EC - CASO 2: MISTERIO RESUELTO

Métodos de análisis para ADN:

1. MANIPULACIÓN ENZIMÁTICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
- Enzimas asociadas a la replicación, transcripción y degradación del ADN
- Técnicas de manipulación de genes y organismos (clonación, transgénesis o CRISPR)
2. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (capacidad de formar una doble hebra)
- Hibridación en soportes sólidos (Blots)
- Hibridación masiva (microarrays)
3. SÍNTESIS Y AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
- Amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
- Secuenciación de ADN (Secuenciación Sanger y Secuenciación Masiva)

PCR: (Reacción en Cadena de Polimerasa),la cual es una técnica que se utiliza para la producción o
amplificación de un segmento de ADN ,pasando de millones a miles de millones de este segmento,lo
que permite estudiarla de mejor manera en el laboratorio.

¿Para qué sirve?: sirve en la investigación bioquímica y médica,se prepara fragmentos de ADN para
la clonación en plásmidos bacterianos o virus para usarlos como vectores (que sirve para terapias
génicas).
También se usa para: Diagnosticar enfermedades hereditarias,identificar patógenos,pruebas de
paternidad, análisis forenses,además,detectan el ADN o ARN de un patógeno o células anormales en
una muestra (como las células cancerígenas que podrían pasar desapercibidas en otras
pruebas),etc.

¿Cómo funciona una PCR?

Primeramente hay que tomar una muestra de sangre, tejido, saliva o moco. Después la ponemos en
una máquina y añadimos una polimerasa a la muestra (esta enzima hace que se produzcan copias
de la muestra). Este proceso se repite varias veces hasta tener millones de copias. De esta forma si
el paciente tiene un virus o agente patógeno, la máquina mostrará el mismo.

¿La prueba de PCR tiene algún riesgo?

Según un estudio publicado en JAMA Network el test de PCR tiene un muy bajo índice de
complicaciones graves, pero si se produce una mala praxis puede llevar a complicaciones que
pongan la vida del paciente en peligro.
Algunas afecciones que puede producir la mala praxis son hemorragias nasales, rotura del tabique
nasal y hasta fuga de líquido cefalorraquídeo.

Los pasos de la PCR son:

1. La desnaturalización, en donde se calienta el ADN a una temperatura de 94 °C, lo cual hace que
se separen las hebras.
2. La hidratación, donde se disminuye la temperatura a unos 50-60 °C permitiendo la unión de las
hebras.
3. Y en la extensión, se vuelve a calentar a una temperatura de 72 °C permitiendo la replicación del
ADN.

Tipos de PCR:
- PCR anidada: Variante de la PCR convencional donde hay dos rondas de amplificación con
diferentes primers (o cebadores) en cada una, para incrementar la sensibilidad y la
especificidad de la detección. Realizamos una reacción con los cebadores externos para
amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el segmento diana. Después, este
 producto de amplificación se utiliza como molde de un segundo PCR con los cebadores
internos para amplificar la región específica.
- PCR in situ: Marcamos una hebra sencilla de ARN o ADN denominada hebra sonda y se
permite que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN presente en
una muestra de tejido o de cromosomas. La sonda está marcada con una sustancia
trazadora química o radiactiva por lo que su unión puede ser visualizada.
- PCR múltiple: Se busca amplificar simultáneamente en un único tubo distintas secuencias
específicas, lo cual necesariamente implica que los reactivos mezclados y el programa
utilizado sean suficientes y adecuados para permitir la detección de cada diana y no inhibir la
de las demás. Es necesario tomar en cuenta:
-A la hora del diseño de primers buscar que no interaccionen entre sí, es decir, que no forman
oligómeros
-Que tengan temperaturas de anillamiento similares.
-Que cada pareja de primers amplifique una única secuencia diana.
-Que generen replicones de tamaño suficientemente diferente como para poder ser separados y
diferenciados tras la amplificación.

- RT-PCR: Son dos procesos: transcripción inversa a partir de ARN que sintetiza ADN
complementario (ADNc), con el cual se realiza posteriormente el PCR. De esta forma se
pueden amplificar genes que estaban expresados en el momento del estudio.

Los materiales/elementos que se utilizan para realizar una prueba de PCR son:
1. Buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
2. TAQ polimerasa que cataliza la incorporación cebador-dependiente de nucleótidos en ADN.
3. Primers/ cebadores que se unen a la región específica de ADN al bajar la temperatura.
4. Agua
5. Molde de ADN para copiar
6. Mg2+ya que la enzima Taq polimerasa requiere que el cofactor Mg2 + inicie la reacción catalítica y
funcione eficientemente.

