TEMA 8.

MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

1. En qué consiste la secuenciación de los ácidos nucleicos

Es el proceso de determinación de la secuencia de nucleótidos que componen una molécula de ADN o ARN y que se representa
por las iniciales de las bases nitrogenadas que lo portan.

- En el caso de una molécula monocatenaria se transcribe como una cadena de 3 letras que se inicia de 5´a 3´
- En el caso de una molécula bicatenaria se transcribe solo la secuencia 5´a 3´, puesto que la 3´ a 5´ es la complementaria
a la anterior
2. Explica y enumera los pasos del método químico de Maxam y Gilbert

Este método se basa en la modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas específicas, permite seucenciar
fragmentos cortos de ADN y requiere cantidades elevadas de la molécula de ADN purificada. Las fases son:

1- Marcaje de uno de los extremos de la molécula con el isótopo radiactivo fósforo 32 (más habitual marcar el
extremo 5´)
2- Reacciones de modificación química de las bases nitrogenadas. La muestra se divide en 4 alícuotas en cada una de
ellas se lleva a cabo una reacción química distinta
- Tubo 1: se modifican las guaninas por acción del dimetil sulfato
- Tubo 2: se modifican las purinas por acción del ácido fórmico (A+G)
- Tubo 3: se modifican las pirimidinas por acción de la hidracina (C+T)
- Tubo 4: se modifican las citosinas con hidracina + sal (NaCl 2M)

Finalizada la reacción a los tubos se les añade piperidina que rompe la cadena a nivel de las bases modificadas

3- Electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución (10-20%): en condiciones desnaturalizantes separa por
tamaño los fragmentos presentes en cada tubo.
4- Autorradiografía del gel: lectura de las bandas correspondientes a cada fragmento obtenido en cada una de las
cuatro calles del gel
5- Análisis de esta autorradiografía: permite descifrar la secuencia según el orden de las bandas, se inicia por el
extremo inferior que sería el 5´
3. Explica el método enzimático de terminación en cadena

Son métodos enzimáticos basados en reacciones de polimerización de cadenas complementarias a las que se quiere secuenciar. A
la mezcla de reacción se añaden didexosinucleótidos trifosfato, cuando los dNTPs se incorporan a una cadena de ADN en
crecimiento actúan como terminadores de cadena y detienen la síntesis

4. Explica y enumera los pasos del método de Sanger

Se emplea para secuenciar fragmentos cortos de ADN monocatenarios:

1- Reacciones de polimerización: la muestra se divide en 4 alícuotas para realizar las reacciones de polimerización (1
por cada base nitrogenada), cada tubo contiene:
- Hebra molde
- Cebador marcado con P32 en 5´ (complementario del 3´de la hebra molde)
- ADN polimerasa
- 4 dNTPs
- Uno de los ddNTPs que marca la especificidad de cada reacción en una concetración mucho menor a
los dNTPs

Durante la reacción de polimerización, la polimerasa extiende el cebador sintetizando una cadena de ADN
complementaria a la hebra molde, hasta que por azar incorpora un ddNTP lo que detiene la elongación de la cadena.
Todos los fragmentos están marcados radioactivamente por el marcaje del cebador

2- Electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución en condiciones desnaturalizantes: las nuevas cadenas
sintetizadas a partir del molde se separan por desnaturalización (calor), los fragementos marcados se separan por
tamaño con una resolución de un solo nucleótido. Los productos de las 4 reacciones se corren en paralelo, en
calles adyacentes del mismo gel
3- Autorradiografía en gel: proporciona un patrón de bandas oscuras, correspondiente a los distintos fragmentos
producidos en las reacciones de polimerización
4- Análisis de la autorradiografía: en cada calle el ultimo nucleótido el que está en posición 3´del fragmento que
representa cada banda es el ddNTP que se añadió en el tubo correspondiente, en consecuencia se puede
determinar la secuencia completa según el orden escalonado de las bandas en las cuatro calles del gel realizando
la lectura de abajo arriba de la autorradiografía
 5. Variaciones del método del Sanger

