de ADN

individuales que se van a secuenciar se distribuyen en millones de pozos o cámaras
independientes, o se unen a ubicaciones específicas en un sustrato sólido. Las
moléculas de ADN, amplificadas por PCR o mediante métodos de amplificación de
"círculo rodante" isotérmicos modificados, se someten luego a reacciones de síntesis de
ADN en las que se pueden obtener imágenes de nucleótidos marcados, o reacciones
químicas basadas en la incorporación de un nucleótido particular.

DIAPO 7

Secuenciación de Illumina:

se basa en una técnica conocida como "amplificación en puente" en la que se utilizan

moléculas de ADN con adaptadores ligados en cada extremo como sustratos para
reacciones de síntesis de amplificación repetidas en un portaobjetos de vidrio, que contiene
secuencias de oligonucleótidos complementarias a un adaptador ligadunirse

Los oligonucleótidos del portaobjetos están espaciados de manera que el ADN, que luego
se somete a rondas repetidas de amplificación, crea "agrupaciones" clonales que constan
de aproximadamente 1000 copias de cada fragmento de oligonucleótido

Un problema que puede surgir con la secuenciación de Illumina es la falta de sincronía en

las reacciones de síntesis entre los miembros individuales de un grupo, lo que interfiere con
la generación de una secuencia de consenso precisa y reduce el número de ciclos que se
pueden realizar Ippo

pasos:
 1. Preparación de la muestra o librería: esté a su vez consta de 3 pasos:

-Fragmentación del adn

-Adición de adaptadores en cada 1 de sus extremos (del fragmento)

-Se adiciona más cantidad de material que se va a fragmentar.

2. Generación de los clusters:

-esto se realiza en una celda de flujo, la cual es un portaobjetos de vidrio que tiene
varios carriles en los cuales se han colocado millones de nanoporos, y en estos
nanoporos vamos a encontrar dos tipos de oligos.

-La hebra se va a unir por su parte del adaptador al oligo que está en el nanoporo,
Este oligo va a tener una secuencia de nucleótidos complementaria que va a permitir
hacer la hibridación

-El otro lado de la hebra se va a unir a otro oligo, y gracias a una polimerasa se va a
complementar la secuencia.

-La hebra luego sufre una desnaturalización para quedar en forma monocatenaria.
Este proceso se repite varias veces para poder formar el clusters

-Cuando tenemos el clusters realizado podemos pasar a la secuenciación por

síntesis

3. Secuenciación por síntesis

-Los nucleótidos van a competir por unirse a la cadena en crecimiento, y solo se van
a poder unir los nucleótidos que sean complementarios, y posteriormente van a
emitir una señal que es con lo que se va a generar la secuencia

4. Análisis de los datos de la secuencia

DIAPO 8

Ion Torrent: convierte directamente la secuencia de nucleótidos en información digital en

un chip semiconductor. Las reacciones de secuenciación de Ion Torrent ocurren en millones
de pozos que cubren un chip semiconductor que contiene millones de píxeles que
convierten la información química en información de secuenciación; La incorporación de
nucleótidos se convierte directamente en voltaje que se registra directamente, lo que
acelera enormemente el proceso.

También consta de diferentes pasos como lo son:

1. Preparación de la librería (es igual a la preparación de las librerías de la tecnología

ilumina)
2. Preparación de las perlas
- En este proceso se coge cada una de las secuencias que están Unidas a las perlas
para hibridarse y así sacar secuencias complementarias hasta que se logre cubrir toda la
perla

- Una vez se tenga toda la perla cubierta se puede colocar en un chip semiconductor

3. Secuenciación por síntesis

- En este proceso cada vez que se adicione un nucleótido se va a liberar un Ion

hidrógeno, y este Ion hidrógeno va a implicar un cambio en el ph en la solución, y este
cambio de ph a su vez se va a reflejar como un cambio de voltaje, y el cambio en el voltaje
va a ser la señal que nos ayude a realizar la secuenciación

4. Análisis de datos

DIAPO 9-10-11

Métodos de secuenciación de tercera generación, PacBio y secuenciación SMRT

Tienen como objetivo secuenciar moléculas largas de ADN y ARN, el actual Líder
tecnológico en el mercado es PacBio el cual proporciona dos sistemas de secuenciación:

● Modelo RSII original

● Mas reciente el Sequel™

La secuenciación se realiza sobre un chip que contiene muchas ZMW. Dentro de cada una
de ellas se encuentran fijas una ADN polimerasa activa y una molécula de ADN molde de
cadena sencilla. La ZMW permite que la luz penetre y se cree un espacio de visualización
que permite monitorizar la actividad de la ADN polimerasa. La señal procedente de la
incorporación de un nucleótido por parte de la ADN polimerasa se detecta durante la
síntesis de ADN, de ahí que se trate de una secuenciación a tiempo real.

