La secuenciación de genomas nos ha provisto de información acerca del mundo microbiano.

La
secuenciación de Sanger (1977) ha sido el método de secuenciación más usado. Sin embargo, éste posee
limitaciones, entre las cuales se encuentran: necesidad de geles para electroforesis, análisis en paralelo
de bajo número de muestras, difícil total automatización, alto costo, sensibilidad insuficiente para
detección de mutaciones de bajo nivel y es incapaz de analizar eficientemente genomas diploides a un
bajo costo. Además, es difícil el ensamblaje de genoma de novo. A raíz de ésto, han surgido alternativas a
la secuenciación de Sanger, que son, la secuenciación por hibridación, por ligación y la
pirosecuenciación.

La pirosecuenciación, es la primera alternativa al método de Sanger convencional y se basa en la

detección de pirofosfato durante la síntesis de ADN. Cuenta con ventajas de precisión, flexibilidad,
procesamiento en paralelo y fácil automatización. Además, la técnica no tiene necesidad de utilizar
primers y nucleótidos marcados, y de electroforesis en gel.

El método consta de la unión de hebras únicas de DNA a una esfera (una hebra por esfera), por medio de
un adaptador, tras lo cual, son sometidas a clonamiento in vitro. Luego de que las esferas son cargadas,
ocurre la adición de las enzimas DNA polimerasa, sulfurilasa, ATP luciferasa y apirasa, y de los sustratos
APS y luciferin. A continuación, se agrega la solución de reacción, es decir, un dNTP a la vez, en ciclos. La
cascada comienza con la liberación de pirofosfato, el cual es convertido a ATP a través de la enzima
sulfurilasa en presencia de APS. El ATP generado, media en conjunto con la enzima luciferasa, la
conversión a oxiluciferina, generando luz. La degradación de dNTPs no incorporados y de ATP se produce
por la acción de la enzima apirasa. La luz emitida, es detectada por una cámara CCD y es observada como
un pic en el pirograma, proporcional al número de nucleótidos incorporados. De manera que la
secuencia de ADN, es demostrada mediante el pirograma.

Entre las ventajas de la pirosecuenciación, podemos decir, que es un método rápido y en tiempo real.
Por otra parte, la secuenciación comienza con la primera base a un lado del primer, de tal modo, que el
diseño del primer es más flexible. Otras ventajas, refieren la rapidez en la preparación de la muestra y los
costos bajos de reactivos.

Las aplicaciones de la pirosecuenciación son variadas, ya que dicho método se ha estado utilizando en
análisis de Polimorfismos de Nucleótido Único (SNP), identificación de bacterias y tipificación de hongos
y virus. La técnica, ha demostrado también, capacidad para realizar secuenciación de librerías de cDNA y
de genomas completos.

A pesar de las ventajas y aplicaciones mencionadas anteriormente, la pirosecuenciación, presenta ciertas

desventajas, tales como la secuenciación de tramos cortos de ADN y la dificultad para determinar el
número de nucleótidos incorporados en regiones homopoliméricas que contienen más de 5-6
nucleótidos.

El método de pirosecuenciación, ha demostrado excelente precisión en análisis de fragmentos de DNA

polimórficos. Esta tecnología, también se ha utilizado para cuantificación de frecuencias alélicas en
poblaciones y ya compite con otros métodos de secuenciación, siendo relativamente nueva. En el futuro,
se espera que alcance longitudes de lectura más largas, que reduzca el tiempo de secuenciación y que se
realicen mejoras en la automatización.
La pirosecuenciación es una tecnología que permite determinar el orden de una secuencia de ADN
mediante luminiscencia. Se basa en el principio de "secuenciación por síntesis" en el que se detecta la
incorporación de nucleótidos al ADN por acción de la ADN polimerasa. La particularidad de este método
es que detecta la liberación de pirofosfato cuando los nucleótidos son incorporados. A partir del
pirofosfato se generará luz por medio de diversas reacciones enzimáticas en cadena.

El ADN se desnaturaliza para obtener ADN monocatenario y se hibridará con un cebador. En el tubo de
reacción se encontrarán las enzimas luciferasa, ATP sulfurilasa, ADN polimerasa y apirasa además de los
sustratos luciferina y adenosín-5-fosfosulfato (APS).

