UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE GUANAJUATO

“Métodos de Secuenciación y Línea de tiempo”

Alumno

Heriberto Arroyo Medina

Asignatura

Bioinformática
Docente

Emiliano Villordo Pineda

Carrera

Ingeniería en Biotecnología
Grupo

IBI07C

19 de Septiembre del 2023

Resumen
La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro componentes
básicos químicos, llamados "bases", que forman la molécula de ADN. La secuencia
les informa a los científicos la clase de información genética que se transporta en
un segmento específico de ADN.
Desde la finalización del Proyecto del Genoma Humano, las mejoras tecnológicas y
la automatización han aumentado la velocidad y reducido los costos al punto en que
genes individuales pueden secuenciarse de manera rutinaria, y en algunos
laboratorios se pueden secuenciar más de 100 billones de bases al año, y un
genoma completo puede secuenciarse por tan sólo unos cuantos miles de dólares
(Nhgri, 2019b).
Desarrollo
Secuenciación Maxam-Gilbert
El método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del
fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas
en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de
las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T).
De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado
radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos
posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando
los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado
de la otra. Para visualizar los fragmentos generados en cada reacción, se hace una
autoradiografía del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas
oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir
de las cuales se puede inferir la secuencia (Método químico de Maxam y Gilbert,
s.f.)

El método de secuenciación de Sanger

El método de secuenciación de didesoxinucleótidos es una forma de secuenciar una
secuencia de ADN relativamente sencilla. Se trata de una técnica desarrollada por
el bioquímico británico Frederick Sanger a mediados del siglo XX.
El método de secuenciación de Sanger se basa en la acción de las ADN
polimerasas. Estas enzimas tan importantes para nuestras células son capaces de
unirse a una cadena de ADN a la que se le haya unido un fragmento corto de ADN
complementario (cebador) previamente e ir añadiendo nucleótidos. De este modo,
a partir de una cadena simple, podemos obtener una doble cadena. Este proceso
que ocurre de forma natural en nuestras células es el que ocurre también en la
secuenciación de Sanger, salvo por un ingenioso detalle: la presencia de
didesoxinucleótidos. Cuando una polimerasa inserta un didesoxinucleótido, la
síntesis de la nueva cadena se detiene (Garrigues, 2023).