Cada una de las cuatro bases nitrogenadas que forman parte del ADN se encuentra
marcada con una molécula fluorescente diferente que permite su identificación durante la
secuenciación por síntesis. La molécula fluorescente se une al grupo fosfato del nucleótido,
y cuando éste se incorpora a la cadena de ADN, el complejo fluoróforo-fosfato es liberado
como consecuencia de la formación del enlace fosfodiéster que tiene lugar durante la
elongación de la cadena de ADN. Posteriormente, la señal de fluorescencia difunde fuera
del área de detección y no se detecta más.

DIAPO 12:

Posible pasar moléculas de ADN largas a través de “agujeros” de diámetro pequeño y medir
corrientes diferentes a medida que cada nucleótido pasa por un detector enlazado.

En teoria, se podrían pasar más de cien kb de ADN a traves del nanoporo, y con muchos
canales , lográndose decenas a cientos de Gb de secuencias a costos bajos.

Se están desarrollando dos tipos de sistemas de nanoporos para la secuenciación de ADN,

los sistemas de membranas biológicas y la tecnología de sensores de estado sólido.
 ● La secuenciación biológica de nanoporos se basa en el uso de proteínas
transmembrana incrustadas en una membrana lipídica para producir los poros.
● La tecnología de sensores de estado sólido utiliza varios sustratos de metal o
aleación de metal con poros de tamaño nanométrico que permiten el paso del ADN o
ARN.

La secuenciación de ADN basada en nanoporos se propuso por primera vez a fines de la

década de 1990 y Oxford Nanopore Technologies (ONT) ha logrado recientemente la
comercialización con un MinION portátil (canales de celda de flujo de 512 nanoporos)

DIAPO 13:

1. Las moléculas largas de DNAds se unen primero a una enzima procesiva.

2. Una hebra de ADN entra al nanoporo y la velocidad de translocación.
3. La enzima procesiva permite que el ADN sea “racheado”.
4. Cada nucleótido proporciona señal que se registra como un evento de interrupción.
5. 100kb de ADN pueden pasar por el poro y ser detectados.

Debido a su pequeño tamaño portátil, el MiniON tiene potencial para muchas aplicaciones
dada su portabilidad, actualmente la tasa de error es alta, pero como muchos otros métodos
de secuenciación de alto rendimiento, esto puede evitarse mediante la gran cantidad de
moléculas que se pueden secuenciar.

Se ha utilizado para:

● Secuenciar muestras animales.

● Identificar cepas bacterianas.
● Genomas virales, vigilancia ambiental.
● Identificar modificaciones de bases.
● Identificar eventos epigeneticos

DIAPO 14-15

La bioinformática nos permite generar el contexto clínico a toda la información obtenida de

la secuenciación.

Se divide en 3 pasos:

1. Análisis primario: aquí se obtienen las señales netas con el objetivo de generar
lecturas de secuenciación legibles y apuntar la calidad de la base.

2. Análisis secundario: incluye la alineación de lecturas con el genoma humano de

referencia y las variantes de llamada.

3. Análisis terciario: Este paso aborda la interpretación de los datos o sea, en el

contexto de la genética humana, buscar el vínculo entre los datos variantes y el
fenotipo observado en un paciente.
DIAPO 16-17

Análisis primario:

Se hará uso del software de Ion Torrent

- Cuando se agrega un nucleótido, éste emite una señal la cual va a ser detectada,
interpretada y grabada por el sensor como un dato de información de voltaje. luego,
estos datos van al servidor y se van a transformar en archivos Wells (una
compilación de varios nucleótidos). Fin almente, se realiza la entrega final del
análisis la cual consiste en escoger todos los archivos de Wells y ordenarlos en una
secuencia de nucleótidos que sean las más probables de encontrar en el genoma
humano. Esto es realizado por el torrent basecaller donde se genera un archivo
BAN donde están las posibles secuencias de nucleótidos más probables de
encontrar en el genoma humano.

