UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”

Asignatura: Bioinformática Tema: Pirosecuenciación y microarrays

Fecha: 16/11/2022
Docente: Dr. Yulia Cajas
Nombres: Nadia Celi, Víctor Costa, Frank Ortega, Bryan Salazar

Introducción
La pirosecuenciación se puede utilizar para detectar ADN y ARN de casi cualquier fuente y
tiene aplicaciones en la detección de resistencia bacteriana, el desarrollo de fármacos, la
epigenética y muchos otros campos.La pirosecuenciación se utiliza para revelar el código
genético de una sección de ADN. También es capaz de detectar polimorfismos de un solo
nucleótido, deleciones por inserción u otras variaciones de secuencia, además de poder
cuantificar la metilación del ADN y la frecuencia de alelos.

Por otro lado los microarreglo o los chips de adn más conocidos como microarrays es un chip
de adn que consta de una superficie aproximada de 4 centímetros cuadrados la cual puede
contener más de 10.000 espacios y sobre estos poros se depositan los muestras de adn
permitiendo estudiar simultáneamente el nivel de expresión de múltiples genes para llevar
esto a cabo se selecciona un cultivo celular de control y otro experimental a cada cultivo si la
isla del arn mensajero por separado luego ambas muestras de arn se transcribe a adn gracias
a la enzima transcriptasa inversa a la de el mono catenaria obtenido se le denomina adn
complementario.

Objetivos
● Conocer la importancia de los microarrays y la pirosecuenciación en el ámbito
biotecnológico.
● Analizar las características importantes referentes a los microarreglos de ADN y la
pirosecuenciación.
● Comprender los principios básicos para llevar a cabo el análisis genético como
pirosecuenciación y microarrays.
Desarrollo

Microarrays
Los microarrays de ADN es un instrumento que permite cumplir estudios genéticos varios
establecidos en la miniaturización de métodos biológicos. La primera aplicación de esta
tecnología fue para medir el nivel de expresión de miles de genes. El ejercicio de los
microarrays de expresión se basa en la capacidad de las moléculas complementarias de ADN
de hibridar entre sí. Mínimas cantidades de ADN, correspondientes a diversos genes cuya
expresión se desea medir, son depositadas en una base de cristal. Para ello se utilizan robots
de precisión que usan unas agujas especiales para obtener las moléculas de sus recipientes
y depositarlas en las coordenadas adecuadas. A estas muestras de ADN depositadas en el
microarray las denominaremos dianas. En un microarray típico, una superficie de 2 ×2 cm
puede contener más de 10.000 dianas en forma de pequeños puntos separados
adecuadamente. De las células que aspiramos calcular su expresión conseguiremos un tipo
de ARN que se convertirá en ADN complementario (ADNc) y se marcará con una molécula
fluorescente. A esta muestra marcada la denominaremos sonda y se enfrentará a las dianas
del microarray. Cada molécula de ADNc marcada de la sonda se moverá por difusión hacia
la diana que contenga su molécula complementaria para hibridarse con ella y quedar fijada
allí.Después de un tiempo para que la mayoría de las cadenas complementarias hibriden, el
Microarray se lava y se procede a hacer una medición relativa de la cantidad de ADN de la
sonda que ha quedado fijada en cada diana. (Moreno & Solé, 2004)

Pirosecuenciación

Fue descrita por Jonathan Rothberg y colaboradores de la empresa 454 Life Sciences en
2005. La secuenciación 454 se convirtió en la primera tecnología de la siguiente generación.
Permite determinar el orden de secuencia de ADN mediante luminiscencia.
Se basa en el principio de secuenciación por síntesis, en el que se detecta la incorporación
de nucleótidos del ADN por acción del ADN polimerasa.
Detecta la liberación de pirofosfato cuando los nucleótidos son incorporados y mediante
varias reacciones enzimáticas de la cadena se genera luz.

El ADN se desnaturaliza para obtener ADN monocatenario y se hibridará con un cebador. En

el tubo de reacción se encontrarán las enzimas luciferasa, ATP sulfurilasa, ADN polimerasa
y apirasa además de los sustratos luciferina y adenosín-5-fosfosulfato (APS).