Como alternativa al marcaje del cebador se pueden utilizar:

- dNTPs marcado o
- ddNTPs marcados.
Además, el marcaje puede ser:
- Radiactivo con P32 o
- Fluorescente
La utilización de marcadores fluorescentes simplifica y acorta el método, ya que se elimina el paso de la autorradiografía y para
analizarlo el gel se ilumina con gel ultravioleta y se adquiere una fotografía

6. En qué se basa la secuenciación automática de 1ª generación

Se basa en el método enzimático de terminación de cadena de Sanger y en el uso de cuatro fluoróforos como marcadores
En ella se utilizan los secuenciadores automáticos de primera generación que se componen de:
- Un sistema de electroforesis
- Un sistema de detección de las bandas fluorescentes
- Un software
Las reacciones de polimerización se realizan fuera del secuenciador
7. Tipos de PCR de secuenciación en función de donde se produzca el marcaje fluorescente

Secuenciación por terminación fluorescente

Se realiza una única PCR (un solo tubo):
 Se marcan los cuatro ddNTP cada uno con un fluoróforo distinto (el cebador se utiliza sin marcar).
 Se añaden al tubo los cuatro ddNTP marcados en la proporción adecuada respecto a los dNTP sin marcar.
Al finalizar la PCR, el tubo contiene una mezcla de todos los fragmentos posibles marcados con cuatro fluoróforos distintos,
dependiendo del ddNTP situado en el extremo 3". Este producto de la PCR se carga directamente en el secuenciador.
Este es el método más utilizado actualmente para secuenciar cualquier molécula de ADN.
Secuenciación con cebador fluorescente
Se realizan cuatro PCR en tubos separados:

 En todas ellas se utiliza el mismo cebador, pero marcado con un fluoróforo distinto en cada tubo.
 En cada tubo se añade a la mezcla de reacción un ddNTP distinto en la proporción adecuada, de manera que se asocia
un color fluorescente distinto a cada ddNTP.
Al terminar las PCR, cada tubo contiene todos los fragmentos posibles que terminan en un mismo nucleótido, marcados con el
mismo fluoróforo en el extremo 5' del cebador , los productos de las cuatro PCR se mezclan en un único tubo y se cargan en el
secuenciador.
Este método es muy útil para secuenciar bibliotecas de ADN, puesto que permite secuenciar todos los clones con un único cebador
marcado con cuatro fluoróforos distintos.
Este cebador tiene que ser complementario de una región del vector adyacente al sitio de inserción del ADN extraño.

8. Fases automatizadas en secuenciación

1) Electroforesis

 Electroforesis en gel, utilizan gel plano de poliacrilamida ultrafinos de menos de 200 micrómetros de grosor,
en los que se pueden cargar hasta 96 muestras distintas, la velocidad de lectura depende del grosor del gel y
de las condiciones de electroforesis siendo normal una velocidad de 200 bases por h y por muestra
 Electroforesis capilar, utilizaremos capilares de sílice fundida con un diámetro entre 10 y 200 micrómetros
que contienen un polímero como soporte para la electroforesis, las de mayor capacidad tienen 96 capilares
una velocidad de lectura de 500b/h y posibilidad de varias recargas automáticas
2) Detección

El sistema de detección se sitúa en la porción del gel o capilar y consiste en un láser que excita el fluoróforo y un sistema de
detección con varios canales para poder detectar distintos fluoróforos.
Cuando un fragmento de ADN marcado alcanza la ventana de lectura del sistema de detección el láser excita el fluoróforo que
emite fluorescencia de una longitud de onda determinada la cual es captada por el detector y reflejada como un pico de
fluorescencia de un color determinado en una gráfica denomina electroferograma.
El color del pico de fluorescencia se asocia con una base nitrogenada concreta. De esta manera, el electroferograma se traduce en
una secuencia de ADN
3) Interpretación de los resultados

La interpretación de los resultados va a depender del cebador utilizado en la PCR de secuenciación:

 Si se utiliza cebador o primer F secuencia 5´→3´de la molécula bicatenaria que estamos secuenciando y por lo tanto con
la secuencia que presenta esa molécula
 Si utilizamos un cebador o primer R la secuencia obtenida en el secuenciador es la complementaria y en sentido inverso
de la secuencia 3´→5´que representa la molécula que se secuencia
 9. Secuenciación a gran escala y estrategias que se utilizan

La secuenciación a gran escala permite secuenciar fragmentos mucho mayores a las 1000 bases e incluso genomas completos
Las dos estrategias que se utilizan:
 Paseo cromosómico, el genoma que se va a secuenciar se digiere parcialmente con enzima de restricción y se clona en
bacterias para obtener una biblioteca genómica. Una vez secuenciado un clon se utiliza un extremo de su secuencia
para fabricar una sonda que localice un clon un inserto se solape con el anterior, hasta secuenciar la biblioteca entera.
 Método shotgun el genoma que se va a secuenciar se fragmenta aleatoriamente en cortos fragmentos que se clonan en
bacterias para obtener la correspondiente biblioteca genómica. En una segunda fase se secuencian todos los clones de
manera independiente para finalmente ensamblarlos mediante un software que ordena los fragmentos en base con
solapamientos
10. Secuenciación masiva y sus fases

Es una plataforma automática para la secuenciación de genomas completos individuales basadas en diferentes tecnologías que
permiten obtener resultados en poco tiempo y bajo coste

Automatizan todo el proceso, que consta de tres fases:

1. Preparación del ADN que se va a secuenciar

2. Secuenciación propiamente dicha
3. Análisis de los datos
11. Fases de preparación del ADN molde

También es común a todas las tecnologías NGS:

1- Fragmentación al azar del genoma por métodos físicos (sonicación, nebulización, etc.) o enzimáticos
Captura por hibridación en base sólida utilizando microarrays, tienen las sondas que van a ser complementarias.
PCR múltiple, con cebadores específicos de las regiones que queremos secuenciar
2- Unión a los extremos de cada fragmento de dos adaptadores universales
De esta manera obtenemos una biblioteca de fragmentos con extremos universales que puede ser amplificada en su
totalidad con un solo juego de cebadores complementarios de los adaptadores.
12. ¿Qué tecnologías inmovilizan el ADN molde para su posterior secuenciación?
 ADN molde de molécula única
 Amplificación clonal del AND molde
13. Explica la tecnología del ADN molde de molécula única

Selección de los fragmentos de la biblioteca que tienen el tamaño adecuado para la posterior reacción de secuenciación
(adecuados entre 200-500pb)
1- Unir covalentemente uno de los cebadores universales sobre la superficie de un soporte sólido. Los fragmentos
de la biblioteca se desnaturalizan y se hibridan con los cebadores unidos al soporte, de manera que quedan
anclados a la superficie y dispuestos de tal modo que un ADN polimerasa pueda iniciar una reacción de
secuenciación extendido el cebador.
2- Unir covalentemente los fragmentos de ADN molde de la biblioteca a la superficie del soporte sólido.
Posteriormente, los fragmentos unidos a la superficie se hibridan con un cebador universal para poder inicial la
reacción de secuenciación
14. Métodos de la amplificación clonal del ADN molde
 PCR en emulsión (emPCR)
 PCR en fase solida o PCR puente
15. Explica la PCR en emulsión (emPCR)