DIAPO 18

Análisis secundario:

En esta fase se establece la alineación y detección de variables:

- Aquí se identifican las aberraciones genómicas que se van a generar en las lecturas
que obtuvimos luego del análisis primario. por lo que a partir de las lecturas que se
obtuvieron se va a revisar si son las que se obtendrían normalmente en una persona
sana.
- Las alteraciones a detectar van a ser de cuatro tipos:
1. De un solo nucleótido
2. De pequeñas inserciones o deleciones
3. Reordenamientos estructurales.
4. Cambios en el número de copias.

Las aberraciones genómicas pueden ser también de 2 tipos:

1. constitucionales: De novo o heredadas.

2. somáticas o adquiridas.

DIAPO 19

Pasos a seguir en el análisis secundario

1. Alineación de lecturas con un genoma humano de referencia: puede ser con un

genoma novo sin embargo este no es habitual. Esta alineación va a ser posible
gracias a un algoritmo que va a mapear sitios de lecturas que coincidan con el
genoma de referencia para que de esta forma se alineen y poder detectar las
variantes que tengamos.
 2. Eliminar o filtrar las lecturas duplicadas: de no realizar este paso, el software las
va a tomar como lecturas independientes y se van a crear unas variantes incorrectas
con una cobertura errónea.
3. Llamada de variantes: después de realizados los pasos anteriores, se busca que
partes de nuestra lectura son diferentes a la de nuestro modelo de referencia, para
lograr esto, necesitamos emplear software. En este punto, entran cortes empíricos,
enfoques estadísticos más avanzados que nos permitirán evidenciar una frecuencia
mayor de variantes.

DIAPO 20-21-22-23

Análisis terciario:

Este proporciona el contexto clínico y aplicación de todas las variantes obtenidas a partir del
análisis secundario, ya que el análisis secundario solo da información sobre cuáles eran las
posiciones de las variantes, y cuáles serán los cambios de los nucleótidos o alguna
mutación, pero no nos aclara si esto puede producir patología o no.

Consta de dos pasos:

1. Anotación de la variante: se obtiene a través de diferentes software, esto nos

orienta a si una variante puede o no producir enfermedad.
ANNOVAR: es de los software más utilizado para este fin y compara directamente la
variante que le entrega el análisis secundario en una base de datos ya existente
para saber si ya se conocen variantes similares que puedan producir la enfermedad.
También analiza el impacto de la variación y también los puede alertar en caso de
que una variante muy rara no se encuentre en la base de datos de fácil acceso. Esto
lo vuelve muy importante para detectar variables en alteraciones mendelianas.

2. Filtrado de variantes, priorización y visualización

- es una consecuencia directa del proceso anterior. Es necesario filtrar ya que

la búsqueda por este software arroja alrededor de 30000 y 50000 variantes
patológicas, es así como se vuelve necesario optimizar este proceso.
- a la vez, se requieren tres tipos de filtro:
1. Filtro de frecuencia en la población: nos indica qué tan frecuente es el
alelo en la población.
2. Filtro de ubicación: determina si la variante está en un intrón o un
exón. Si está en una región intrónica que no codifica, generalmente
no produce enfermedad.
3. Otros filtros: hacen el análisis sobre la proteína que puede llegar a
producir esa variante.

Visualización:
Se deben tener tres pasos en cuenta:
 1. Validación y priorización
2. Interpretación
3. Reporte

ANEXO

Descripción general de las tecnologías de secuenciación de próxima generación

2) El método Maxam-Gilbert: se basa en la modificación química del ADN y la

posterior escisión (división) del esqueleto del ADN en los sitios adyacentes a los
nucleótidos modificados.

Siguiendo con Sanger, la metodología de terminación, la automatización y la

comercialización le han permitido seguir siendo el método de secuenciación más
apropiado para muchas aplicaciones actuales. Las innovaciones más significativas en la
secuenciación de Sanger han sido:

1. El desarrollo de tintes fluorescentes (terminadores)

2. El uso de secuenciación de ciclo térmico y polimerasas termoestables
3. Desarrollo de software para interpretar y analizar las secuencias

Un aspecto importante a tener en cuenta es que El líder en secuenciación automatizada

de Sanger es Applied Biosystems (AB) donde todos los AB comercializados actualmente
utilizan tintes fluorescentes y electroforesis capilar.