Una sonda es un fragmento de ADN (también puede ser de ARN pero no es habitual utilizarlo) de
tamaño pequeño (entre 100 y 1000 pares de bases) usado en biología molecular como herramienta
para detectar la presencia de ADN (o ARN si se utilizó un fragmento de este tipo) de igual secuencia
complementaria. Este fragmento va a estar marcado de alguna manera para poder visualizarlo.
En su uso, la sonda se une a la secuencia diana monocatenaria mediante un mecanismo de
hibridación que forma una estructura bicatenaria donde una de las hebras pertenece a la secuencia
diana y la otra hebra pertenece a la sonda. Esta unión, se establece porque tanto la hebra diana
como la sonda tienen secuencias complementarias.
La sonda para ser visualizada es marcada con un marcador radiactivo o químico y a su vez, de
manera similar, se utilizan anticuerpos marcados para sondear una muestra para detectar la
presencia de una proteína específica.

Antes que nada, la técnica PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) fue desarrollada por Kary
Mullis en 1988.
Es básicamente amplificar un segmento de ADN que sea de nuestro interés para poder analizarlo.
Una vez que obtenemos la secuencia que deseamos la podemos analizar de dos maneras:
INDIRECTA: Mediante electroforesis.
DIRECTA: Mediante la secuenciación. Esta técnica consiste en sintetizar, de forma secuencial, una
hebra de ADN complementaria a una hebra de cadena simple (que se utiliza como molde), en
presencia de ADN polimerasa y los cuatro dNTP (desoxinucleótidos trifosfatados). Como ya hemos
analizado , para que la ADN polimerasa actúe, es necesario un extremo 3' OH libre, por lo tanto si se
agrega un hidrógeno al carbono 3' (ddNTP'S) la reacción no se puede dar debido a que se bloquea la
síntesis. Si además yo marco estos ddNTP'S, con un color y luego realizó una PCR, lo que ocurre es
que se va a ir elongando la cadena, hasta que la polimerasa encuentre este sitio, una vez que lo
encuentra se detiene el ciclo, y esa cadena no va a ser sintetizada.
Si seguimos agregando esos ddNTP'S, lo que se va a obtener son la cantidad de cadenas que se
interrumpieron. Si coloreamos cada base con un color específico y hacemos correr la muestra con un
gel y luego lo visualizamos con un láser, podemos observar cuatro colores diferentes (obviamente se
disponen al azar).

¿En qué consiste la electroforesis?

La electroforesis es una técnica de laboratorio que consiste en la separación de fragmentos de ADN,
ARN o proteínas en un gel o en otra matriz de naturaleza porosa, en función de su tamaño y carga
eléctrica.
Esta técnica es utilizada en una gran variedad de aplicaciones, como en medicina forense para
determinar la identidad de personas que, por ejemplo, puedan haber participado en un delito,
mediante la vinculación de su patrón de ADN - su patrón de electroforesis - a uno que esté en una
base de datos.

¿Cómo se hace una electroforesis?

1. Se prepara la solución de agarosa y se calienta en el microondas.
2. Se coloca en un molde y esperaremos a que se enfríe. Dicho molde le dará la forma de un
ladrillo fino. Ese ladrillo tiene en uno de sus lados unas ranuras a las que llamamos pocillos,
allí será donde cargaremos las muestras más adelante.
3. Colocaremos ese ladrillito en la cuba, allí habrá un buffer que permitirá que corra la
electricidad. Esos pocillos quedarán posicionados en el lado negativo, para que el ADN
pueda migrar hacia el lado positivo.
4. Cargamos los pocillos con las muestras y aplicamos electricidad. Esperamos un tiempo
prudente para que migre ese ADN.
5. Para visualizar los resultados se usa como tinción un agente que se va a intercalar en la
doble hebra de ADN, que fluoresce cuando lo iluminamos con la luz ultravioleta.

- Cuando las bandas quedan a la misma altura, lo que ocurre es que los fragmentos son del
mismo tamaño por lo que migran y avanzan al mismo tiempo.
- En el caso contrario , cuando quedan a distinta altura, lo que ocurre es que los fragmentos
son de distinto tamaño.
- A su vez , los fragmentos más pequeños avanzan con mayor facilidad a través de las
moléculas de agarosa, y los fragmentos más grandes lo hacen con mayor dificultad.