A continuación se añaden los nucleótidos uno después del otro, al contrario que en una reacción de
secuenciación normal donde se añaden todos a la vez.

1. Si el nucleótido añadido al medio de reacción corresponde al que necesita la polimerasa, se incorpora

a la cadena que se está sintetizando (elongamiento) y se libera un pirofosfato.

2. Posteriormente, una ATP sulfurilasa en presencia del APS transforma este pirofosfato (PPi) en ATP ,
que se acoplará a la luciferina, formando un complejo el cual será utilizado por una luciferasa.

3. Como resultado se produce oxiluciferina y una señal luminosa de intensidad proporcional al número
de nucleótidos incorporados.Es el secuenciador o más precisamente el sensor CCD, el que captura esta
señal lumínica y lo reproduce como un pico en un pirograma.

Finalmente, una apirasa se encarga de degradar aquellos nucleótidos que no han sido incorporados y
quedan sueltos con el fin de que al añadir un nuevo dNTP, no existan restos de reacciones anteriores.

De esta forma se puede deducir la secuencia partiendo del tamaño de los picos obtenidos. Si hay un
polimorfismo en una secuencia no habría problemas para detectarlo pues el tamaño de los picos
también es proporcional a las cadenas portadoras de un nucleótido u otro.

Secuenciación 454

Es una variante de la pirosecuenciación descrita por Jonathan Rothberg y colaboradores de la empresa

454 Life Sciences en 2005.1 Esta técnica permite secuenciar de forma paralela y masiva muchos
fragmentos de ADN a la vez. De este modo la secuenciación 454 se convirtió en la primera tecnología de
la next-generation sequencing suponiendo una gran reducción en los precios de la secuenciación de
genomas completos. En 2013 la plataforma de secuenciación 454 dejó de ser competitiva y la compañía
Roche, que había adquirido 454 Life Science en 2007, decidió dejar de comercializarla.2

Procedimiento:

Fragmentar el ADN de doble cadena a secuenciar mediante un proceso conocido como nebulización para
así poder marcar los extremos con dos primers. Uno de ellos se va adherir a las microesferas y el otro se
usará para comenzar la amplificación. Finalmente, se separan los fragmentos del ADN de doble cadena
en su forma monocatenaria.
Mediante una emulsión de aceite se generan microesferas, dónde se unirá un único fragmento de ADN
monocatenario. Luego se añade una emulsión que contiene los microrreactores. En cada microrreactor
se encuentran los elementos necesarios para la reacción de PCR: oligonucleótidos, dNTPs, polimerasa y
un único fragmento de ADN molde.

Mediante la amplificación por PCR, se generan muchas copias del mismo fragmento de ADN original y los
fragmentos amplificados resultantes seguirán inmovilizados en las microesferas.

Después se liberan las cuentas de la emulsión y se colocan en placas donde ocurrirá la secuenciación.
Primero se vierte la emulsión sobre una fase sólida con celdillas en el cual solo cabe una microesfera.
Luego añadimos las enzimas sulfurilasa y luciferasa.

En cada una de estas celdas se produce una pirosecuenciación. La secuenciación completa se lleva a cabo
añadiendo uno de los cuatro nucleótidos y observando qué celdilla se ilumina. Después de cada adición
de nucleótidos se lava y se añade el siguiente nucleótido. Este proceso se repite hasta completar la
secuencia.

Los resultados se compararán con un genoma de referencia.

La pirosecuenciación es otro método enzimático que permite determinar la secuencia de una molécula
de ADN. Se necesitan los siguientes componentes:

• Un ADN de cadena sencilla que actúa como molde

• Un cebador para iniciar la síntesis de ADN

• 3res desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato

(dATP•S, un derivado del dATP que puede ser utilizado normalmente por la ADN-polimerasa pero que no
es reconocido por la luciferasa).

• Cuatro enzimas: ADN polimerasa (que cada vez que añade un nuevo desoxirribonucleótido trifosfato a
la cadena naciente genera una molécula de PPi), ATP sulfurilasa (que convierte el PPi en ATP en
presencia de APS), luciferasa (que, en presencia de ATP, convierte la luciferina en oxiluciferina y genera
un fotón de luz visible) y apirasa (que degrada los nucleótidos que no se han incorporado a la cadena
naciente y el ATPgenerado por la sulfurilasa).

• Adenosina 5'-fosfosulfato (APS)

• Luciferina