Métodos de secuenciación de segunda generación:

La necesidad de una secuenciación de mayor rendimiento de genomas grandes a

menor costo desencadenó el desarrollo de muchas tecnologías de segunda generación
o "Nextgen".

También tenemos:

- Ion Torrent: convierte directamente la secuencia de nucleótidos en información

digital en un chip semiconductor. Las reacciones de secuenciación de Ion Torrent
ocurren en millones de pozos que cubren un chip semiconductor que contiene
millones de píxeles que convierten la información química en información de
secuenciación; La incorporación de nucleótidos se convierte directamente en voltaje
que se registra directamente, lo que acelera enormemente el proceso.
- Secuenciación de Illumina: se basa en una técnica conocida como "amplificación
en puente" en la que se utilizan moléculas de ADN con adaptadores apropiados
ligados en cada extremo como sustratos para reacciones de síntesis de
amplificación repetidas en un soporte sólido (portaobjetos de vidrio) que contiene
secuencias de oligonucleótidos complementarias a un adaptador ligado. Los
oligonucleótidos del portaobjetos están espaciados de manera que el ADN, que
luego se somete a rondas repetidas de amplificación, crea "agrupaciones" clonales
que constan de aproximadamente 1000 copias de cada fragmento de
oligonucleótidos.

Un problema que puede surgir con la secuenciación de Illumina es la falta de

sincronía en las reacciones de síntesis entre los miembros individuales de un grupo,
lo que interfiere con la generación de una secuencia de consenso precisa y reduce
el número de ciclos que se pueden realizar.

Secuenciación de "tercera" generación (molécula única de fragmento grande)

los métodos de secuenciación de tercera generación tienen como objetivo

secuenciar moléculas largas de ADN (y ARN).El actual líder tecnológico
comercializado en esta área es Pacific Biosciences (PacBio) el cual proporciona dos
sistemas de secuenciación, el modelo RSII original y más recientemente, el
Sequel™.

La secuenciación PacBio, también conocida como secuenciación SMRT (Singe

Molecule Real Time), permite secuenciar fragmentos muy largos, de hasta 30-50 kb
o más. Este método implica la unión de una ADN polimerasa diseñada, con ADN
unido a secuenciar, al fondo de un pocillo.Un ZMW es una pequeña cámara que
guía la energía de la luz hacia un área cuyas dimensiones son pequeñas, en
relación con la longitud de onda de la luz que ilumina.Los cuatro nucleótidos están
marcados con diferentes fluoróforos ligados a fosfo para la detección diferencial.
Cuando se incorpora un nucleótido en la cadena en crecimiento, la formación de
imágenes se produce en una escala de tiempo de milisegundos a medida que se
une el nucleótido marcado con fluorescencia correcta. Después de la incorporación,
se libera el resto fluorescente ligado a fosfato, que "flota lejos" del fondo del ZMW y
ya no puede detectarse. A continuación, se puede incorporar el siguiente nucleótido.

La formación de imágenes se sincroniza con la velocidad de incorporación de

nucleótidos para que cada base se identifique a medida que se incorpora a la
cadena de ADN en crecimiento. Esto ocurre simultáneamente en paralelo en hasta
un millón de ZMW de zeptolitros, presentes en un solo chip dentro de las células
SMRT.

La preparación de la plantilla es única en el proceso PacBio, ya que implica la

producción de un "SMRTbell", una molécula de ADN de doble hebra circular con una
secuencia adaptadora conocida complementaria a los cebadores utilizados para
iniciar la síntesis de ADN en la plantilla. Estto permite que la polimerasa lea a través
de moldes grandes numerosas veces atravesando la molécula circular en cada
ZMW, hasta que la polimerasa se detenga, para construir una secuencia de
consenso (CCS,secuencia de consenso circular) proporcionando información
complementaria de ambas hebras del ds "SMRTbell".
Una ventaja importante del proceso de detección y secuenciación de imágenes en
tiempo real de PacBio es que se puede medir la velocidad de cada adición de
nucleótidos durante la síntesis, denominada duración entre pulsos (IPD) esto permite
detectar y catalogar muchas modificaciones diferentes para estudios epigenéticos.

La secuenciación PacBio SMRT sufre de una tasa de error inherentemente alta, pero
esto generalmente se supera debido a la profundidad del número de pasadas de
lectura obtenidas en cada ZMW para cada plantilla SMRTbell.