El ADN no brilla por sí solo bajo la luz UV, sino que para la visualización del mismo, el gel es teñido
con un compuesto que se utiliza como colorante fluorescente llamado Bromuro de Etidio. El bromuro
de etidio (BrEt) es un agente intercalante que se intercala entre las bases nitrogenadas de los ácidos
nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida. Este absorbe luz ultravioleta y emite una luz
anaranjada mediante la cual podemos ver la posición y la cantidad relativa de ADN tras la
electroforesis.

La electroforesis en gel de agarosa es uno de los medios más utilizados, sobretodo cuando se
requiere separar fragmentos de ADN sin un gran poder de resolución, ya que no permiten separar
fragmentos de menos de 50 pares de bases, al contrario que los geles de poliacrilamida, los cuales
tienen una mayor resolución, pudiendo separar fragmentos que únicamente difieren en un par de
bases; entonces el medio utilizado dependerá de las necesidades el investigador.
Los geles de agarosa si bien no pueden separar fragmentos de menos de 50 pb, tienen un rango
mayor al de poliacrilamida; los geles de agarosa tienen un rango de 50 pb a 40 kb, mientras que los
de poliacrilamida tienen un rango de 1 pb a 600 pb. El rango de separación de la agarosa es perfecto
para analizar el producto de digestiones con enzimas de restricción y reacciones PCR, también
pudiendo combinarse con otras técnicas.

Las enzimas de restricción son enzimas que cortan el ADN cuando reconocen secuencias cortas
específicas (palíndromos), produciendo fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Fueron
identificadas en baterías, donde cumplen una función defensiva frente a la entrada en la célula de
ADN extraño. Las bacterias poseen una amplia variedad de enzimas de restricción que cortan el ADN
en más de un centenar de sitios de reconocimiento, cada uno de los cuales consiste en una
secuencia específica de entre cuatro y ocho pares de bases. Dado que las enzimas de restricción
digieren el ADN a nivel de secuencias especias pueden ser usadas para cortar una molécula de ADN
en sitios únicos.Para visualizar los productos de digestión enzimática se puede realizar una
electroforesis.

Consiste en realizar una electroforesis con los fragmentos de ADN utilizando como soporte un gel de
agarosa en el que se ordenan los fragmentos según el tamaño.
En una electroforesis en gel, se colocan los fragmentos de ADN próximos al cátodo y debido a que
las moléculas de ADN son negativas, comienzan a emigrar al ánodo quedando los fragmentos más
grandes cerca del cátodo y los más chicos cerca del ánodo. Utilizando una escala que indique según
la posición el tamaño del fragmento se puede saber qué tamaño tiene cada fragmento.
Las enzimas de restricción son enzimas utilizadas para fragmentar el ADN en secuencias conocidas
como secuencias palindrómicas, que leídas en sentido 5´ 3´ en ambas cadenas son iguales. La
enzima de restricción forma un dímero que reconoce la secuencia palindrómica y corta al ADN
originando un corte ramo un corte escalar.

Southern Blot: Esta técnica se utiliza para detectar secuencias específicas de ADN. Para llevarla a
cabo se recoge una muestra de ADN que, luego de someterla a distintos procesos, es colocada en
una solución que contiene una sonda, la cual se asociará por hibridación a la muestra. La sonda está
marcada con una sustancia radioactiva, fluorescente o química que permite visualizar el fragmento
que se quiere analizar en específico.
La técnica de Southern Blot consta de los siguientes pasos:
1. Extraer el ADN.
2. Aplicarle al ADN una enzima de restricción, lo que permite cortar segmentos específicos de ADN.
3. Separar los fragmentos de ADN según tamaño mediante electroforesis.
4. Los fragmentos de ADN se transfieren a una membrana sólida que luego es expuesta a una sonda
de ADN marcada con alguna sustancia que permite visualizar el material.
El objetivo es lograr transferir el material presente en el gel de la electroforesis a una membrana
sólida (mencionada en el paso 4) para que el ADN se pueda visualizar. Adjunto una imagen en donde
lo pueden ver mejor.

Hibridación: es el proceso por el cual dos moléculas complementarias de ADN y/o ARN (de una sola
hebra) se unen y forman una molécula de doble cadena de ácido nucleico, siendo este un proceso
importante en diferentes técnicas de investigación y de laboratorio. Nos permite estudiar el grado de
relación genética entre dos ácidos nucleicos.