- Pasos:

1. Preparación de la muestra de ADN: Primero se rompe la doble hélice de DNA en

fragmentos de doble cadena de aproximadamente 400 a 600 pares de bases. En el
siguiente paso se conectan los cebadores. Por último, los fragmentos de cadena doble
se separan en cadenas simples que serán las hebras moldes para la amplificación por
PCR en emulsión.

2. Carga de la muestra de ADN en microesferas: Los fragmentos de DNA de la

biblioteca se ponen sobre microesferas a través de un proceso de amplificación en
emulsión (emPCR). Esto hace que las señales producidas tras la amplificación sean
fácilmente detectables. En la fase inicial del proceso de amplificación, se ponen en
agua los fragmentos de la biblioteca de DNA, las perlas de captura y los reactivos de
la enzima, que se inyectan en pequeños recipientes cilíndricos que tienen un aceite
sintético. De este modo, se forman gotas de aceite en el agua, conteniendo cada una
un fragmento de DNA. La mezcla de agua tiene una enzima que produce la
amplificación de cada cadena sencilla de DNA presente en las gotas de aceite,
teniendo lugar la PCR de emulsión.

3. Secuenciación del ADN: En la secuenciación por síntesis de Roche, un fragmento

de DNA de una sola cadena se va complementando con los nucleótidos mediante una
enzima hasta formar un fragmento de doble cadena. Cuando estos nucleótidos se
incorporan en las cadenas de DNA, las enzimas convierten los productos químicos
generados durante la incorporación de nucleótidos en una señal químico-luminiscente
 que es registrada por una cámara. La intensidad de la señal es proporcional al número
de nucleótidos incorporados y varía con el número consecutivo de nucleótidos
complementarios que se analizan en el fragmento de DNA.
4. Análisis de datos: Las señales creadas en el proceso de secuenciación se analizan
por el software. Esta tecnología permite acelerar el tiempo, la calidad y la profundidad
de los resultados de secuenciación en cada procesamiento, permitiendo secuenciar
todo el genoma de los individuos. Los resultados de cada secuenciación son recogidos
y se comparan con los genomas de referencia para detectar regiones de coincidencia
y diferencias.

Aplicaciones

➢ Estudio y secuenciación del genoma completo.

➢ Secuenciación dirigida del gen 16S rRNA.
➢ Genómica funcional.
➢ Filogenia.
➢ Metagenómica.
➢ Farmacogenómica.

Ventajas y desventajas

Conclusiones:
Los análisis de expresión mediante microarrays de cDNA o de oligos ya son accesibles a la
comunidad científica. Los resultados, además, fascinan a los investigadores ya que son
bastante reproducibles y aportan una gran cantidad de información sobre la regulación de
la expresión génica en condiciones normales y patológicas. Como consecuencia del éxito
de estas herramientas, se pueden recoger en la literatura un gran número de experimentos
realizados con arrays de expresión y que agrupan, relacionan o describen los perfiles de
expresión de cientos o miles de genes.
La pirosecuenciación es una técnica de secuenciación del ADN de nueva generación, que
en síntesis modifica y mejora los estándares de la secuenciación del genoma, ya que esta
técnica es más rápida y menos costosa pero soporta cadenas de pocos pares de bases.
Bibliografía:
ADN/ARN MICROARRAYS. (n.d.). Bioted.Es. Retrieved November 19, 2022, from
https://www.bioted.es/protocolos/ADN-ARN-MICROARRAYS.pdf

Pérez-Pérez, G. I., Cynthia Portal-Celhay, D., Bosques-Padilla, F. J., & Elvira

Garza-González, D. (n.d.). Medigraphic.com. Retrieved November 19, 2022, from
https://www.medigraphic.com/pdfs/gastro/ge-2007/ge071d.pdf

Salcedo, J. R., Chávez González, L., Luis, J., Torres, S., Simón, Y., & León, G.
(n.d.). Microarreglos de ADN: fabricación, proceso y análisis. Gob.Mx. Retrieved
November 19, 2022, from
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/microarreglos.pdf

(N.d.). Upv.Es. Retrieved November 19, 2022, from

https://m.riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/8578/Memoria%20PFC%20Jose
%20Gonzalez.pdf?sequence=1&isAllowed=y