La secuenciación PacBio SMRT ofrece varias ventajas sobre los métodos anteriores.
Permite la identificación rápida de sitios de metilación para estudios epigenéticos,
además de proporcionar lecturas largas para conjuntos de genomas.usando la
tecnología PacBio, es relativamente sencillo ensamblar una secuencia completa del
genoma bacteriano usando solo unas pocas células SMRT y determinar los patrones
de metilación dentro.

En términos de rendimiento, PacBio RS II (2013) utiliza chips con 150.000 ZMW, que
cuando se optimizan, pueden generar hasta 350 megabases de secuencia por celda
SMRT. La optimización se lleva a cabo utilizando una distribución de Poisson de
modo que solo una molécula de ADN unida a la polimerasa debería estar en cada
pocillo. El último instrumento PacBio, el Sequel, tiene 1 millón de ZMW y puede
generar ~ 365 000 lecturas, con lecturas promedio de 10 a 15 kb (7,6 Gb de salida)
proporcionando lecturas más largas y más precisas.

Tecnologías en la cúspide de la "cuarta" generación

Se están desarrollando dos tipos de sistemas de nanoporos para la secuenciación

de ADN, los sistemas de membranas biológicas y la tecnología de sensores de
estado sólido.La secuenciación biológica de nanoporos se basa en el uso de
proteínas transmembrana incrustadas en una membrana lipídica para producir los
poros. Se han estudiado ampliamente dos proteínas que se han utilizado para
generar poros: alfa hemolisina y Mycobacterium smegmatis porina A (MspA). La
velocidad del paso del ADN a través de los poros está regulada por la adición de
proteínas motoras, como una ADN polimerasa altamente procesadora (phi29) que
atraviesa el ADN tras la adición de nucleótidos.

El ADN se puede mover a través de los poros a una velocidad constante durante
decenas de miles de nucleótidos. La tecnología de sensores de estado sólido utiliza
varios sustratos de metal o aleación de metal con poros de tamaño nanométrico que
permiten el paso del ADN o ARN.

Las moléculas largas de dsDNA se unen primero a una enzima procesiva, como la
polimerasa phi29. Cuando el complejo encuentra un nanoporo, una hebra de ADN
entra en el nanoporo y la velocidad de translocación a través del poro está regulada
por la síntesis y translocación de la ADN polimerasa. La enzima procesiva permite
que el ADN sea "racheado" continua y procesivamente a través de él.Cuando un
nucleótido pasa a través del poro, interrumpe una corriente que se ha aplicado al
nanoporo. Cada nucleótido proporciona una señal electrónica característica que se
registra como un evento de interrupción actual. La grabación se realiza en tiempo
real y, si bien las lecturas de 10 kb son ahora una salida razonable, en teoría, 100 kb
de ADN pueden pasar a través de cada nanoporo y ser detectados. Una vez que el
ADN ha dejado un nanoporo, el poro está disponible para ser utilizado por una
molécula de ADN diferente.
Debido a su pequeño tamaño portátil, el MinION tiene potencial para muchas
aplicaciones donde la portabilidad o los requisitos de espacio son un lujo.
Actualmente, la tasa de error es relativamente alta, pero al igual que con otros
métodos de secuenciación de alto rendimiento, esto puede evitarse mediante la gran
cantidad de moléculas que se pueden secuenciar.

Esta tecnología se ha utilizado para secuenciar muestras ambientales y

metagenómicas, se encuentra actualmente en la estación espacial y se ha utilizado
para la identificación de cepas bacterianas. Se han realizado genomas virales,
vigilancia ambiental y haplotipado utilizando MinION. También permite identificar
fácilmente eventos epigenéticos.

Métodos auxiliares para la secuenciación de alto rendimiento y la finalización

de grandes proyectos de genomas

Mapeo Optico: Utiliza métodos de marcado distribuidos a lo largo de moléculas de

ADN largas en posiciones de nucleótidos según la secuencia. Estos proporcionan
grandes andamios para "fijar" secuencias conocidas en mapas del genoma. Al crear
un "mapa físico visual" a lo largo de grandes moléculas de ADN.