Se utilizan microesferas recubiertas de uno de los cebadores universales

1. Los fragmentos de la biblioteca se desnaturalizan y son capturados sobre la superficie de las esferas mediante
hibridación cebador/adaptador. Este proceso de captura se realiza con la misma proporción de microesferas/ADN
así que cada esfera captura un fragmento de ADN molde
2. Las esferas con ADN molde se introducen en un Eppendorf con una mezcla de PCR que contienen un segundo
cebador universal (fase acuosa), y este conjunto se cubre con aceite
3. A continuación, se emulsionan ambas fases de manera que se obtiene multitud de microreatores formados por
pequeñas gotas acuosas de mezcla de PCR que contienen una esfera con un único fragmento de ADN molde
rodeados de aceite
En estos microreactores se lleva a cabo una PCR convencional asi al final de la PCR cada esfera está cubierta de
múltiples fragmentos de ADN molde idénticos anclados a su superficie
4. Una vez finalizado el proceso se rompe la emulsión y las esferas que pueden ser hasta millones de esferas se fijan
sobre una superficie o de depositan en pocillos de una placa picotiter
 16. Explica la PCR en fase sólida o PCR puente

Se realiza sobre una superficie a la que se fijan ambos cebadores con alta densidad

1. Los fragmentos de la biblioteca se desnaturalizan y las cadenas individuales se anclan también a la superficie en una
proporción que garantice distanciamiento entre ellas, cada cadena de ADN molde queda rodeada de múltiples cebadores
universales
2. Este soporte, el conjunto se inunda con una mezcla de PCR sin primer y se inicia el proceso de amplificación y en cada ciclo de
PCR
3- En la fase de hibridación el adaptador del extremo libre de cada fragmento hibrida con el cebador universal
complementario más próximo, formando un puente sobre la superficie.
4- En la fase de extensión se sintetiza una cadena complementaria.
5- En la fase de desnaturalización del ciclo siguiente ambas cadenas se separaron permaneciendo ancladas a la
superficie y muy próximas físicamente

El resultado final es la obtención de clones de cada fragmento agrupados en un espacio inferior a un 1μm de diámetro

El resultado se puede generar 1020 clasters por cm2 de superficie

17. Explica la terminación reversible clínica

Se basa en la utilización de dNTPs marcados con un fluoroforo y bloqueados para impedir que se puedan unir más nucleótidos por
lo que actúan como terminadores de cadena
Cada dNTP se marca con fluoroforo distinto, la unión con el fluoroforo y con el agente bloqueante son reversibles
Este método se suele usar con soportes de ADN molde de molécula única o con clusters obtenidos por PCR puente
La reacción se inicia uniendo uno de los cebadores universales al extremo libre de los fragmentos de ADN molde inmovilizados. A
continuación, se desarrollan ciclos de tres fases:
1. Incorporación de un terminador reversible marcado el soporte se inunda a una solución de polimerasa y los 4 dNTP
marcados y bloqueados, la polimerasa se une al hibrido ADN molde/cebador e incorpora el primer nucleótido de la
nueva cadena
2. Lectura de la fluorescencia del soporte se lavan los dNTPs incorporados se excita el soporte con un láser y se registra la
fluorescencia emitida en cada punto del soporte que coincide con la posición ocupada por cada cluster y que será del
color correspondiente al color del fluoroforo incorporado. Tras cada lectura se obtiene una matriz de puntos de los
cuatro colores posibles
3. Eliminación del fluoróforo y del agente bloqueante mediante una reacción química. De esta manera, en el siguiente
ciclo se puede incorporar un nuevo nucleótido a la cadena

18. Explica la secuenciación ion Torrent

La tecnología de ion torrent detecta microvariaciones de pH producidas en una reacción de polimerización

El ADN molde que se va a secuenciar, unido a un cebador y una ADN polimerasa se inmoviliza en un micropocillo que contiene un
sensor de pH. Mediante un flujo continuo, se va inundando los pocillos secuencialmente cada dNTP con ciclos de lavado alternos
para eliminar los nucleótidos no incorporados

Cuando un dNTP se incorpora a una cadena en crecimiento se libera un ion hidrogeno que produce una microvariación en el pH de
la solución. Esta variación es detectada por el sensor incluidos en el pocillo y registrada por el software del secuenciador. Si se
incorporan varios nucleótidos en un único ciclo porque le ADN molde tiene varias bases iguales consecutivas, la variación de pH
será proporcionalmente mayor.

Con base en la variación de pH ocurridas en cada pocillo, el software del secuenciador ensambla las secuencias de cada fragmento
para obtener la secuencia génica completa.

