UNIVERSIDAD POPLULAR AUTONOMA DEL ESTADO DE PUEBLA

BIOLOGÍA MOLECULAR

PROFESOR:
SOLON JAVIER GARCES EISELE

ACTIVIDAD 3

SECUENCIACIÓN DE SANGER Y REPLICACIÓN

ALUMNA:
MARIA FERNANDA VICENTTIN PERUSQUÍA

ID: 3421378 MATRÍCULA: 74600906

FECHA:
5 DE NOVIEMBRE 2022

OTOÑO 2022
Secuenciación de Sanger
La secuenciación de Sanger consiste en hacer muchas copias de una región blanco de ADN.
Sus ingredientes son similares a los necesarios para la replicación del ADN en un
organismo o para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que copia el ADN in vitro.
Los ingredientes son:
 Una enzima ADN polimerasa
 Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN monocatenario que se une al
molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.
 Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
 El molde de ADN que será secuenciado.
una reacción de secuenciación de Sanger también contiene un ingrediente único:
 Versiones didesoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro nucleótidos
(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos de color
diferente.

 Los nucleótidos didesoxi no tienen grupo hidroxilo en el carbono 3' del anillo de
azúcar. En un nucleótido normal, el grupo hidroxilo 3' actúa como un "gancho" que
permite que un nuevo nucleótido se añada a una cadena existente.
 Una vez que se añade a la cadena un nucleótido didesoxi, ya no hay un hidroxilo
sobre el que se puedan agregar más nucleótidos. La cadena termina con el
nucleótido didesoxi, que está marcado con pigmento de un color particular
dependiendo de la base (A, T, C o G) que lleve.
La muestra de ADN que se secuenciará se combina en un tubo con el cebador, la ADN
polimerasa y los nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dGTP y dCTP). También se añaden
los cuatro nucleótidos didesoxi terminadores de la cadena, marcados con su pigmento, pero
en cantidades mucho más pequeñas que los nucleótidos normales.

Primero se calienta la mezcla para desnaturalizar el molde de ADN (separar las cadenas) y
luego se enfría para que el cebador pueda unirse al molde de cadena sencilla. Una vez que
se ha unido el cebador, se eleva la temperatura para que la ADN polimerasa pueda
sintetizar ADN nuevo a partir del cebador. La ADN polimerasa añadirá nucleótidos a la
cadena hasta que aleatoriamente agregue un nucleótido didesoxi en lugar de uno normal. A
partir de ese momento, no es posible agregar más nucleótidos y la cadena termina con el
nucleótido didesoxi.

Este proceso se repite cierto número de ciclos. Cuando los ciclos terminan, está
prácticamente garantizado que se ha incorporado un nucleótido didesoxi en cada una de las
posiciones del ADN blanco en al menos una reacción. Es decir, el tubo contendrá
fragmentos de diferentes longitudes que terminan respectivamente en cada una de las
posiciones de los nucleótidos del ADN original (observa la siguiente figura). Los extremos
de los fragmentos tendrán el pigmento que indica su nucleótido final.
Cuando la reacción termina, los fragmentos se hacen pasar a través de un tubo largo y
delgado que contiene una matriz de gel en un proceso llamado electroforesis capilar en
gel. Los fragmentos cortos se mueven rápidamente a través de los poros del gel, mientras
que los fragmentos largos se mueven más lentamente. Cuando cada fragmento cruza la
"línea de meta" al final del tubo, un láser lo ilumina y permite la detección del pigmento
asociado.
El fragmento más pequeño (que termina justo un nucleótido después del cebador) es el
primero que cruza la línea de meta, seguido por el próximo fragmento más pequeño (que
termina justo dos nucleótidos después del cebador) y así sucesivamente. De esta manera, se
puede reconstruir nucleótido por nucleótido la secuencia del fragmento de ADN original a
partir de los colores de los pigmentos registrados uno tras otro por el detector. Los datos
registrados por el detector consisten en una serie de picos en la intensidad de la
fluorescencia, como se muestra en el cromatograma anterior. La secuencia del ADN se lee
a partir de los picos en el cromatograma.

Replicación
La replicación es el proceso mediante el cual una molécula de ADN es duplicada y se
obtienen dos moléculas de ADN.
El ADN está formado por 2 cadenas de nucleótidos; cada una de las moléculas “hijas” que
se sintetizan a partir de una sola molécula “madre” conserva solamente una de las cadenas
originales de la molécula madre. La otra cadena se sintetiza utilizando como molde la
cadena original conservada.
Fred Sanger basó su método de secuenciación de ADN, también conocido como el “método
de Sanger”, en el proceso natural de replicación del ADN, en el cual las nuevas hebras de
ADN se sintetizan con una hebra existente como plantilla. Durante la replicación, se crean
muchas hebras de ADN marcadas radiactivamente y, mediante bases “terminadoras”, cada
hebra se puede replicar en distintas longitudes.
El proceso también implicaba una técnica denominada electroforesis, que todavía se utiliza
ampliamente en la actualidad. Esta técnica ayuda a separar fragmentos de ADN según el
tamaño. Los fragmentos de ADN se cargan en un gel y luego se hace pasar una corriente
eléctrica a través del gel. Esto tira del ADN a través del gel, y los fragmentos pequeños se
mueven más lejos a lo largo del gel que los fragmentos más grandes. Luego, se puede crear
una imagen radiográfica del gel, denominada autorradiografía, para visualizar la secuencia
de ADN.