útil para completar grandes proyectos de genomas(cromosomas tamaño-contigs) y

otras aplicaciones, como la identificación de reordenamientos en genomas, también
se usa para ensamblaje del genoma, comparar estructuras genómicas y corregir
errores de ensamblaje del genoma.Una de las principales ventajas de este método
es que evita la clonación o artefactos de PCR y analiza una sola molécula a la vez.

comienza cortando el ADN genómico a un tamaño grande (100 mb a 1 gb). La clave

es etiquetar estos grandes fragmentos de ADN en sitios específicos para que las
moléculas etiquetadas se puedan visualizar y alinear para proporcionar mapas
superpuestos contiguo.

Luego, el marcaje se puede realizar en los extremos libres con tintes específicos o
mediante reacciones enzimáticas de "relleno" utilizando nucleasas monocatenarias e
incorporación de tintes de polimerización,

Los fragmentos resultantes se pueden unir a la superficie de portaobjetos de vidrio o

en cámaras lineales alargadas para obtener imágenes usando microscopía
apropiada. Una vez colocadas sobre los sustratos sólidos, las moléculas se alargan
físicamente. A continuación, se pueden dimensionar y las posiciones de la etiqueta o
etiquetas se pueden visualizar y registrar, creando un "mapa óptico" de esa
molécula.

Secuenciación de ADN por microscopía electrónica

La secuenciación de ADN por microscopía electrónica es otra tecnología de

secuenciación de una sola molécula, considerada por primera vez en las décadas de
1960 y 1970. Para ser visualizado, el ADN debe estar marcado con átomos pesados,
ya que el microscopio electrónico no puede visualizar los nucleótidos individuales
que contienen el isótopos estándar de carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y
fósforo en el ADN. El ADN debe desnaturalizarse, etiquetarse y estirarse en una
rejilla de microscopio electrónico, utilizando un método de "hipofase" para mantener
el ADN desnaturalizado y lineal.
 Tecnologías auxiliares

Cizallamiento de ADN: es fragmentar el ADN en un tamaño definido. Se

encuentran disponibles varios dispositivos de fragmentación de ADN de fragmentos
grandes para el aislamiento de ADN de varios tamaños para la construcción de
bibliotecas de ADN.

Cizalla de Covaris, Inc: proporciona varios dispositivos de cizallamiento acústico y

consumibles para permitir la fragmentación de ADN y ARN a tamaños apropiados
para la preparación de la biblioteca de fragmentos y ADN Para el aislamiento de
fragmentos más grandes, proporcionan un G-TUBE™, diseñado para cortar el ADN
en grandes fragmentos con un tamaño medio que varía de 6 kpb a 20 kpb a
temperatura ambiente (20 ° -30 ° C).

Diagenode, Inc. Megaruptor®: El Megaruptor fue diseñado para proporcionar un

dispositivo simple, automatizado y reproducible para la fragmentación mecánica de
ADN de 2 kb a 75 kb. El rendimiento de cizallamiento es independiente de la fuente,
la concentración, la temperatura o el contenido de sal de una muestra de ADN. El
software permite procesar secuencialmente dos muestras sin intervención adicional
del usuario y sin contaminación cruzada.

Fragmentación enzimática (NEBNext Ultra II FS) Número de producto de New

England Biolabs E7805): La enzima NEBNext Ultra II FS en el kit de preparación de
la biblioteca de ADN NEBNext Ultra II FS para Illumina contiene la mezcla de
enzimas necesaria para cortar una amplia gama de cantidades de entrada de ADN
en fragmentos para la secuenciación NextGen en la plataforma Illumina. La reacción
es generalmente de 5 minutos, con una etapa de destrucción por calor enzimática
por calor de 30 minutos a 65 ° C.

Ciencia sabía PIPPIN: Sage Sciences ha desarrollado una nueva tecnología para
generar fragmentos de ADN para secuenciación. El tamaño de ADN de 100 bp hasta
2mb se puede seleccionar y aislar mediante un dispositivo de electroforesis
modificado que recoge el tamaño de ADN seleccionado en minicámaras. Hay varias
versiones de sus máquinas disponibles, Pippin Prep, BluePippin o PippinHT, en las
que se recogen fragmentos de longitudes seleccionadas, eliminando todas las
demás.

Bioinformática para la próxima generación clínica

Secuenciación

USO DE BIOINFORMATICA EN LA PROXIMA GENERACION DE SECUENCIACION

CLINICA (clinical NGS)

La siguiente generación de secuenciación es una tecnología transformante que esta

redefiniendo el panorama de las pruebas genético-moleculares humanas. Esta permite la
comparación y estudio de secuencias que anteriormente no se podían investigar debido a
su complejidad, facilitando así la resolución múltiples paradigmas de las pruebas
moleculares con un giro rápido en cuanto al tiempo y disminuyendo los costos de estas.