19. En qué consiste la secuenciación de 3ª generación y nombra los tipos

Los secuenciadores automáticos de tercera generación son plataforma automáticas moléculas únicas de ADN sin necesidad de
amplificación clonar previa como ocurre con los de segunda generación.

1- Secuenciación por nanoporos

2- Secuenciación SMRT (secuenciación de manera única a tiempo real)
20. Explica la secuenciación por nanoporos

Es un método de secuencia en tiempo real sin reacción de polimerización y sin marcajes, basado en biosensores
Cada biosensor consta de una membrana bicapa resistente eléctricamente y sometida a cierto voltaje atravesada por un nanoporo
proteico con un microelectrodo
Por el nano poro fluye de manera continua una corriente iónica que genera una corriente eléctrica basal detectada por el
electrodo. Cualquier molécula que atraviese el nanoporo provoca una alteración en la corriente basal cuya magnitud es
característica de la molécula en cuestión lo que permite identificarla
Cada base produce una señal característica por lo que la secuenciación se produce simultáneamente al paso de la molécula por el
nanoporo
Es un método muy rápido y la tecnología se puede miniaturizar, abriendo las puertas a los secuenciadores portátiles y de bolsillo

21. Explica la secuenciación SMRT (secuenciación de manera única a tiempo real)

La secuenciación SMRT se basa en la inmovilización de una polimerasa unida a una molécula de ADNm del fondo de una nano
cavidad diseñada para el confinamiento de nanofotones
En la síntesis de una nueva cadena de ADN por la polimerasa utilizando nucleótidos marcados con diferentes fluorocromos

En esta nano tecnología el sistema de iluminación y lectura de fluorescencia solo afecta a la zona donde esta inmovilizada la
enzima asi cada vez que incorpora un nucleótido el sistema detecta un pico de fluorescencia de color correspondiente al
nucleótido incorporado produciendo la secuencia a tiempo real

22. Métodos de secuenciación del ARN

Los metodos enzimáticos directos de secuenciación de ARN. Son métodos de terminación en cadena al igual que el método de
Sanger para secuenciar ADN. En la secuenciación del ARN:

- Se utiliza una mezcla de dNTP y ddNTP en la proporción adecuada en una reacción de transcripción inversa catalizada
por una retrotranscriptasa
- Las moléculas de ARN él es molde y los fragmentos de nueva síntesis son ADNc
- El marcaje de los fragmentos puede ser radioactivo P 32 o fluorescente y se pueden marcar los cebadores o ddNTP
- Igual mente se pueden realizar 4 reacciones de transcripción inversa una con cada dNTP o una única reacción con los 4
ddNTP marcados con fluoróforo distintos
- Finalmente, los fragmentos generados se separan por electroforesis y se analizan los geles mediante autorradiografia o
UV, según el marcaje
- La secuencia leída en el gel será correspondiente al ADNc complementario al ARN que se estudia y en sentido opuesto.
Al transformar la secuencia de ADNc a ARN hay que tener en cuenta que el complementario de A es U

Los métodos indirectos de secuenciación de ARN. Se basan en la obtención previa de un ADNc mediante transcripción inversa.
Este ADNc es secuenciado por los métodos anteriores y las secuencias obtenidas se traduce ARN teniendo en cuenta la
complementariedad de bases.

23. Explica la secuenciación de ARN molde secuencia única

Una vez obtenida una biblioteca de fragmento de tamaño adecuado de extremos universales se inmovilizan los distintos
fragmentos obre una superficie sólida. Los fragmentos de la biblioteca se desnaturalizan y se hibridan con los cebadores que
hemos unido a soporte

1- Unir covalentemente uno de los cebadores universales sobre la superficie de un soporte solido
2- Unir covalentemente los fragmentos molde al soporte sólido y posteriormente los hibridamos con un cebador
universal
En ambos casos la secuenciación se efectúa mediante el método de terminación reversible cíclica directamente sobre los
fragmentos inmovilizados