1. Amplificación del ADN

Lo primero que hay que hacer para secuenciar una molécula por el método de
Sanger es amplificar el ADN que queremos estudiar. Esto servirá para obtener
muchas copias del fragmento que queremos analizar.
Actualmente lo que se hace es amplificar el ADN mediante una PCR.
2. Preparación de la muestra
El segundo paso es añadir el ADN amplificado a las 4 reacciones independientes
que se han de preparar, cada una de ellas con:
Una ADN polimerasa
Un primer específico
Uno de los cuatro tipos de nucleótidos (A, C, T y G) marcado radiactivamente
El resto de nucleótidos no marcados
En cada una de las disoluciones añadiremos una pequeña cantidad de un solo tipo
de didesoxinucleótido.
3. Acción de la ADN polimerasa
El siguiente paso será propiciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN a partir de
las dobles cadenas problema, amplificadas en pasos anteriores. Para ello, se
aumenta la temperatura de las reacciones, lo que provoca la separación de las dos
cadenas del ADN del que queremos conocer la secuencia. Luego dejaremos enfriar
para favorecer la unión de los primers o cebadores.
Una vez unido el cebador, comenzará la reacción de la ADN polimerasa, que irá
añadiendo nucleótidos marcados, hasta que inserte un didesoxinucleótido, se
detenga la síntesis y la nueva cadena se suelte. Entonces, la ADN polimerasa
empieza de nuevo. De este modo, en cada una de las reacciones obtendremos
fragmentos de diferentes tamaños, acabados en el didesoxinucleótido que hayamos
empleado en ellas (Garrigues, 2023).
4. Electroforesis
Tras la actuación de la ADN polimerasa, el resultado de cada una de las cuatro
reacciones se somete a una electroforesis. Para los que no conozcáis esta técnica,
una electroforesis consiste en colocar una mezcla de moléculas con diferente
tamaño y/o carga eléctrica en un “filtro” o soporte poroso, que puede ser un papel,
en un gel o en acetato de celulosa. Este filtro se introduce en una solución y se
somete a un campo eléctrico. De este modo, las moléculas se moverán por bandas
más o menos rápido por el filtro según su carga y tamaño. Por ejemplo, el ADN, que
tiene carga negativa, migrará hacia el polo positivo (Garrigues, 2023).
 Secuenciación de Nueva Generación
La NGS, también llamada "secuenciación de alto rendimiento", es un conjunto de
técnicas de secuenciación genética que mejoran el proceso de secuenciación
original de Sanger. Estos modos de secuenciación de ADN y ARN utilizan
procesamiento paralelo masivo para trabajar de manera más rápida y rentable que
el método Sanger.
¿Por qué se desarrollan las NGS?
La finalización del primer borrador del Proyecto Genoma Humano a principios de
siglo marcó un antes y un después en el contexto de la Genómica: se consiguió
secuenciar (parcialmente) un genoma humano de referencia. El problema es que,
pese a sus esfuerzos por acelerar el proceso, los investigadores tardaron muchos
años en conseguirlo. Por eso, la meta en ese momento pasó de “secuenciar el
genoma humano” a “secuenciar el genoma humano de una forma más eficiente,
barata y rápida” (Garrigues, 2023).
Y entonces, en 2005, nació un nuevo tipo de tecnología de secuenciación: la NGS.
Esto supuso una revolución gigantesca en el ámbito de la investigación en
Genómica, tanto básica como la más aplicada. Todo ello, gracias a la capacidad de
generar una mayor cantidad de lecturas del genoma que permitieran obtener un
resultado más sólido, a precios más asequibles y en un menor período de tiempo
(Garrigues, 2023).
Secuenciación por síntesis o polimerización
Se trata de sistemas de NGS basados en la acción de una ADN polimerasa sobre
una cadena de ADN que actúa como molde. Entre estas tecnologías, encontramos
los secuenciadores semiconductores, los sistemas de terminación cíclica reversible
y la secuenciación SMRT.
Las características propias de este tipo de estrategias de NGS hacen que no puedan
utilizarse para secuenciar secuencias grandes, como genomas completos. Sin
embargo, se trata de técnicas relativamente baratas y rápidas, así como bastante
precisas, por lo que se suelen utilizar en laboratorios de diagnóstico para secuenciar
paneles de genes pequeños.
Secuenciación por Ion Conductor (Ion Torrent Sequencing)
Se trata de una estrategia que se basa en la detección de las modificaciones en el
pH que se producen en la síntesis de ADN. Para ello, se van incorporando
nucleótidos a una cadena de ADN, provocando que se libere un protón (H+) en la
reacción y, por tanto, que se vea modificado el pH. Para poder diferenciar cuál de
los cuatro tipos de nucleótidos se ha introducido en cada posición de la secuencia,
se repiten varios ciclos, cada uno de ellos, con la adición de un único tipo de
nucleótido.
Secuenciación por terminación cíclica reversible
Esta metodología se basa en la utilización de nucleótidos marcados con fluoróforos
en una reacción de síntesis de ADN. Cada vez que uno de estos nucleótidos se
incorpora a la cadena, el sistema toma una captura y registra de qué tipo de
nucleótido se trata. Una vez tomada la captura, se eliminan los fluoróforos de los
nucleótidos que se han incorporado y se continúa la síntesis de la cadena con
nuevos nucleótidos marcados.

Secuenciación en tiempo real

Esta estrategia de secuenciación desarrollada por Pacific Biosciences se basa en
la utilización de nucleótidos marcados que se incorporan a una nueva cadena de
ADN en un proceso de síntesis. Sin embargo, en la secuenciación SMRT se utiliza
un soporte especial, unos pequeños pocillos denominados “pocillos ZMW”.
En la secuenciación SMRT, las ADN polimerasas se anclan a la base de los pocillos
ZMW. El ADN a secuenciar se divide en varios fragmentos y se unen sus extremos,
lo que resulta en moléculas de una sola cadena de ADN “circular”. Luego, se añade
uno de estos fragmentos a cada pocillo. En cada pocillo, se van incorporando
nucleótidos marcados y el sistema va detectando la fluorescencia y obteniendo la
secuencia de cada fragmento (Garrigues, 2023).
Conclusión
Actualmente gracias a las mejoras de secuenciación se pueden dar a conocer
fragmentos más grandes de ADN, además de ser técnicas más rápidas como
eficientes y mucho más baratas, lo que hace que su estudio se vea amplificado. Y
con base a esto se pueden investigar algunas modificaciones posibles y su
comparación con distintos fragmentos, así poder entender más como funciona la
herencia, las enfermedades y sus posibles curas.
La mayor aplicación de la secuenciación del ADN es el estudio de enfermedades,
como sus causas genéticas, los riesgos y su detención.
También el estudio de las secuencias ayuda al conocimiento de la evolución tanto
del ser humano como de las demás especies de seres vivos.
Bibliografía
• Nhgri. (2019). Secuenciación del
ADN. Genome.gov. https://www.genome.gov/es/about-genomics/fact-
sheets/Secuenciacion-del-ADN

• (s.f.). Obtenido de https://genotipia.com/sanger/

• Garrigues, F. (01 de June de 2023). Obtenido de https://genotipia.com/ngs-
secuenciacion/
• Garrigues, F. (23 de January de 2023). Secuenciador de Sanger. Obtenido
de https://genotipia.com/sanger/
• Método químico de Maxam y Gilbert. (s.f.). Obtenido de
http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/maxam.htm#:~:text=Un%20fragmento
%20de%20ADN%20se,una%20de%20las%20cuatro%20bases.