El conducto analítico se considera que se distribuye principalmente en 3 fases de análisis,

primario, secundario y terciario. El análisis primario generalmente ocurre en el instrumento
de secuenciación que lleva a la generación de una secuencia genómica en un formato de
texto con certificación de calidad. El análisis secundario lleva a la detección de secuencias
variantes en distintas categorías biológicas y el análisis terciario puede incluir una
confirmación o validación de las variantes e información para contextualizar la variante
dependiendo de procesos analíticos minuciosos.

GENERACION DE SECUENCIA (ANALISIS PRIMARIO)

Es un proceso que integra fuertemente al software e instrumentos secuenciadores. Estas

herramientas convierten señales vírgenes que envían los instrumentos secuenciadores en
nucleótidos clasificados de forma clara y posteriormente permite la separación de
secuencias necesarias para un análisis determinado o simplemente investigación.

ALINEAMIENTO Y DETECCION DE VARIANTES (ANÁLISIS SECUNDARIO)

Consiste en la aplicación de métodos variables que operan juntos para detectar

aberraciones genómicas (alteraciones) basándose en la calidad de los datos disponibles
(genomas normales).

Dependiendo del protocolo a realizarse, se puede perfilar el proceso utilizando un programa

específico para detectar las aberraciones en un genoma completo, un exoma o genes
específicos. La variación encontrada puede variar e incluir variantes nucleótidos,
inserciones pequeñas y deleciones, o alteraciones largas como repeticiones o cambios
completos en el orden de nucleótidos. Incluso puede detectar si las variaciones son de novo
o heredadas, adquiridas, si afectan sólo a un subgrupo de células (como en el cáncer).
Todo lo anterior hace que el protocolo de análisis sea diferente en cada ocasión y que sea
muy minucioso (para encontrar lo que se mencionó antes), pero en general el proceso es
muy parecido siempre, se divide en 6 fases:

· Alineamiento del genoma

· Filtrado de duplicaciones en la lectura

· Lectura de realineamientos cerca de INDELs

· Recalibración de la puntuación de la calidad de la base

· Variant calling

· Filtrado de variantes falso/positivas

ANOTACION Y VISUALIZACIÓN (ANÁLISIS TERCIARIO)

En esta parte las variables son anotadas para determinar su significado e impacto biológico,
clasificándolas así de forma prioritaria y posteriormente dando la interpretación de estas.

PRIMERO SE DEBE “RECOPILAR INFORMACIÓN”

Anotación de (Se recopila información de distintas fuentes):

· Frequency – based: Se verifica la frecuencia poblacional de la mutación, pues

entre mayor sea indica una menor relevancia biológica para el ensayo clínico. Además,
sirve para eliminar los polimorfismos benignos de las listas de variantes

· Funtional (Structural based): Asigna causa – efecto, es decir que repercusión

tendrá la variante genómica en la transcripción de proteínas basándose en el cambio de
 aminoácidos resultante (Esto es porque se apoya en una base de datos HGVS que tiene
determinadas la repercusión que causa el cambio de unos aminoácidos)

· Predictive (Predictive based): En esta fase se usan los cambios en nucleótidos y/o
en aminoácidos para predecir posibles impactos de la variante en el producto final

· Evidence – based: Es la ultima parte de las anotaciones y es donde se verifica y

establece si hay alguna alteración en la secuencia analizada que corresponda a alguna
evidencia histórica o literal

DESPUÉS

· Validación: Se verifican las coincidencias de anotaciones con la secuencia

estudiada, así mismo, se corrige la gravedad de estas porque hay algunas alteraciones
que por ejemplo en la evidencia literal aparecen como alteraciones malignas o
problemáticas, mientras que la evidencia funcional dice lo contrario, de esta forma se
logran organizar de forma prioritaria las alteraciones.

· Interpretación: Es aquí donde se establecen cuáles son las alteraciones importantes

y la repercusión que pueden tener, así mismo se recopila información sobre
tratamientos, manejos y decisiones que se hayan tomado en otras ocasiones donde se
encontró la misma alteración.

· Reporte: Se muestra todo lo que se encontró previamente, es decir:

- Alteraciones importantes

- Repercusiones

- Decisiones posibles