Una de las moléculas claves en la replicación

del ADN es la enzima ADN polimerasa. Las ADN
polimerasas son responsables de la síntesis de
ADN: añaden nucleótidos uno por uno a la
cadena creciente de ADN, e incorporan solo
aquellos que sean complementarios al molde.
454 Pyrosequencing
La 454 Pyrosequencing (Pirosecuenciación de 454), fue la primera tecnología de NGS en el
mercado, esta funciona de la siguiente manera:
La pirosecuenciación está basada en el principio de sequenciación por síntesis, donde una
hebra complementaria es sintetizada en presencia de una enzima polimerasa. En vez de usar
dideoxinucleótidos para terminar la cadena de amplificación (como en la secuenciación de
Sanger), en la pirosecuenciación se detecta la liberación de pirofosfato cuando los
nucleótidos son añadidos a la cadena de ADN, se hace fluir los cuatro dNTPs diferentes de
forma secuencial hacia adentro y fuera de los pozos.
En la presencia de ATP sulfurilasa y adenosina, el pirofosfato es convertido en ATP. Esta
molécula de ATP es usada por la luciferasa, la cual produce luz que puede ser detectada con
una cámara. La intensidad relativa de la luz es proporcional a la cantidad de base agregada.
Como todos los procesos, tiene sus ventajas y desventajas:
 Puede realizar lecturas largas en un periodo corto de tiempo.
 Es costosa.
 No es muy sensible a la detección de homopolímeros.
La pirosecuenciación en relación con la replicación es que esta tecnología fue la que dio pie
a la investigación de la replicación.

Replicación in vitro
La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN
específico.
Esta técnica se basa en el uso de dos oligonucleótidos que luego de reconocer la secuencia
complementaria en la molécula de ADN, son alargados cíclicamente mediado por la acción
de la ADN Polimerasa. Cada ciclo de la técnica generalmente 20 ó 30 en total, implica la
desnaturalización del ADN, el apareamiento de los oligonucleóticos y la síntesis del nuevo
fragmento de ADN a partir del oligonucleótido, lo que resulta en un crecimiento
exponencial de millones de copias del fragmento seleccionado.

Fármacos que intervienen en el proceso de replicación

ACICLOVIR Aciclovir. Es un análogo núcleo-sódico de guanina acíclico, al que le falta un
3´- hidroxilo en la cadena lateral. El efecto antiviral se limita a los virus herpéticos. Su
mecanismo de acción lo ejerce inhibiendo la síntesis del ADN viral. Su selectividad de
actuación depende de la interacción de dos proteínas virales diferentes; la VHS
timidinacinasa y la ADN polimerasa
CIDOFOVIR El cidofovir es análogo nucleotídico-cistidínico efectivo contra los virus
herpéticos. El virus del papiloma humano (VPH), se considera del grupo Papilomavirus
familia Papovaviridae y tiene genoma ADN.
GANCICLOVIR – VALGANCICLOVIR El ganciclovir. Es un análogo
glucosídicoguanínico-acíclico semejante en su estructura al aciclovir. El ganciclovir tiene
acción inhibitoria contra los herpesvirus pero en especial contra el citomegalovirus humano
(beta) 5, miembro de la subfamilia Betaherpesvirus, de la familia Herpesviridae, que
comprende cuatro genotipos principales. El mecanismo de acción del ganciclovir es
inhibiendo la síntesis del ADN viral. El fármaco se distribuye ampliamente por el
organismo incluido el LCR, y está indicado en la retinitis por citomegalovirus y otras
infecciones graves (colitis, esofagitis, neumonitis, etc.) especialmente en pacientes
inmunosuprimidos y trasplantados de órganos sólidos y médula ósea.
FAMCICLOVIR - PENCICLOVIR El famciclovir es un profármaco esterdiacetílico del 6-
desoxipenciclovir, un análogo nucleodisídicoacídico de guanina. El fármaco no posee
actividad antiviral intrínseca. El medicamento se transforma rápidamente en penciclovir por
desacetilación de la cadena lateral y oxidación de un anillo purínico. El penciclovir inhibe
la síntesis del ADN viral.
IDOXIURIDINA La idoxiuridina (5-yodo-2´-desoxiadina) es un análogo timidinico yodado
que inhibe la replicación in vitro de algunos virus del grupo ADN que incluyen los
herpéticos (VHS, VVZ, CMV) y los poxvirus como el del molusco contagioso
FOSCARNET El foscarnet es el fosfonofarmato trisódico. Tiene acción sobre los virus
herpéticos (CMV), así como en el VIH. El foscarnet inhibe la síntesis del acido nucleico
viral al actuar contra la ADNpolimerasa de los virus herpéticos (CMV) o en la
retrotranscripción del VIH.
BIBLIOGRAFÍA

 A mutant Pfu DNA polymerase designed for advanced uracil-excision DNA

engineering. BioMedCentral Biotechnology, 10 (2010),
 Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its
structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Research,
32 (2004), pp. el03.
 Alberts, B., Johnson, A., et. al. (4ª Ed.). (2004). Biología molecular de la célula.
España: Ediciones Omega.
 Karp, G. (1998). Biología Celular y Molecular. México: McGraw-Hill
Interamericana.
 Ingenieria genetica vol.I. Preparacion, analisis, manipulacion y clonaje de
DNA. 2002. J. Perera, A. Tormo Garrido, J.L. Garcia. Ed. Síntesis.
 Mc Hutchinson J, Everson G, Gordon S, et al. Telaprevir with peginterferon and
ribavirina for chronic HCV genotype 1 infection. N Engl J Med. 2009;360:1827-
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